李萃萃， 張曼輝， 夏 涵， 戴宜武

(1.南方醫(yī)科大學, 廣東 廣州 510515 2.陸軍總醫(yī)院附屬八一腦科醫(yī)院超聲科, 北京100010 3.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院麻醉科, 北京100078)

大麻二酚抑制小鼠脊髓損傷后炎癥反應及促進功能恢復的研究

李萃萃1， 張曼輝2， 夏 涵3， 戴宜武1

(1.南方醫(yī)科大學, 廣東 廣州 510515 2.陸軍總醫(yī)院附屬八一腦科醫(yī)院超聲科, 北京100010 3.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院麻醉科, 北京100078)

目的：探討大麻二酚抑制小鼠急性脊髓損傷后炎癥反應及其機制。方法:將C57/BL6小鼠隨機分為3組(假手術組、對照組和用藥組)，每組8只，共24只。用藥組和對照組小鼠用鉗夾法夾斷小鼠脊髓，假手術組不夾斷脊髓，術后每日為小鼠擠壓膀胱，幫助排尿。術后1h、12h、24h、36h、48h、60h給藥，依據(jù)小鼠體重，對照組和假手術組腹腔注射安慰劑(0.25mL/10g，1%吐溫80+生理鹽水)，用藥組予以腹腔注射30mg/kg大麻二酚(1.2mg/mL，溶劑為1%吐溫80+生理鹽水)。術后72h評價小鼠脊髓神經(jīng)功能，行BMS(Basso mouse scale，BMS)評分，并通過ELISA檢測組織中高遷移率族蛋白1(HMGB1)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量。結果:BMS(Basso mouse scale，BMS)評分，假手術組>用藥組>對照組(P<0.05)；脊髓組織中HMGB1和TNF-α含量均為假手術組<用藥組<對照組(P<0.05)。結論:大麻二酚能通過抑制脊髓損傷小鼠模型HMGB1表達來抑制小鼠炎癥反應，從而對脊髓損傷小鼠脊髓神經(jīng)功能保護。

大麻二酚； 脊髓損傷； 炎 癥； 運動功能

脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)是脊柱損傷臨床最嚴重的并發(fā)癥一種嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)損傷，可致軀體運動、感覺以及自主神經(jīng)功能障礙，包括原發(fā)性和繼發(fā)性損傷。原發(fā)性損傷系外力直接或間接致脊髓受損，繼發(fā)性損傷系脊髓在原發(fā)性損傷后發(fā)生氧化應激、炎癥反應等一系列生理生化機制，致原發(fā)性損傷組織周圍組織發(fā)生進一步損傷，使脊髓損傷進一步加重并擴大脊髓損傷范圍[1]。原發(fā)性脊髓損傷已發(fā)生且難以逆轉，因此能有效抑制繼發(fā)性脊髓損傷，對脊髓損傷具有重要意義。高遷移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein，HMGB1)在真核細胞核內(nèi)表達，系一種非組蛋白DNA結合蛋白，同時也是一種危險分子蛋白，參與炎癥反應[2]。HMGB1在脊髓損傷中高度表達, 能加重脊髓炎癥反應[1,3]。

大麻二酚系天然植物大麻提取物，無精神效應，具有抗炎作用[4]。目前國內(nèi)大麻二酚對脊髓損傷的治療尚無報道。本研究通過脊髓損傷模型探討驗證大麻二酚對脊髓損傷的抗炎作用及對功能恢復的幫助。

1 材料與方法

1.1 材料:小鼠(C57BL/6，北京維通利華實驗動物技術有限公司)，10周，雄性，20～25g；大麻二酚(98%)購于上海源葉生物有限公司；ELISA試劑盒(Minneapolis, MN, USA)。

1.2 方 法

1.2.1 脊髓損傷模型建立:用3.6%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠(0.01L/kg)，備皮(T10棘突為中心)。酒精消毒，背部正中切口(約2cm)，逐層切開，暴露棘突，將肌肉分離，用咬骨鉗將T9～11棘突和全椎板咬除。以T10為中心暴露硬脊膜(約9mm的圓形區(qū))，用顯微外科血管夾將其鉗夾3s(造模成功標志：鉗夾脊髓損傷瞬間，小鼠尾部痙攣性擺動，雙下肢和軀體抽動后雙下肢癱瘓)，脊髓損傷后逐層縫合肌肉，并縫合皮膚。假手術組僅作椎板雙側切除，不鉗夾。術后每天擠壓膀胱(早中晚3次)幫助排尿。

1.2.2 用藥和給藥時間:依據(jù)小鼠體重，對照組和假手術組腹腔注射安慰劑(0.25mL/10g，1%吐溫80+生理鹽水)，用藥組予以腹腔注射30mg/kg大麻二酚(1.2mg/mL，溶劑為1%吐溫80+生理鹽水)。藥物現(xiàn)配現(xiàn)用，給藥時間為模型建立后1h、12h、24h、36h、48h、60h。

1.2.3 神經(jīng)行為學評分:小鼠后肢運動功能BMS(Basso mouse scale，BMS)評分用于評價脊髓神經(jīng)功能。由不知道分組情況的研究人員進行測試, 受試SCI小鼠測試前均需排空膀胱，0～2分(評價踝關節(jié)運動)，3～4分(評價后肢對后半身支撐和向前步進的情況)，5～8分(評價步進過程中后爪位置和前后肢體的協(xié)調(diào)性及軀干的穩(wěn)定性)，9分為正常運動小鼠。

1.2.4 HMGB1和TNF-α組織含量測定:酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。脊髓損傷72h后，麻醉小鼠，活取小鼠脊髓T10節(jié)段上下約1cm，放入冷凍管并迅速置于液氮中冷凍，待取完所有標本時將標本放入-80℃冰箱中冷藏，待使用時取出。按照ELISA試劑盒操作使用說明，測定脊髓損傷組織中HMGB1和TNF-α的含量。

2 結 果

2.1 各組小鼠間BMS評分比較:全部24只小鼠均成功造模，通過BMS評分檢測小鼠損傷后各時間點下肢及軀體運動功能恢復情況，用藥后72h對各組小鼠進行BMS評分，用藥組BMS評分明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩兩比較可見，假手術組>用藥組>對照組，見表1。顯然，SCI小鼠經(jīng)大麻二酚治療后脊髓神經(jīng)功能有所恢復，但不能恢復到正常水平。

表1 各組小鼠BMS評分結果

注：兩兩比較采用SNK法。假手術組vs對照組：q=51.983，P<0.05；用藥組vs對照組：q=3.907，P<0.05；假手術組vs用藥組：q=48.076，P<0.05

2.2 各組小鼠脊髓組織HMGB1和TNF-α的含量比較:用藥后72h對損傷脊髓周圍組織中HMGB1和TNF-α的含量進行測定。各組HMGB1含量比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩兩比較結果為：對照組>用藥組>假手術組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；各組TNF-α含量比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩兩比較結果為：對照組>用藥組>假手術組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2。

表2 各組間脊髓組織HMGB1和TNF-α的含量比較

注：兩兩比較采用SNK法。HMGB1含量：假手術組vs對照組：q=30.889，P<0.05；用藥組vs對照組：q=8.714，P<0.05；假手術組vs用藥組：q=22.175，P<0.05

TNF-α含量：假手術組vs對照組：q=24.221，P<0.05；用藥組vs對照組：q=5.308，P<0.05；假手術組vs用藥組：q=18.913，P<0.05

3 討 論

脊髓損傷是一種急性、破壞性極強的疾病，可導致軀體運動和感覺功能障礙，多數(shù)幸存者成為了截癱患者，生活質(zhì)量差，而且增加社會負擔。脊髓損傷包括原發(fā)性脊髓損傷和繼發(fā)性脊髓損傷，目前階段原發(fā)性損傷無有效治療措施[5]。繼發(fā)性脊髓損傷加重血-脊髓屏障破壞，導致一系列通透性改變，導致脊髓出血、炎癥反應和水腫，使未損傷部位神經(jīng)組織損傷，進一步破壞神經(jīng)功能[6,7]。炎癥反應在繼發(fā)性損傷中占有重要組成部分，因此控制炎癥反應對脊髓損傷的治療具有重大意義。

BMS評分是評價脊髓損傷后小鼠神經(jīng)運動功能恢復情況。研究表明，大麻二酚能抑制神經(jīng)元細胞凋亡，對神經(jīng)系統(tǒng)具有保護作用[8]。本實驗中，用藥組BMS評分比對照組評分高，說明大麻二酚對脊髓損傷小鼠神經(jīng)功能具有保護作用。其機制可能是大麻二酚能夠減輕繼發(fā)性脊髓損傷，減輕炎癥反應，從而保護神經(jīng)元。

HMGB1是一種危險蛋白分子，主要存在于真核細胞核中，是一種非組蛋白DNA結合蛋白。在神經(jīng)系統(tǒng)中，HMGB1通過激活和聚集炎癥相關細胞，激活炎癥反應，包括小膠質(zhì)細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和NK細胞等，并釋放出炎癥因子加重炎癥反應，包括TNF-α等[9～11]。當細胞受損或者細胞壞死后，HMGB1會被表達并釋放到細胞外[12]。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)用藥組組織中HMGB1含量比對照組低。說明大麻二酚能降低組織中HMGB1的表達。目前大麻二酚降低HMGB1表達和釋放的機制未明確，有待繼續(xù)研究。TNF-α是一種重要的炎癥因子，正常情況下可有助于機體清除有害物質(zhì)，對機體具有保護作用，當機體收到損傷或炎癥時大量釋放，可調(diào)控其他因子的產(chǎn)生，在炎癥反應過程中起到放大炎癥反應作用，對機體產(chǎn)生更大的損傷[13,14]。TNF-α在神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應中可由小膠質(zhì)細胞分泌[15,16]。

在本實驗中，用藥組組織中TNF-α含量比對照組低，說明大麻二酚具有抑制TNF-α表達的作用，同時大麻二酚能抑制組織中HMGB1表達。有研究證實，HMGB1在炎癥反應中能聚集并激活小膠質(zhì)細胞，促進并放大炎癥反應[16]。因此大麻二酚抑制炎癥反應的機制可能是抑制HMGB1表達和釋放，從而抑制小膠質(zhì)細胞聚集和激活，抑制炎癥因子的釋放，從而抑制炎癥反應的進行，最終對脊髓損傷產(chǎn)生保護作用。

本研究采用小鼠模型，與文獻中常用的大鼠模型相比，相似的藥品劑量和注射濃度并沒有造成動物死亡和任何腹膜炎反應。說明大麻二酚在一定劑量范圍內(nèi)是安全的，但由于大麻二酚的治療劑量范圍較窄，神經(jīng)系統(tǒng)急性損傷后的高血腦屏障通過性及細胞防衛(wèi)機制受損等因素可能增加藥物毒性風險[17]。需給予足夠的關注。

[1] Festoff, B W.Designing drugs that encourage spinal cord injury healing[J].Expert Opinionon Drug Discovery,2014, 9(10):1151～1165.

[2] Frank MG, Weber M D, Watkins L R,et al. Stress sounds the alarmin: The role of the danger-associated molecular pattern HMGB1 in stress-induced neuroinflammatory priming[J].Brain Behavior and Immunity,2015, 48:1～7.

[3] 張瑩,楊三強,劉均港,等.血漿置換對系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血HMGB-1、TNF-α水平的影響[J].山東醫(yī)藥,2013,53(18):82～83.

[4] Burstein S. Cannabidiol (CBD) and its analogs: a review of their effects on inflammation[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry,2015, 23(7):1377～1385.

[5] Lusilla-Palacios P, Castellano-Tejedor C.Spinal cord injury and substance use: a systematic review[J].Adicciones,2015, 27(4):294～311.

[6] Wang J, Pearse D D.Therapeutic hypothermia in spinal cord injury: the status of its use and open questions[J].International Journal of Molecular Sciences,2015, 16(8):16848～16879.

[7] Sharma H S.Early microvascular reactions and blood-spinal cord barrier disruption are instrumental in pathophysiology of spinal cord injury and repair: novel therapeutic strategies including nanowired drug delivery to enhance neuroprotection[J].Journal of Neural Transmission,2011, 118(1):155～176.

[8] Schiavon A P, Soares L M, Bonato J M,et al.Protective effects of cannabidiol against hippocampal cell death and cognitive impairment induced by bilateral common carotid artery occlusion in mice[J].Neurotoxicity Research,2014, 26(4), 307～316.

[9] Frank M G, Weber M D, Fonken L K,et al.The redox state of the alarmin HMGB1 is a pivotal factor in neuroinflammatory and microglial priming: A role for the NLRP3 inflammasome[J].Brain Behavior and Immunity,2016,215～224.

[10] Hayakawa K, Mishima K, Nozako M,et al. Delayed treatment with minocycline ameliorates neurologic impairment through activated microglia expressing a high-mobility group box1-inhibiting mechanism[J].Stroke,2008, 39(3):951～958.

[11] Gelderblom M, Sobey C G, Kleinschnitz C,et al.Danger signals in stroke[J].Ageing Research Reviews,2015:77～82.

[12] Vénéreau E, Ceriotti C, Bianchi M E.DAMPs from Cell Death to New Life[J].FrontiersInImmunology,2015, 18(6): 422.

[13] 王曉燕，張流忠，周莉,等.膿毒癥患者血清CRP、TNF-α水平變化及意義[J].山東醫(yī)藥,2012,58(34):34～35.

[14] Cong L, Chen W.Neuroprotective effect of ginsenoside rd on spinal cord injury rats[J].Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology,2016, 119(2): 193～201.

[15] Song F, Zeng K, Liao L,et al.Schizandrin a inhibits microglia-mediated neuroninflammation through inhibiting TRAF6-NF-kB and Jak2-Stat3 signaling pathways[J].PLoS One,2016, 11(2).

[16] Han B, Lu Y, Zhao H,et al.Electroacupuncture modulated the inflammatory reaction in MCAO rats via inhibiting the TLR4/NF-κB signaling pathway in microglia[J].Journal of Clinical and Experimental Pathology,2015, 8(9):11199～11205.

[17] Maier I C, Schwab M E.Sprouting,regeneration and circuit formation in the injured spinal cord: factors and activity[J].Philosophical Transactions of the Royal Society B，2006,361(1473): 1611～1634．

Cannabidiol Can Inhibit Inflammation in a Mouse Model of Spinal Cord Injury

LICuicui,etal

(SouthernMedicalUniversity,GuangdongGuangzhou510515,China)

Objective:To investigate the inhibition of inflammation by cannabidiol in a mouse model of spinal cord injury and study its mechanism. Methords: 24 male C57Bl/6 mice were randomized into 3 groups: sham-operation group, control group and medication group. We established an spinal cord injury model by clip method, the mice in sham-operate group and control group were administered with a mixture of 1% of tween 80 and sterile saline (0.25mL/10g) and medication group were treated with cannabidiol (30mg/kg ; was dissolved in a mixture of 1% of Tween 80 and sterile saline (1.2mg/mL)) by intraperitioneal injection at 1h、12h、24h、36h、48h、60h after operation.72h after operation , BMS test was used to evaluate the neurological score, the expression levels of HMGB1 and TNF-αin spinal cord tissue were assayed by ELISA. Rsults: The BMS test showed that medication group had a higher score than the control group(P<0.05). The expression levels of HMGB1 and TNF-α in medication group were significant reduced as comparison with control group P<0.05), but significant increased than the sham-operation group(P<0.05). Conclusion: Cannabidiol can inhibit inflammation in a mouse model of spinal cord injury via inhibiting the expression of HMGB1.

Cannabidiol; Spinal cord injury; Inflammation； Motor function

1006-6233(2017)05-0767-04

國家自然科學基金,(編號:81271391)

戴宜武

A

10.3969/j.issn.1006-6233.2017.05.018