姚協(xié)豐，徐錦華，李蘋芳，張曼，任潤生，劉廣，羊杏平

（江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點試驗室·江蘇省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所南京210014）

菜瓜蔓枯病苗期抗性鑒定方法比較

姚協(xié)豐，徐錦華，李蘋芳，張曼，任潤生，劉廣，羊杏平

（江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點試驗室·江蘇省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所南京210014）

以不同菜瓜為試驗材料，采用室內(nèi)苗期活體接種和離體葉片接種2種方法，研究42份菜瓜材料對蔓枯病的抗性，分析離體葉片菌絲塊接種的菌絲侵染擴展半徑（lesion radius）與苗期活體接種發(fā)病情況相關性，比較不同菜瓜對蔓枯病抗性的差異，篩選優(yōu)質(zhì)的抗蔓枯病菜瓜資源。結果表明，離體葉片菌絲塊接種的菌絲侵染擴展半徑與苗期活體接種平均病情級別數(shù)的相關性達到0.906（P≤0.05），同時篩選出10份對蔓枯病具有中等抗性的菜瓜材料。

菜瓜；苗期；瓜類蔓枯病；抗性鑒定

瓜類蔓枯?。╣ummy stem blight）是由亞隔孢殼屬瓜類黑腐球殼菌[Didymella bryoniae(Auersw.) Rehm]引起的真菌性病害，是影響瓜類生產(chǎn)的重要病害之一。該菌寄主范圍廣，可以侵染甜瓜、西瓜、黃瓜、南瓜等多種作物，侵染植株的葉片、莖蔓和果實等部位，主要危害莖部皮層組織，致使整個植株枯萎而死亡[1-2]。目前保護地栽培的高溫、高濕條件利于蔓枯病發(fā)病，品種單一加上常年連作并伴隨病菌量加大、農(nóng)業(yè)生態(tài)條件惡化，導致瓜類蔓枯病成為瓜類生產(chǎn)中發(fā)生最普遍、危害最嚴重病害之一[3]，一般病田減產(chǎn)20%～30%，嚴重可達80%[4]。

國內(nèi)對瓜類蔓枯病的研究主要集中在甜瓜、黃瓜、西瓜等作物[4-7]，對菜瓜蔓枯病目前還未有系統(tǒng)研究。菜瓜（Cucumis melo L.var.conomon Thunberg）為葫蘆科甜瓜屬甜瓜種越瓜變種，原產(chǎn)東亞（中國江浙一帶）和南亞（印度）。中國民間又稱為梢瓜，印度也稱為酸瓜（acidulus）。各地地方品種有：‘花皮梢瓜’（浙江杭州、海寧）、‘長度白瓜’（廣東）、‘青皮菜瓜’（合肥）、‘八棱瓜’（河北青縣）、‘酥菜瓜’（河南駐馬店）[8]。

目前針對瓜類蔓枯病的防治以化學藥劑為主，長期使用化學農(nóng)藥極易使病原菌產(chǎn)生抗性，導致環(huán)境污染并威脅人類健康，而一些高毒農(nóng)藥的限制使用，使瓜類蔓枯病防治成為生產(chǎn)上的防治重點和難點[9]，因此防治瓜類蔓枯病最根本、最環(huán)保高效的方法就是選育品質(zhì)優(yōu)良的抗病品種[2,10]。開展對現(xiàn)有種質(zhì)資源抗性鑒定是抗病育種的關鍵，但是目前國內(nèi)尚未有系統(tǒng)開展菜瓜抗蔓枯病的研究，菜瓜種質(zhì)資源抗蔓枯病能力尚不十分清楚。為此，研究菜瓜種質(zhì)資源對蔓枯病抗性的鑒定評價體系、篩選抗性強的菜瓜種質(zhì)資源，對于克服或減輕蔓枯病對菜瓜的危害，以及利用抗性材料培育抗蔓枯病的菜瓜品種，具有重要的理論意義和實踐價值。筆者通過對菜瓜種質(zhì)資源進行苗期蔓枯病的接種鑒定，篩選出了優(yōu)良的抗性資源，以期為菜瓜蔓枯病抗性遺傳改良及新品種選育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料

供試42份菜瓜材料由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所提供，材料名稱和來源見表1。菜瓜材料分為自交系和雜交1代。其中自交系20份，雜交1 代22份。接種所用蔓枯病菌[Didymella bryoniae (Auersw.)Rehm]菌株在田間病株收集、分離，并作致病性鑒定，確定蔓枯病菌株DBJSJY2作為強致病力和穩(wěn)定性好的抗病性接種鑒定菌株。育苗基質(zhì)為江蘇省農(nóng)業(yè)科學院配制的育苗土，滅菌處理后備用。

表1供試菜瓜材料名稱與來源

1.2蔓枯病菌培養(yǎng)及產(chǎn)孢

參照Li等[11]方法誘導培養(yǎng)蔓枯病菌產(chǎn)分生孢子：選取DBJSJY2的純性培養(yǎng)物，接種試驗前將DBJSJY2接種于PDA固體培養(yǎng)基（200 g土豆，20 g葡萄糖，15 g瓊脂，補足1 L水)，26～28℃培養(yǎng)1周。選取新鮮無傷口的黃瓜，經(jīng)過滅菌蒸餾水沖洗干凈后，用75%酒精擦拭表面，晾干后，用直徑0.7 cm的滅菌打孔器切取菌塊，滅菌刀片在黃瓜表面上輕微打去表皮，挑取培養(yǎng)菌株的菌絲塊置于上面，放入培養(yǎng)箱，28℃培養(yǎng)，5～7 d后產(chǎn)生分生孢子，用刀片刮取，研磨，然后用4層紗布過濾，在顯微鏡下用血小球計數(shù)板計數(shù)，用于接種的菌液濃度配制成5×105個·mL-1的孢子懸浮液。

1.3室內(nèi)苗期抗性鑒定

接種方法參照Zhang等[12]的方法，在菜瓜苗期植株展開第3～第4片真葉時，用微型噴霧器將配制好的5×105個·mL-1孢子懸浮液（加1%Tween 80）噴到植株葉片開始滴水為止。接種后用塑料拱棚保濕，保持相對濕度90%以上，3 d后揭開小拱棚，10 d時調(diào)查統(tǒng)計病情。葉片侵染分級標準參考如下，0級：無可見侵染；1級：老葉上邊緣壞死或斑點＜10 mm，新葉無?。?級：老葉上邊緣壞死或斑點＜10 mm，新葉邊緣壞死；3級：所有葉均有感染，葉壞死面積＜25%；4級：25%＜葉壞死面積≤50%；5級：葉壞死面積＞50%。平均病情級別數(shù)計算公式：RI=Σ（級值×株數(shù)）/總株數(shù)[10,12]。根據(jù)平均病情級別數(shù)（RI）確定蔓枯病抗性級別，高抗（HR）：RI＜1.0，抗（R）：1.0≤RI＜2.0，中抗（MR）：2.0≤RI＜3.0，感?。⊿）：3.0≤RI＜4.0，高感（HS）：RI≥4.0。

1.4離體葉片菌絲塊接種

選取DBJSJY2的純性培養(yǎng)物，接種試驗前將DBJSJY2接種于PDA固體培養(yǎng)基，26～28℃培養(yǎng)1周。離體葉片菌絲塊接種方法參照Wang等[13]方法稍做修改：取菜瓜植株展開的第3～第4片幼葉，用滅菌蒸餾水沖洗干凈，晾干后置于滅菌的鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中。將0.5 cm的滅菌打孔器制作的菌絲塊置于菜瓜葉片上，每個葉片接2個菌絲塊，然后把培養(yǎng)皿放在光照培養(yǎng)箱中保存，培養(yǎng)條件為：溫度（26±1）℃，光照周期16 h光照/8 h黑暗，相對濕度約90%。每個處理3片葉，3次重復，5 d后測量菌絲塊周圍的菌絲侵染擴展半徑（lesion radius），根據(jù)擴展半徑分析菜瓜材料對病原菌的敏感性。比較離體葉片菌絲塊接種的菌絲侵染擴展半徑與活體接種鑒定后平均病情級別數(shù)的相關性。

1.5數(shù)據(jù)分析

采用SAS 8.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析和皮爾遜(Pearson)相關性分析,以P≤0.05為差異統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1苗期活體接種鑒定不同菜瓜材料的抗病性

對42份菜瓜材料采用噴霧接種方法鑒定了它們對蔓枯病菌的抗性反應。供試42份材料接種3～5 d后均開始發(fā)病，葉部出現(xiàn)蔓枯病早期典型癥狀，呈現(xiàn)褪綠病斑，病斑逐漸擴大并擴展為“V”型病斑，材料間發(fā)病程度不同，總體沒有發(fā)現(xiàn)免疫或高抗材料，未接種對照均未發(fā)病。由表2、表3可知，10份菜瓜材料發(fā)病相對較輕，表現(xiàn)為中抗，其平均病情級別數(shù)在2～3，占總數(shù)的23.8%，其中自交系材料6份，雜交材料4份；表現(xiàn)感病的材料有10份，平均病情級別數(shù)在3.6～3.9，占總數(shù)23.8%；其余材料均表現(xiàn)為高感，平均病情級別數(shù)均超過4，表現(xiàn)對蔓枯病較為敏感。

表2不同菜瓜材料苗期對蔓枯病抗性鑒定結果

表342份菜瓜材料對蔓枯病的抗性評價

2.2離體葉片菌絲塊接種與苗期活體接種鑒定比較分析

對42份菜瓜材料采用離體葉片菌絲塊接種方法鑒定其對蔓枯病菌的抗性反應。供試42份材料接種菌絲塊后，周圍均有菌絲侵染擴展，材料間菌絲侵染擴展范圍大小差異顯著，擴展半徑從1.70 cm 到4.02 cm不等。其中10份苗期活體接種鑒定表現(xiàn)為中等抗性的越瓜材料侵染擴展半徑均小于3 cm，其他32份感病和高感菜瓜材料擴展半徑均大于3 cm（表2）。另外，離體葉片菌絲塊接種菌絲侵染擴展半徑與活體接種鑒定后平均病情級別數(shù)的相關性程度較高，擴展半徑與平均病情級別數(shù)的相關系數(shù)達到0.906。

3 討論

本研究結果顯示，所有菜瓜材料地方品種均不同程度地感染蔓枯病，未發(fā)現(xiàn)對蔓枯病免疫的種質(zhì)資源。10份材料對蔓枯病有一定抗性，根據(jù)平均病情級別數(shù)進行鑒定，僅達到中抗水平。一般情況下，由于人工接種方法創(chuàng)造的發(fā)病條件極為適宜，苗期人工接種發(fā)病程度往往會高于田間自然發(fā)病過程[14]，因此苗期人工接種可能會使試材更容易發(fā)病，導致高抗材料抗性被低估。所以，可通過室內(nèi)鑒定方法快速大批量初步篩選抗性資源，但要更精確地進行抗性鑒定還需田間抗性與苗期人工接種結合。由初步篩選結果可見，現(xiàn)有的部分菜瓜種質(zhì)資源蘊藏著有價值的抗性基因資源，對其鑒定可為今后蔓枯病抗病基因鑒定利用、抗病性狀分子關聯(lián)分析、抗蔓枯病菜瓜品種的選育和遺傳改良奠定基礎。

離體葉片接種法，可以提高接種篩選的數(shù)量，簡單易行、周期短、效率高、環(huán)境因素可控、可重復性高，不影響篩選材料進一步生長[15]，所以目前離體葉片接種法被廣泛應用于品種的蔓枯病抗性鑒定中。但是現(xiàn)有的離體葉片接種方法基本采用與苗期活體接種一致的孢子噴霧接種和病情統(tǒng)計方法，這使得離體葉片接種的發(fā)病情況往往比苗期活體接種的嚴重，病情級別也偏重[16-17]。所以在離體葉片接種方法中選擇更為合適的接種體（孢子、菌絲、菌塊等）和病情分級方法值得研究。筆者嘗試進行了離體葉片菌絲塊接種與苗期活體接種鑒定初步比較，應用菌絲侵染擴展半徑作為供試菜瓜材料對蔓枯病敏感性指標，發(fā)現(xiàn)離體葉片菌絲塊接種菌絲侵染擴展半徑一定程度上與苗期活體接種結果相對應，呈現(xiàn)顯著正相關，離體葉片接種病斑擴展與苗期活體接種平均病情級別數(shù)的相關性達到0.906（P≤0.05）。張永兵等[16]采用離體和活體苗期接種2種鑒定方法鑒定甜瓜蔓枯病時，發(fā)現(xiàn)2種鑒定方法的發(fā)病率和病情指數(shù)都呈正相關，并且病情指數(shù)相關性較高，筆者采用離體葉片接種方法和苗期活體接種方法相關性結果與此結果一致。另外，離體葉片菌絲塊接種及菌絲侵染擴展半徑統(tǒng)計方法已有應用于豆類褐斑病品種抗性鑒定的報道[13,18]。所以，下一步可以研究細化菌絲侵染擴展半徑系數(shù)分級，以此為篩選鑒定菜瓜材料對抗蔓枯病抗性的依據(jù)。但是，本試驗中離體葉片菌絲塊接種方法鑒定品種對蔓枯病抗性的結果只是初步的，菌絲塊侵染擴展半徑反應的品種對蔓枯病敏感性與抗病性是否與傳統(tǒng)抗病鑒定方法的抗性級別一一對應，以及是否真實反映田間抗性還有待進一步驗證。

[1]KEINATH A P，F(xiàn)ARNHAM M，ZITTER T．Morphological，pathological，and genetic differentiation of Didymella bryoniae and Phoma spp．isolated from cucurbits[J]．Phytopathology，1995，85（3）：364-369.

[2]WEHNER T C，SHETTY N V．Screening the cucumber germplasm collection for resistance to gummy stem blight in North Carolina field tests[J]．HortScience，2000，32（6）：1132-1140.

[3]胡鳳云，莫賤友，韋繼光，等．西瓜甜瓜蔓枯病防治研究進展[J].中國瓜菜，2011，24（6）：40-44.

[4]李英．瓜類蔓枯病菌的生物學特性和黃瓜抗病資源的篩選[D]．南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2007.

[5]馬華，程春燕，徐建，等．黃瓜-酸黃瓜漸滲系的驗證及其抗蔓枯病篩選[J]．南京農(nóng)業(yè)大學學報，2015，38（3）：369-374.

[6]宋榮浩，楊紅娟，馬坤，等．西瓜品種資源的蔓枯病抗性鑒定與評價[J]．植物遺傳資源學報，2007，8（1）：72-75.

[7]張龑，王宣倉，李寐華，等．新疆甜瓜地方品種資源蔓枯病抗性鑒定[J]．新疆農(nóng)業(yè)科學，2011，48（10）：1841-1845.

[8]林德佩．甜瓜（Cucumis melo L.）種下分類專論[J]．中國瓜菜，2012，25（5）：42-46.

[9]KEINATH A P，HOLMES G J，EVERTS K L，et al．Evaluation of combinations of chlorothalonil with azoxystrobin，harpin，and disease forecasting for control of downy mildew and gummy stem blight on melon[J]．Crop Protection，2007，26（2）：83-88.

[10]畢研飛，徐兵劃，錢春桃，等．分子標記輔助甜瓜抗蔓枯病基因的聚合及品種改良[J]．中國農(nóng)業(yè)科學，2015，48（3）：523-533.

[11]LI P，REN R，YAO X F，et al．Identification and characterization of the causal agent of gummy stem blight from muskmelon and watermelon in east China[J]．Journal of Phytopathology，2015，163 （4）：314-319.

[12]ZHANG Y，KYLE M，ANGNOSTOU K．Screening melon（Cucu?mis melo）for resistance to gummy stem blight in the greenhouse and field[J]．HortScience，1997，32（1）：117-121.

[13]WANG H，HWANG S F，CHANG K F，et al．Characterization of Ascochyta isolates and susceptibility of pea cultivars to the ascochyta disease complex in Alberta[J]．Plant Pathology，2000，49 （5）：540-545.

[14]畢研飛，徐兵劃，錢春桃，等．甜瓜抗蔓枯病育種研究進展[J]．中國蔬菜，2013（20）：10-16.

[15]王惠哲，李淑菊，楊瑞環(huán)，等．不同黃瓜種質(zhì)材料對黑斑病的抗性評價[J]．中國園藝文摘，2012（1）：29-30.

[16]張永兵，王登明，張聰，等．甜瓜蔓枯病離體接種方法初步研究[J]．新疆農(nóng)業(yè)科學，2009，46（3）：521-525.

[17]胡鳳云，莫賤友，郭堂勛，等．西甜瓜蔓枯病菌致病力測定與品種抗病性分析[J]．南方農(nóng)業(yè)學報，2012，43（10）：1490-1494.

[18]LIU N，XU S，YAO X，et al．Studies on the control of ascochyta blight in field peas（Pisum sativum L.）caused by Ascochyta pinodes in Zhejiang province，China[J]．Frontiers in Microbiology．2016，7：481．

Comparison of different identifying methods for oriental pickling melon （Cucumis melo var.conomon）resistance to Didymella bryoniae at the seedling stage

YAO Xiefeng,XU Jinhua,LI Pingfang,ZHANG Man,REN Runsheng,LIU Guang,YANG Xingping

(Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement,Institute of Vegetable Crops,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014,Jiangsu,China)

Taking 42 different varieties of oriental pickling melons as materials,using the spray inoculation method at seedling stage and detached leaf inoculation,the resistance to Didymella bryoniae of the oriental pickling melons were studied.The results showed that 10 acceesions were moderate resistant and no one immune.In addition,significant positive correlations were observed between the lesion radii of detached leaf assay and the results by spray inoculation at seedling stage.

Oriental pickling melon;Seedling stage;Gummy stem blight;Disease resistance identification

2016-09-18；

：2016-12-15

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項目[CX(13)2001]；國家西甜瓜產(chǎn)業(yè)技術體系（CARS-No.8）

姚協(xié)豐，男，助理研究員，主要從事西瓜甜瓜抗病育種研究。Tel:025-84390731；E-mail:yaoxiefeng@jaas.ac.cn

羊杏平，男，研究員，主要從事西瓜甜瓜育種與生物技術研究。Tel:025-84390222；E-mail:1394654153@qq.com