董夢書， 楊琳， 2， 3*， 陳祥盛， 2， 3， 張余杰

(1.貴州大學昆蟲研究所，貴陽550025； 2. 貴州山地農業(yè)病蟲害重點實驗室，貴陽550025；3. 貴州昆蟲資源開發(fā)利用特色重點實驗室，貴陽550025)

基于線粒體COⅠ基因部分序列的緬甸安小葉蟬地理種群遺傳多樣性研究

董夢書1， 楊琳1， 2， 3*， 陳祥盛1， 2， 3， 張余杰1

(1.貴州大學昆蟲研究所，貴陽550025； 2. 貴州山地農業(yè)病蟲害重點實驗室，貴陽550025；3. 貴州昆蟲資源開發(fā)利用特色重點實驗室，貴陽550025)

緬甸安小葉蟬Anakaburmensis是一種取食竹子的害蟲，為了探討該物種不同地理種群的遺傳多樣性，本研究首次基于線粒體COⅠ基因部分序列對我國26個地理種群共241個樣本進行了研究，選取長度為615 bp的基因序列，并運用DNASP、MEGA等分析得出，該片段中有546個保守位點、69個變異位點和33個單倍型。種群的單倍型多樣性指數為0.845，核苷酸多樣性指數為0.008 77，基因流為0.598 5，種群間的固定系數為0.729 15，表明種群間遺傳多樣性水平高、遺傳分化大、基因交流水平較低。中性檢驗Tajima’sD為-1.658 98，0.10>P>0.05，Fu’sFs值為-5.787，P>0.10。分子變異結果顯示，該物種遺傳變異主要來自種群間，變異百分率為72.92%，而種群內的遺傳變異低，僅為27.08%。研究結果得出該物種遺傳結構，可為今后從事葉蟬類昆蟲的分子生物學研究及該蟲的防治提供理論基礎資料。

緬甸安小葉蟬；mtDNACOⅠ基因；地理種群；遺傳多樣性

圖1 緬甸安小葉蟬AnakaburmensisDworakowska

Fig. 1 The phenotype ofAnakaburmensisDworakowska

1.雄成蟲背面觀male habitus， dorsal view; 2. 雄成蟲側面觀male habitus， lateral view; 3. 頭胸部背面觀head and thorax， dorsal view; 4. 顏面face; 5. 頭胸部側面觀head and thorax， lateral view。

緬甸安小葉蟬Anakaburmensis隸屬于半翅目Hemiptera葉蟬科Cicadellidae小葉蟬亞科Typhlocybinae，為植食性昆蟲，主要分布于緬甸、越南(Dworakowska，1993)及中國的貴州、云南、湖南、廣西、四川、重慶等地。該蟲體長3～4 mm，體褐色，中域冠有2個褐色黑圓斑，前翅前緣與后緣附近各具1淡黃色半透明斑(圖1)。該蟲以刺吸竹類植物葉片為生，嚴重影響了竹子的生長發(fā)育，是一類重要害蟲(楊琳等，1999；陳祥盛等，2012)。

隨著分子生物學技術的迅速發(fā)展和廣泛應用，分子標記已成為昆蟲分子系統學中的一個新熱點(李正西，沈佐銳，2002)。在半翅目中，此研究主要集中在蝽類(卜云等，2006)、蚜蟲(張合彩，喬格俠，2008)等。葉蟬類昆蟲的研究主要有小貫小綠葉蟬Empoascaonukii(Fuetal.， 2014)的地理種群及分子系統學研究。mtDNA是細胞質中一種遺傳物質，呈閉合雙鏈環(huán)狀結構，具有簡單的分子結構、母系遺傳、技術方法簡單快捷、比核基因進化速率快、多拷貝及高度保守等特點，在昆蟲系統發(fā)育進化(Renetal.，2013)、遺傳變異、親緣關系和物種鑒定(Leeetal.，2014)等研究領域中應用廣泛。在半翅目昆蟲中，mtDNACOⅠ基因長度相對其他基因位置比較保守，用于分子系統學、鑒別物種及遺傳變異等研究(肖永剛，陳祥盛，2014)。當前有關緬甸安小葉蟬的研究僅局限于形態(tài)學和生態(tài)學方面，而在分子生物學上未見地理種群遺傳多樣性的相關報道。為了解中國緬甸安小葉蟬群體的遺傳結構，本研究通過mtDNACOⅠ基因序列作為分子標記對我國緬甸安小葉蟬26個地理種群的遺傳多樣性進行研究，分析其不同地理種群的遺傳結構及分化，探討其內在的遺傳因素，研究結果有利于深入了解其在中國的分布和變化，可為葉蟬類昆蟲分子生物學研究及緬甸安小葉蟬的防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試蟲源為2014年10月—2016年8月在國內7個省(市)26個地區(qū)通過掃網方法采集的樣本(表1)，將采集的緬甸安小葉蟬成蟲置于1.5 mL的離心管中，分裝并記錄采集地及時間。用無水乙醇浸泡后，置于-70 ℃超低溫冰箱中保存待用。

試劑與儀器：昆蟲DNA提取試劑盒購于Omega BioTek公司(D0926-01)；上海生物工程股份有限公司合成COⅠ引物。Olympus SZ2-ILST型光學體視顯微鏡(德國Leica公司)；T100TMThermal Cycler型PCR擴增儀(美國BIO-RAD公司)；170-8170型UVP凝膠成像系統、Power PacTMHV Power Supply型電泳儀(美國BIO-RAD公司)；HVE-50型自動高壓滅菌器；Mini-10K微型高速離心機(珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 取出冷凍保存于冰箱的標本，在解剖鏡下去除腹部與雙翅置于甘油中保存，其余的頭、胸、足等部分置于滅菌的1.5 mL離心管中并使用研磨棒磨至粉末狀，然后通過E.Z.N.A.TM Insect DNA kit試劑盒提取總DNA，洗脫出來的DNA用滅菌的PCR管分裝，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 緬甸安小葉蟬不同地理種群樣品信息

1.2.2 PCR擴增及測序 提取的總DNA為模板進行該序列的PCR擴增，反應程序參照Folmer等(1994)，根據引物設計退火溫度(Tm)，設置梯度在10 ℃以內的溫度，進行普通PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測得到適合該蟲的Tm為50 ℃。擴增引物為COⅠ-F：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’，COⅠ-R：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’；PCR擴增反應總體系為30 μL，上下游引物各1 μL，Taq PCR Master Mix 15 μL，DNA模板3 μL，ddH2O補至30 μL。

PCR擴增程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，33～35個循環(huán)；最后72 ℃補償延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像分析系統中觀察并拍照，記錄結果。

1.2.3 純化PCR產物并測序 使用Omega BioTek公司的DNA凝膠回收試劑盒(D0926-01)對需要純化的樣品PCR產物進行回收，回收產物存于PCR管中，由生工生物工程(上海)股份有限公司測序，用以上引物作PCR擴增，進行雙向測序。

1.2.4 數據的整理、分析 測序得到了241個mtDNACOⅠ基因序列，將測序結果在NCBI內進行BLAST比對，確認測序結果為緬甸安小葉蟬的mtDNACOⅠ基因序列；運用DNA Star 5.0拼接和校對所得的序列，結果選用615 bp序列片段，對其進行變異分析。

通過MEGA 6.06(Tamura，2013)分析群體間的堿基組成、變異位點及各核苷酸含量所占的百分比，分析各群體間的遺傳距離、核苷酸相似度、各單倍型間的遺傳距離。

用DnaSP 5.10分析群體的核苷酸多樣性(Pi)、核酸平均差異度(K)、單倍型多樣性(Hd)、中性檢驗(Tajima’sD和Fu’sFs)、基因流(Nst)、遺傳分化系數(Gst)、核苷酸平均差異數(Kxy)和核苷酸差異度(Dxy)。種群間的遺傳分化程度用固定系數(Fst)衡量(Rousset，1997)，若Fst<0.25，表明群體間的基因交流多，總群體間的遺傳分化不明顯；若Fst>0.25，則表明種群間的基因交流少，有明顯的遺傳分化在群體中存在(王靜等，2014)。運用Arlequin 3.5.1.2中Genetic structure進行分子變異AMOVA分析；在Network 5.0中用鄰接法構建單倍型網絡圖。

2 結果與分析

2.1 堿基組成及序列分析

獲得的615 bp的線粒體序列中有546個保守位點、69個變異位點、51個簡約信息位點、18個單一變異位點，沒有堿基的插入與缺失；堿基T、A、G、C的含量分別是45.6%、26.8%、14.8%、12.8%，其中A+T含量為72.4%，G+C含量為27.6%。

2.2 緬甸安小葉蟬單倍型分析

241個緬甸安小葉蟬樣本中共檢測出33個單倍型，分別命名為H1～H33，GenBank登錄號為：KY320208～KY320240，不同地理種群具有不同的單倍型。每個地理種群有1～4個單倍型，平均有2個單倍型，其中XW、BN、WS、BS均檢測到4個單倍型；HX、WD、ZZ、CJ均檢測到3個單倍型。

33個單倍型中有6個共享單倍型(H1、H2、H4、H7、H19和H23)，其中8個種群的76個樣本中，H7廣泛分布；其次，H2分布在8個種群的47個樣本中；H4分布在5個種群的23個樣本中；在HX、WD、XW地理種群中4個樣本有H1分布；H19分布在BN、ML 2個種群的15個樣本中；ML、WS的14個樣本中有H23分布。另外有特殊單倍型2個，分別是H4和H7，在種群PD、DX、YA、YB、LS、MY、BB和FL樣本中出現(表2)。

2.3 核苷酸多樣性與中性檢驗分析

總群體的Hd為0.845，K為5.392，Pi為0.008 77。不同地理種群Pi為0～0.025 04，Hd為0～0.867，其中PD、DX、YS、YA、YB、MY、BB、FL種群各項參數最低，均為0，而WS種群的Hd=0.867，Pi=0.025 04和K=15.4值最高。中性檢驗結果顯示，總種群的Tajima’sD=-1.658 98，Fu’sFs=-5.787(0.05

用MEGA 6.06采用鄰接法在Kimura 2-parameter模型的基礎上，對26個不同地理種群的遺傳距離進行分析，總平均遺傳距離為0.016 6，33個單倍型間的遺傳距離為0.001 6～0.049 0。

2.4 不同地理種群的遺傳分化

不同地理種群的mtDNACOⅠ基因序列的遺傳距離為0～0.039 4。與核苷酸多樣性比較結果不顯著(P>0.10)，說明遺傳分化較低，推測緬甸安小葉蟬的遺傳分化可能受地理位置、海拔和氣候的影響。

種群間Fst為0～1，平均值為0.598 0，說明分化程度顯著；而Gst為0～1，平均值為0.413；Nst為0～1，平均值為0.598 5，各種群間基因流比較均一，種群間基因交流的水平低，說明各地理種群可能存在遺傳漂變，從而發(fā)生分化。

分子變異AMOVA的結果顯示，Fst為0.729 15(表3)，26個地理種群間的遺傳變異百分率為72.92%，而種群內的僅為27.08%，表明緬甸安小葉蟬26個地理種群的遺傳變異主要在種群間，而種群內較低。說明部分種群間已經產生了明顯的遺傳分化。

2.5 單倍型網絡圖、系統發(fā)育

用Network 5.0構建單倍型網絡圖(圖2)，網絡圖的進化方向比較集中，可以看成是從中間較多單倍型的種類向周圍擴散。在所有群體中具有較高頻率的幾種單倍型位于網絡進化圖的右方，其余低頻率的單倍型則通過短支與這幾種高頻率的單倍型相連，呈現從頻率高向低處擴散的現象。H2、H4、H7所占的樣本量多，頻率較高，同時其他的單倍型也存在獨立的分支，與分子變異方差分析結果吻合，說明種群間的遺傳分化來自于種群間，該物種可能存在種群變異。

3 討論

本研究以我國26個地理種群的緬甸安小葉蟬冷凍標本為材料，探索了該蟲241個個體的mtDNACOⅠ基因序列，進行了測定、分析，并構建了網絡圖。其中，72.4%的A+T含量顯示堿基A+T偏向性，與半翅目昆蟲線粒體基因序列堿基組成結果一致，如綠環(huán)緣蝽StictopleurussubviridisA+T含量達到75.7%(花吉蒙等，2009)，五節(jié)根蚜亞科Fordinae的平均A+T含量為79.6%(張合彩，喬格俠，2008)，17種菱蠟蟬亞科Cixiinae的平均A+T含量為67.2%(肖永剛，陳祥盛，2014)，假眼小綠葉蟬Empoascavitis的A+T含量為70.2%(付建玉等，2014)；也與其他昆蟲的一致，如直翅目黃脛小車蝗Oedaleusinfernalis的為67.91%(孫嵬等，2013)。

用不同地理種群緬甸安小葉蟬作為實驗材料，親緣關系近，且變異中轉換值大于顛換值，符合親緣關系相近的分類階元中核苷酸的轉換大于顛換的規(guī)律，在遠緣分類階元中恰恰相反(Simonetal.，1994)。本研究共得到33個單倍型，其中H7個體數量為76，占總數的31.5%，說明其可能為該物種種群的原始單倍型，具有這種單倍型的物種適應環(huán)境的能力強，在生存中為優(yōu)勢種。所有單倍型中共享單倍型有6個，特殊單倍型2個。XW、BN、WS、BS 4個種群的單倍型種類最多，均為4個，其次為HX、WD、ZZ、CJ，均為3個，PD、DX、YA、YB、LS、MY、BB和FL均為1個。單倍型的種類也映射出群體來源的復雜性，說明XW、BN、WS、BS、HX、WD、ZZ、CJ的遺傳多樣性高，有豐富的遺傳資源，而PD、DX、YA、YB、LS、MY、BB和FL的遺傳多樣性較低。群體單倍型多樣性高，說明遺傳資源豐富，遺傳多樣性高。本研究的單倍型多樣性為0.845，說明緬甸安小葉蟬不同地理種群的遺傳多樣性程度較高，存在遺傳分化。特別是在BN和WS地理種群中，單倍型多樣性最高，Kxy和Dxy的值比其他種群大，推測不同的地理種群所處的自然環(huán)境不同，在寄主植物和自然環(huán)境的選擇下，發(fā)生了相對較大的遺傳結構變異。

中性檢驗結果Tajima’sD和Fu’sFs可反映種群數量的歷史變化。兩項中性檢驗的結果參數為負值，P>0.01，說明我國緬甸安小葉蟬在近段歷史時期有種群擴張，產生了稀有的等位基因(檢測到低頻率的單倍型)，Fu’sFs為負值，表明近段時期該蟲可能經歷了種群爆發(fā)與擴張事件(Tajima，1989)，近期內有向某一方向遷飛的趨勢。所有地理種群無顯著差異，說明各地理種群進化符合中性模型(王興亞，許國慶，2014)。

表3 緬甸安小葉蟬26個地理種群CO I的分子變異方差分析(AMOVA)

注： a， b表示在同一水平上， 差異有統計學意義(P<0.05)。

Note： a and b indicate there is a significant difference between populations or within population (P<0.05).

圖2 緬甸安小葉蟬COⅠ基因單倍型網絡中介圖

黃色圓面積代表單倍型出現頻率， 紅色數字代表變異位點， 紅色圓點代表中值矢量； 圓面積的大小表示樣本量的多少， 其中最小為1個樣本量(如H3、H6、H14等)， 最大為76個樣本量(如H7)。

Yellow circle area represents haplotype frequencies， red number represents variable sites， and red dot represents median vectors; the size of the circle area indicates the number of samples (1-76).

在單倍型的發(fā)生頻率和組成的基礎上，通過分子變異AMOVA分析不同地理種群的分化程度和差異，來判斷種群間遺傳分化。分子變異結果表明，緬甸安小葉蟬的遺傳變異主要來自種群間，種群內分化少，說明存在種群擴張，其Fst值為0.729 15，說明種群間的遺傳分化顯著。在這過程中就有著種群間的基因交流，基因流影響種群間的分化，減少種群間的遺傳差異，研究結果表明，基因流Nst值為0.598 5，小于1，說明種群內部基因交流水平低，各種群間可能發(fā)生遺傳漂變，而遷飛發(fā)生基因交流較少，可能存在自然選擇、地理環(huán)境的影響，發(fā)生了遺傳變異(Boivinetal.，2004)。

由單倍型網絡可看出，H7、H22分別是8個不同地理種群的共享單倍型，不同的單倍型存在于不同種群中，單倍型中介網絡圖分布的地理種群間對應關系不明顯，說明部分地理種群的緬甸安小葉蟬可能存在不同程度的擴張。從分布格局上看，比較混亂，即存在地理種群間的遺傳分化，種群內部分化小，但從分析結果看，造成分化的原因有地理隔離，也可能是地理位置、海拔和氣候自然選擇的結果。

我國緬甸安小葉蟬棲息地無明顯丟失現象，可能是自然環(huán)境或地理隔離阻礙了其基因交流。不同地理種群間遺傳變異和分化有差異，部分地理種群間存在遷飛或者擴散現象，都是自然選擇的結果；各地理種群內的基因交流較小，遺傳分化較小，內部遺傳變異較低。本研究在一定程度上為緬甸安小葉蟬的系統進化研究，進一步揭示該蟲的起源、分化格局、發(fā)生規(guī)律及擴散方向，也為將來不同地理種群葉蟬類害蟲的防治提供了分子水平的基礎資料。由于時間以及該物種生活史的影響，本研究的不足之處在于僅在我國竹子主產區(qū)采集樣本，且僅通過mtDNACOⅠ部分序列來研究分析了緬甸安小葉蟬系統進化，因此，未來應完善樣品采集地以及擴大不同地理種群的樣本量，用序列的全長或更多基因進行分子標記，得到更精確的數據。

致謝：感謝楊琳老師和陳祥盛教授在實驗過程中給予的指導和幫助，感謝貴州大學昆蟲研究所的所有老師在平時答疑中給予的指導，感謝貴州大學昆蟲研究所張余杰、羅強、姚亞林等在標本采集及數據分析上的幫助。

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Analysis of Genetic Diversity among Different Geographic Populations ofAnakaburmensis(Hemiptera： Cicadellidae) Based on Part of mtDNACOⅠ Gene Sequences

DONG Mengshu1， YANG Lin1， 2， 3*， CHEN Xiangsheng1， 2， 3， ZHANG Yujie1

(1. Institute of Entomology， Guizhou University， Guiyang 550025， China; 2. Guizhou Key Laboratory for Plant Pest Management of Mountainous Region， Guiyang 550025， China; 3. Special Key Laboratory of Insect Resource Development and Utilization， Guiyang 550025， China)

Anakaburmensisis an important pest which feed on bamboo. To investigate the genetic variation ofA.burmensisamong different geographic populations in China， the 615 bp segments of the mitochondrial cytochrome coxidase subunit Ⅰ (COⅠ) gene ofA.burmensisindividuals from 26 geographic populations were analyzed by using DNASP， MEGA, etc. The results showed that there were 546 conserved sites， 69 mutation sites， 33 haplotypes in the fragments; a high level of genetic diversity (haplotype diversity index： 0.845; nucleotide diversity index： 0.008 77) in the total population was detected. Additionally， high genetic differentiation (fixation index： 0.729 15) was found among different geographic populations but with low gene flow level (0.598 5). The differences of the Neutral test (Tajima’sD=-1.658 98， 0.10>P>0.05， Fu’sFs=-5.787，P>0.10) were not significant. The result of molecular variance analysis showed that the genetic differentiation among populations was 72.92% and higher than that of within populations (27.08%). Therefore， here we concluded the genetic structure ofA.burmensiscan provide a theoretical basis for future research of molecular biology and the control of this insect.

Anakaburmensis; mtDNACOⅠ gene; geographic population; genetic diversity

2017-01-21 接受日期：2017-04-10

國家自然科學基金項目(31260178； 31660209)

董夢書(1991—), 女, 碩士研究生, 主要從事農林昆蟲多樣性研究, E-mail：dongmsh_chl@163.com

*通信作者Corresponding author, E-mail：yanglin6626@163.com

10.11984/j.issn.1000-7083.20170026

Q38

A

1000-7083(2017)03-0277-07