劉 磊，任明永，成榮杰，朱 莉

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院婦產(chǎn)科，黑龍江 哈爾濱 150001；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科，黑龍江 哈爾濱 150007)

LRP1B在宮頸鱗癌中的表達與意義

劉 磊1，任明永2，成榮杰1，朱 莉1

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院婦產(chǎn)科，黑龍江 哈爾濱 150001；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科，黑龍江 哈爾濱 150007)

目的 探討低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1B (LRP1B)在宮頸鱗癌中的表達與意義。方法 選用原位雜交的檢測方法，用LRP1B寡核苷酸探針對20例正常的宮頸組織和40例宮頸鱗癌組織標本中LRP1B mRNA表達進行測定，用HPV16/18探針對40例宮頸鱗癌標本組織進行檢測。結(jié)果 在40例宮頸鱗癌標本中，有22例呈現(xiàn)LRP1BmRNA低表達，在20例正常宮頸組織中，僅有3例呈現(xiàn)低表達，癌癥組的陰性表達率明顯低于正常組織，且兩組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.28，P<0.05)。宮頸鱗癌組中，LRP1B陰性者的HPV16/18陽性率明顯高于LRP1B陽性者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.56，P<0.05)。在40例宮頸鱗癌標本中，LRP1BmRNA的表達與患者的年齡、臨床分期、腫瘤分化程度均無關(guān)(χ2值分別為0.22、4.65、0.90，均P<0.05)；但在發(fā)生浸潤至漿膜層和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標本中呈現(xiàn)低表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為4.85、6.15，均P<0.05)。結(jié)論 LRP1B在宮頸鱗癌組織中呈低表達與HPV16/18感染很可能作為協(xié)同因子參與宮頸癌的發(fā)生，并且LRP1B與宮頸鱗癌發(fā)病和轉(zhuǎn)移有較密切的關(guān)系。

宮頸鱗癌；LRP1B；原位雜交；HPV16/18

宮頸癌是常見的女性惡性腫瘤之一，盡管宮頸癌篩查已經(jīng)廣泛開展，但其發(fā)病率和死亡率在女性惡性腫瘤中仍然居高不下。根據(jù)世界范圍內(nèi)的統(tǒng)計，每年大約有50萬新發(fā)的宮頸癌病例，而且其發(fā)病人數(shù)逐年升高，年齡趨于年輕化。宮頸癌新發(fā)病例占所有癌癥新發(fā)病例的5%，其中80%的病例來自于發(fā)展中國家。因此，該病的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)機制的研究具有重要意義。低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1B(low density lipoprotein receptor-related protein 1B，LRP1B)是新進發(fā)現(xiàn)的一個候選抑癌基因，該蛋白相應(yīng)的編碼基因最早在2000年由Liu等[1]利用對非小細胞肺癌細胞系染色體做純合缺失分析時發(fā)現(xiàn)。Li等[2]研究顯示它在人類正常和腫瘤細胞中廣泛的表達，并調(diào)控腫瘤細胞黏附、增殖、分化和血管生成。大量的研究顯示在人類多種惡性腫瘤，如食管鱗癌[3]、口腔鱗癌[4]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[5]、急性白血病[6]等，均存在LRP1B基因異常轉(zhuǎn)錄和表達缺失，發(fā)生的確切作用機制與其mRNA純合子的缺失和富含雙核苷酸“CG”的區(qū)域(CpG island，CpG島)甲基化增強有關(guān)系，也有研究表明LRP1B是高級別尿路上皮癌中的一個候選抑癌基因[7]。因為宮頸癌中主要類型為宮頸鱗癌，并且有研究先后在非小細胞肺癌、食管鱗癌、口腔鱗癌等鱗狀細胞癌中發(fā)現(xiàn)LRP1B的表達異常，所以本研究就采用原位雜交技術(shù)觀察并檢測LRP1B在宮頸鱗癌和宮頸正常組織中表達的相關(guān)性,旨在探討LRP1B表達與宮頸鱗癌及人乳頭瘤狀病毒(Human papilloma virus，HPV)感染、患者年齡、臨床分期、分化程度、浸潤及淋巴轉(zhuǎn)移間可能存在的關(guān)系和意義。

1材料及方法

1.1標本及試劑

1.1.1標本來源和處理

本實驗實驗組標本均選自黑龍江省哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院病理科，選取2014年至2016年在本院經(jīng)過手術(shù)證實為原發(fā)性宮頸鱗癌的手術(shù)標本臘塊40例。宮頸癌標本中按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO)制定的分期(2009)來分，原位癌4例，Ⅰ期21例，Ⅱ期15例。其中按組織分化程度分為：高分化12例，中分化17例，低分化7例。其中浸潤至漿膜的10例，未浸潤至漿膜的有30例。發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的有11例，未發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的有29例。實驗組術(shù)前均未接受放、化療。患者年齡最小30歲，最大年齡72歲。

1.1.2主要試劑

LRP1B試劑盒、HPV16/18探針及3,3二氨基聯(lián)苯胺(3,3-Diaminobenzidine，DAB)顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。實驗步驟嚴格按照LRP1B試劑盒說明進行。

1.2方法

1.2.1石蠟切片

標本離體后，及時予以固定。固定液為4%多聚甲醛。常規(guī)脫水、浸蠟，包埋后作4μm連續(xù)切片。切片撈片后，簡單烘干。

1.2.2原位雜交

標本泡片烤干后，進行脫蠟和脫二甲苯。經(jīng)過3%過氧化氫溫室處理30分鐘，胃蛋白酶消化后進行預(yù)雜交和雜交。滴加封閉液后滴加生物素化鼠抗地高辛，滴加生物素化過氧化物酶后加DAB顯色。鏡下控制反應(yīng)時間。蘇木素復(fù)染，酒精脫水，二甲苯透明后烘干封片。采用多相寡核苷酸探針和高度敏感標記技術(shù)，用LRP1B探針及HPV探針分別經(jīng)過地高辛標記，進行原位雜交實驗。

1.3結(jié)果判讀

檢出棕黃色顆粒視為陽性細胞。主要分布在細胞胞漿中。本實驗根據(jù)棕色反應(yīng)的陽性強度及細胞數(shù)量計算免疫反應(yīng)評分(immunoreactive score，IRS)，免疫反應(yīng)評分(IRS)=染色強度(staining intensity，SI)×陽性標本的百分率(percentage of positive specimens，PP)。在高倍鏡下(×400)隨機對每張切片選取5個視野，并且每個視野選取100個腫瘤細胞，將表達最強的部分按著色程度分為：基本未著色，染色與背景相似者為0分；著色淺，略高于背景者為1分；中度著色，明顯高于背景者為2分；強染，著色深棕色者為3分。陽性細胞數(shù)<10%為0分，10%～50%為1分，51%～75%為2分，>75%為3分。每一個標本分別計算IRS，0～3分為低表達或缺失，記做(-)；≥4分為正常表達，記做(+)。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

運用SPSS 16.0軟件，應(yīng)用χ2檢驗方法，檢驗標準α=0.05，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 LRP1B基因在宮頸鱗癌及正常宮頸組織中的表達

鏡下示LRP1B主要定位于細胞漿內(nèi)，見圖1和圖2。40例宮頸鱗癌組織中，LRP1BmRNA陽性表達有18例(45.00%)，陰性表達有22例(55.00%)。在20例正常宮頸對照組中，陽性表達有17例(85.00%)，陰性表達有3例(15.00%)。實驗組和對照組之間表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2 宮頸鱗癌組織中HPV16/18 E6與LRP1B蛋白表達之間的關(guān)系

在28例HPV16/18 E6蛋白表達陽性者中有16例LRP1B蛋白表達為陰性，而在12例HPV16/18 E6蛋白表達陰性者中僅有2例LRP1B蛋白表達為陰性，二者有明顯相關(guān)性(χ2=5.56，P<0.05)，見表2。

圖1 LRP1B在正常宮頸組織中的表達(×400)；

圖2 LRP1B在宮頸鱗癌組織中的表達(×400)

表1 LRP1B在宮頸鱗癌和正常宮頸組織中的表達情況(n)

Table 1 Expressions of LRP1B in cervical squamous cell carcinoma and normal cervix(n)

表2 宮頸鱗癌組織中LRP1B與HPV16/18蛋白表達的關(guān)系(n)

Table 2 Correlation between expression of LRP1B and HPV16/18 in cervical squamous cell carcinoma(n)

2.3 LRP1B的表達與宮頸鱗癌臨床特征之間的關(guān)系

LRP1B在實驗組標本中的表達與患者的年齡、不同臨床分期及組織分化程度上均未顯示出統(tǒng)計學(xué)意義。但在腫瘤浸潤程度方面，浸潤至漿膜的LRP1B的表達(陰性表達率為80.00%)，與未浸潤至漿膜的LRP1B表達(陰性表達率為33.33%)兩者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在淋巴轉(zhuǎn)移方面，發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的宮頸鱗狀細胞癌LRP1B的表達(陰性表達率為87.50%)，與未發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的之間的表達(陰性表達率為31.25%)兩者之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 宮頸鱗癌中LRP1B的表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系(n)

Table 3 Correlation between clinical pathological parameters and expression of LRP1B in cervical squamous cell carcinoma(n)

3討論

3.1宮頸癌與HPV感染的關(guān)系

宮頸癌是以鱗狀細胞癌為主的女性生殖道惡性腫瘤。近年來發(fā)病趨勢逐年上升，發(fā)展中國家發(fā)病人數(shù)較多，嚴重危害婦女身心健康。多年來人們一直在研究宮頸癌的發(fā)病機制，高危型HPV已經(jīng)是公認的宮頸癌和癌前病變發(fā)病的重要危險因素，有研究表明，高危型HPV與宮頸鱗狀細胞癌之間關(guān)系的密切程度高于吸煙與肺癌之間的聯(lián)系。在一些調(diào)差中，其相關(guān)性甚至高達近100%。近20余年，人們積累了大量的關(guān)于HPV和宮頸腫瘤的研究，結(jié)果表明HPV是引起宮頸癌的必須條件，但不是充分條件。杜亞麗等[8]回顧性分析2014年1月至2014年12月份無錫市共2 670例婦科HPV基因型檢驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)HPV16型是當(dāng)?shù)貎?yōu)勢感染型別，HPV35，39，45在多重感染中占優(yōu)勢。方婧等[9]研究404例有效樣本，發(fā)現(xiàn)高危型HPV核酸檢測試劑盒-care HPV在檢測出HPV感染上具有很好的靈敏度和特異性，且用時短，有可能成為醫(yī)療資源貧乏地區(qū)宮頸癌篩查的主要方法。

3.2 LRP1B與HPV的關(guān)系

在研究LRP1B與HPV的關(guān)系時，國外有文獻報道，高危型HPV16和HPV18均可以與2號染色體上的LRP1B相應(yīng)結(jié)合位點相互結(jié)合。也有文獻顯示，2號染色體上也有HPV45與LRP1B的結(jié)合位點。這就為HPV與LRP1B相互協(xié)同作用而導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生并促進宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展提出依據(jù)。

任何惡性腫瘤都是環(huán)境與基因的共同作用，其中抑癌基因的失活起了至關(guān)重要的作用，自2000年LRP1B基因首次從非小細胞肺癌中分離出之日起，該基因就與潛在的抑癌功能聯(lián)系在一起。本研究探索LRP1B基因在宮頸鱗癌及正常宮頸組織中的表達，及其與HPV16/18感染和宮頸鱗癌的病理特征之間的關(guān)系，為研究宮頸癌的病因及疾病進展機制提供一個新的思路。

3.3 LRP1B參與腫瘤發(fā)生發(fā)展可能存在

有研究顯示，LRP1B通過與尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase-type plasminogen activator，uPA)上的位點相結(jié)合，可以負性調(diào)節(jié)uPA系統(tǒng)。而uPA系統(tǒng)可以改變細胞基底膜的活動性，使細胞外基質(zhì)降解，在腫瘤細胞的遷徙、浸潤和轉(zhuǎn)移過程中起到促進的作用。盛修貴等[10]采用ELISA法檢測42例子宮頸癌病人和10例良性子宮腫瘤病人的血漿和組織中uPA含量，得出的結(jié)論是檢測宮頸癌病人uPA含量可能對其侵犯范圍、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、預(yù)后等有一定的參考價值。

此外，uPA系統(tǒng)還可以打破色素上皮源因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的平衡。色素上皮源因子是一種僅對新生的異常血管起抑制作用的因子，而對正常血管無殺傷作用。血管內(nèi)皮生長因子則是一種促血管生成因子，與腫瘤血管的生成有密切關(guān)系。腫瘤的發(fā)生與兩種因子表達失衡及新血管生成有密切關(guān)系，目前已經(jīng)有研究表明兩種因子在肝癌、腎癌、喉癌[11]中均存在PEDF或VEGF表達的異常。所以LRP1B是否通過負性調(diào)節(jié)uPA系統(tǒng)進而影響PEDF和VEGF的平衡來參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，仍然有待進一步的研究。

我們的研究顯示：40例宮頸鱗癌標本中LRP1B的含量明顯低于正常宮頸組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。證實了宮頸鱗癌的發(fā)生與LRP1B表達異常密切相關(guān)。LRP1B陰性者的HPV16/18E6陽性率明顯高于LRP1B陽性者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明LRP1B與HPV可能共同作用參與宮頸鱗癌的發(fā)生。同時，本資料顯示，宮頸鱗癌中LRP1B的異常表達與宮頸鱗癌患者的年齡、臨床分期和組織分化無關(guān)(P>0.05)，但與癌癥的浸潤程度、淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，證實了宮頸鱗癌的轉(zhuǎn)移與LRP1B異常表達密切相關(guān)。

總之，宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的過程，LRP1B可能同HPV感染一起參與宮頸鱗癌的發(fā)生，并且該基因的失活可能促進疾病的進展，研究該基因希望可以進一步揭開宮頸癌的發(fā)病及疾病進展原因，為將來宮頸癌的預(yù)防、篩查和治療提供一個重要的新思路。

[1]Liu C X,Musco S,Lisitsina N M,etal.LRP-DIT, a putative endocytic receptor gene, is frequently inactivated in non-small cell lung cancer cell lines[J].Cancer Res,2000,60(7):1961-1967.

[2]Li Y,Lu W,Bu G.Striking differences of LDL receptor-related protein 1B expression in mouse and human[J].Biochem Biophys Res Commun,2005,333(3):868-873.

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[專業(yè)責(zé)任編輯：張忠明]

Expression and significance of low density lipoprotein receptor-related protein 1B in cervical squamous cell carcinoma

LIU Lei1, REN Ming-yong2, CHENG Rong-jie1, ZHU Li1

(1.DepartmentofGynecologyandObstetrics,FourthAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,HeilongjiangHarbin150001,China;2.DepartmentofPediatrics,FirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,HeilongjiangHarbin150007,China)

Objective To identify the expression and significance of low density lipoprotein receptor-related protein 1B (LRP1B) in cervical squamous cell carcinoma. Methods Hybridization in situ was used. Expression of LRP1B mRNA in 20 normal cervical tissues and 40 cervical squamous cell carcinoma specimens was detected with application of LRP1B oligonucleotide probe. HPV16/18 probe was used to detect 40 cervical squamous cell carcinoma specimens. Results In cervical squamous cell carcinoma specimens of 40 cases, 22 cases showed low expression of LRP1B, but in 20 cases of normal cervical tissues, only 3 patients showed low expression. Negative expression rate in cancer tissues was significantly lower than that in normal ones and difference between them was statistically significant (χ2=5.28,P<0.05). In cervical squamous cell carcinoma group, HPV16/18 positive rate in LRP1B negative patients was significantly higher than that in LRP1B positive patients, and difference was statistically significant (χ2=5.56,P<0.05). In cervical squamous cell carcinoma specimens of 40 cases, expression of LRP1B mRNA was not associated with patient’s age, clinical stage and degree of tumor differentiation (χ2value was 0.22, 4.65 and 0.90, respectively, allP<0.05), but specimens with serous membrane infiltration and lymph node metastasis showed low expression and difference was significant (χ2value was 4.85 and 6.15, respectively, bothP<0.05). Conclusion Low expression of LRP1B in cervical squamous cell carcinoma tissues shows that LRP1B may be a new tumor suppressor gene. Changes of LRP1B gene and HPV16/18 infection may participate in occurrence of cervical cancer as co-factors. And LRP1B may have a close relationship with occurrence and metastasis of cervical squamous cell carcinoma.

cervical squamous cell carcinoma; low density lipoprotein receptor-related protein 1B (LRP1B); hybridization in situ; HPV16/18

2017-01-06

2014省黑龍江教育廳立項資助項目(編號：12541267)

劉 磊(1984-)，女，住院醫(yī)師，碩士，主要從事婦產(chǎn)科臨床工作。

朱 莉，主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.05.003

R711.7

A

1673-5293(2017)05-0495-03