周賀,張蕊,徐其征,麻天宇,江振華,莊子昕,高俊,姜志強,李雅娟(大連海洋大學(xué)遼寧省省級高校海洋生物資源可持續(xù)利用重點實驗室,農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室,遼寧大連116023)

冷休克誘導(dǎo)紅鰭東方鲀雄核發(fā)育單倍體的條件優(yōu)化

周賀,張蕊,徐其征,麻天宇,江振華,莊子昕,高俊,姜志強,李雅娟
(大連海洋大學(xué)遼寧省省級高校海洋生物資源可持續(xù)利用重點實驗室,農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室,遼寧大連116023)

為探索無需卵子失活僅用冷休克方法誘導(dǎo)雄核發(fā)育單倍體,以紅鰭東方鲀Takifugu rubripes為研究對象,試驗選用L9(34)設(shè)計,進(jìn)行3因素3水平的正交試驗,處理溫度設(shè)為0、2、4益,處理持續(xù)時間設(shè)為30、45、60 min,處理起始時間設(shè)為2、5、8 min,共9個試驗組,并對其后代采用單個胚胎染色體計數(shù)法進(jìn)行染色體數(shù)目統(tǒng)計及微衛(wèi)星分析。結(jié)果表明:冷休克誘導(dǎo)得到的單倍體率最高為第7試驗組和第9試驗組,分別為受精后8 min在4益下處理30 min和受精后5 min在4益下處理60 min,單倍體率分別為86.7%和80.0%;根據(jù)正交試驗直觀分析結(jié)果,得出冷休克誘導(dǎo)紅鰭東方鲀雄核發(fā)育單倍體的3因素最優(yōu)組合為處理溫度4益、處理持續(xù)時間60 min、處理起始時間8min;影響冷休克誘導(dǎo)單倍體的3因素主次順序為處理溫度>處理起始時間>處理持續(xù)時間;微衛(wèi)星分析結(jié)果表明,單倍體攜帶的遺傳基因全部為父本的遺傳基因。研究表明,僅用冷休克方法可以成功誘導(dǎo)紅鰭東方鲀雄核發(fā)育單倍體,雄核發(fā)育單倍體率高達(dá)86.7%,為進(jìn)一步研究誘導(dǎo)紅鰭東方鲀雄核發(fā)育二倍體奠定了基礎(chǔ)。

紅鰭東方鲀;冷休克;雄核發(fā)育;單倍體;正交試驗

紅鰭東方鲀Takifugu rubripes是鲀形目中個體最大、毒性最小、經(jīng)濟(jì)價值最高的名貴海水魚類。其肉質(zhì)潔白、細(xì)嫩,肉味鮮美,享有“魚中之王冶的美稱。是中國北方海水養(yǎng)殖的首選和出口創(chuàng)匯的優(yōu)勢水產(chǎn)品。紅鰭東方鲀雌雄生長速度雖然差異不大,但性成熟的雄魚肉質(zhì)好、精巢味美,所以成熟雄魚價格是雌魚的2倍[1]。因此,如能采用安心、安全、高效的冷休克誘導(dǎo)技術(shù),即不使用紫外線照射,也不進(jìn)行投喂性激素等方法,便能高效生產(chǎn)雄性紅鰭東方鲀,從而提高經(jīng)濟(jì)效益,其研究成果具有一定的應(yīng)用價值。

關(guān)于紅鰭東方鲀遺傳育種方面的研究,日本學(xué)者在紅鰭東方鲀的遺傳連鎖圖譜、抗蟲、種間雜交、性別決定及控制技術(shù)等方面進(jìn)行了系統(tǒng)研究[1]。Kikuchi等[2]根據(jù)基因組連鎖分析,進(jìn)一步確定紅鰭東方鲀性別決定機制為XX/XY型,且性別決定基因位于19號連鎖群的單一區(qū)域。Kamiya等[3]報道,采用單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleo-tide Polymorphisms,SNP)標(biāo)記得到紅鰭東方鲀性別決定基因抗苗勒氏管激素域型受體Amhr2特異標(biāo)記1個,即X染色體上為胞嘧啶(C),Y染色體上為鳥嘌呤(G),而且利用Amhr2基因中特異SNP位點鑒別遺傳性別準(zhǔn)確率幾乎可達(dá)到100%。中國學(xué)者近幾年的研究主要集中在雜交育種[4]、微衛(wèi)星標(biāo)記[5-8]、家系構(gòu)建與早期標(biāo)準(zhǔn)化培育[9]和形態(tài)性狀分析[10]等方面,而有關(guān)紅鰭東方鲀雄性化鮮有報道,最近周賀等[11]報道了低溫誘導(dǎo)紅鰭東方鲀雄性化及早期性腺分化的組織學(xué)觀察。但關(guān)于冷休克誘導(dǎo)紅鰭東方鲀雄核發(fā)育國內(nèi)外尚未見報道。為此,本試驗中以紅鰭東方鲀?yōu)檠芯繉ο?利用正交試驗設(shè)計方法,篩選出誘導(dǎo)雄核發(fā)育單倍體的最佳條件,旨在為進(jìn)一步研究誘導(dǎo)紅鰭東方鲀雄核發(fā)育二倍體奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2015年在大連市天正實業(yè)集團(tuán)唐山嘴東養(yǎng)殖場進(jìn)行,僅用1對親本。鰭東方鲀父本體長為38.4 cm,體質(zhì)量為2.4 kg;母本體長為41.7 cm,體質(zhì)量為2.7 kg。

1.2 方法

1.2.1 催產(chǎn)及授精挑選性腺發(fā)育良好的個體為親本,提前24 h注射絨毛膜促性腺激素(HCG)進(jìn)行催產(chǎn)(雌魚2500~3000 IU/kg,雄魚用量減半),24 h后兩手用力擠壓腹部兩側(cè),將卵收集于搪瓷盆中。將雄魚生殖孔朝上,用毛巾擦干,輕壓生殖孔前方兩側(cè),將精液擠到卵上,順時針晃動搪瓷盆使精卵充分接觸,加入海水激活精子,進(jìn)行人工授精。

1.2.2 正交試驗設(shè)計正交試驗表選用L9(34)[12]。試驗設(shè)處理溫度、處理持續(xù)時間、處理起始時間3因素3水平(表1)。用直觀分析法獲得決定紅鰭東方鲀雄核發(fā)育單倍體率的主次順序和最優(yōu)組合。

表1 正交試驗因素水平表Tab.1Factor and level table in an orthogonal test

1.2.3 單倍體誘導(dǎo)在受精后的2、5、8 min分別將受精卵放入0、2、4益低溫水中,持續(xù)時間為30、45、60 min,冷休克解除后將受精卵放到常溫水中進(jìn)行孵化。

1.2.4 倍性鑒定采用染色體計數(shù)法進(jìn)行倍性鑒定。當(dāng)受精卵發(fā)育到眼點出現(xiàn)時,去除卵膜和卵黃,用0.0025%的秋水仙素處理45 min,用0.8%的檸檬酸低滲20 min,再用預(yù)冷的卡諾固定液(甲醇頤冰醋酸=3頤1)固定3次,每1次15~20 min,最后更換新的固定液于-20益下冷凍過夜。次日冷滴片,用10%的吉姆薩染色,風(fēng)干,鏡檢,拍照。

1.2.5 微衛(wèi)星分析在單倍體率最高的處理組(第7處理組)隨機選取30個已固定好的樣品。使用F0080與F0094兩對微衛(wèi)星引物[13]進(jìn)行分析(表2),引物合成和微衛(wèi)星分析委托上海生工生物工程有限公司完成。

表2 微衛(wèi)星引物序列Tab.2Sequence of the m icrosatellite primers used in the expriment

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計當(dāng)眼點出現(xiàn)后統(tǒng)計受精率,即受精卵數(shù)占總卵數(shù)的百分比。孵化前期時統(tǒng)計孵化率,即孵化苗數(shù)占受精卵數(shù)的百分比。開口攝食時統(tǒng)計成活率,即成活胚胎數(shù)占總受精卵數(shù)的百分比。使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行Student蒺s-test顯著性檢驗,著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 倍性分析

通過染色體計數(shù)法對正交試驗1~9組(表3)單個胚胎(30個/組)的倍性進(jìn)行了分析,結(jié)果表明,雄核發(fā)育單倍體染色體數(shù)目為n=22(圖1-A),正常二倍體染色體數(shù)目為2n=44(圖1-B)。雄核發(fā)育單倍體率最高的是第7和第9處理組,單倍體率分別為86.7%和80.0%(圖2-H、J),同時在第1、2、3、4、5、6、8處理組發(fā)現(xiàn)頻率不同的三倍體(圖2-B~G、I)。

2.2 正交試驗分析

圖1 紅鰭東方鲀胚胎染色體中期分裂相Fig.1The metaphase division phase of chromosomesin embryos in red fin puffer Takifugu rubripes

圖2 正交試驗各組胚胎染色體數(shù)目分布頻率(n=30)Fig.2Distribution frequency of chromosome number in embryos in each group during the orthogonal test(n=30)

正交試驗結(jié)果見表3。以單倍體率為指標(biāo),極差分析結(jié)果表明,雄核發(fā)育3因素的主次順序為溫度>起始時間>持續(xù)時間(表3)。由圖3可知,A和C兩圖中,折線的陡度較大,也說明處理溫度和處理起始時間兩因素對雄核發(fā)育單倍體的效應(yīng)較大,即為主要因素,其次為處理持續(xù)時間因素。根據(jù)表3分析,正交試驗最優(yōu)組合為A3B3C3,即獲得的最優(yōu)水平組合為溫度4益、持續(xù)時間60 min、起始時間8 min。

表3 正交試驗設(shè)計及試驗結(jié)果Tab.3Design and results in the orthogonal test

圖33 因素不同水平對雄核發(fā)育單倍體誘導(dǎo)率的效應(yīng)Fig.3Effects of the three factors and different levels on diploid rate

2.3 微衛(wèi)星分析

采用篩選獲得的兩對多態(tài)性微衛(wèi)星引物對雄核發(fā)育單倍體率較高的第7處理組(86.7%)、親本和對照組進(jìn)行了微衛(wèi)星分析。結(jié)果顯示(表4):引物F0080母本基因型為A型,父本基因型為B/ C型,雄核發(fā)育組后代基因型有二倍體A/B型、A/C型及單倍體B型、C型;在引物F0094的微衛(wèi)星標(biāo)記中,父本基因型為A型,母本基因型為B型,雄核發(fā)育后代基因型為二倍體A/B型、單倍體A型。說明雄核發(fā)育組單倍體個體所攜帶的基因全部來自父本,未有母本基因的表達(dá)。進(jìn)一步從分子水平上說明雄核發(fā)育處理后遺傳物質(zhì)減半,后代與正常受精的對照組不同,是遺傳物質(zhì)來父本具有1套染色體組的單倍體。

表4 個體數(shù)量、父母本基因型及其雄核發(fā)育群體中的雄核發(fā)育子代Tab.4The individual number,genotype of parents and and rogenesis offsping in the androgenesis populations

3 討論

3.1 冷休克誘導(dǎo)雄核發(fā)育

雄核發(fā)育是生產(chǎn)魚類全雄苗種的重要途徑。雄核發(fā)育(Androgenesis)是指遺傳失活的卵子與精子受精,產(chǎn)生的后代僅含有父本遺傳物質(zhì)個體的繁殖方式[14]。魚類誘導(dǎo)雄核發(fā)育的方法主要有兩個步驟,首先卵細(xì)胞染色體遺傳失活;然后精子染色體加倍。關(guān)鍵技術(shù)是卵細(xì)胞染色體的遺傳失活。常用方法有紫外線(UV)、酌射線、胤射線等,雖然這些方法簡單易行,但射線法不僅使卵子細(xì)胞核破壞,同時可使細(xì)胞質(zhì)和一些細(xì)胞器也遭到破壞,從而使胚胎不能正常發(fā)育,導(dǎo)致成活率極低。因此,無需射線照射便能產(chǎn)生雄核發(fā)育個體已成為迫切需要解決的問題。

不用射線照射僅讓受精卵在高溫或低溫環(huán)境刺激下產(chǎn)生雄核發(fā)育的方法目前國內(nèi)外鮮有報道。最早Gervai等[15]利用冷休克方法除獲得三倍體外,也獲得大量的雄核發(fā)育單倍體胚胎。Ueda[16]研究發(fā)現(xiàn),在虹鱒受精后30 s或3.5 h后用熱休克(30益,7 min)可獲得少量的雄核發(fā)育二倍體個體。近年來,日本學(xué)者M(jìn)orishima等[17]報道了泥鰍Mis-gurnus anguillicaudatus受精后利用3益低溫水處理受精卵60 min,能誘導(dǎo)產(chǎn)生雄核發(fā)育后代。Hou等[18]進(jìn)行了人工四倍體泥鰍產(chǎn)生雄核發(fā)育二倍體的研究。王玉生等[19]報道了大鱗副泥鰍受精卵在3益冰水中處理60 min,可產(chǎn)生雄核發(fā)育單倍體,其細(xì)胞學(xué)機制與Morishima等[17]報道的相一致,即卵核與第二極體一同釋放;林忠喬[20]等報道了自然四倍體泥鰍受精卵在3益冰水中處理60 min,可誘導(dǎo)雄核發(fā)育二倍體,這樣可以省去精子染色體的加倍,從而提高成活率。Hou等[21]報道了斑馬魚受精卵在7益水中處理30 min時單倍率最高,并得到克隆二倍體個體。本研究中發(fā)現(xiàn),紅鰭東方鲀在受精后8 min,用4益低溫水處理30 min,可高頻率誘導(dǎo)雄核發(fā)育單倍體(單倍體率86.7%),受精后5 min,用4益低溫水處理60 min也可高頻率誘導(dǎo)雄核發(fā)育單倍體(單倍體率80.0%)。利用冷休克誘導(dǎo)雄核發(fā)育能否成功的關(guān)鍵因素是冷休克處理溫度、處理起始時間和處理持續(xù)時間這三大要素。而這些要素水平最佳組合的篩選又是提高誘導(dǎo)率的關(guān)鍵。因此,本研究中利用正交試驗,篩選出誘導(dǎo)紅鰭東方鲀雄核發(fā)育單倍體最佳組合為受精后8 min、處理溫度4益、處理時間60 min。與以往報道的受精后即刻放入低溫水中處理有所不同,原因可能是紅鰭東方鲀卵膜厚,胚胎發(fā)育緩慢所致,也就是說紅鰭東方鲀在受精后8 min第二極體未釋放。本研究中還發(fā)現(xiàn),經(jīng)低溫處理后,一種情況是第二極體與卵核一同釋放,這種情況可形成無核卵,精核繼續(xù)發(fā)育形成雄核發(fā)育單倍體;另一種情況是第二極體被抑制,形成三倍體。關(guān)于何種情況下第二極體被抑制,何種情況與卵核一同釋放,其機制是什么,都有待于今后繼續(xù)研究。

3.2 雄核發(fā)育后代的性別

人工誘導(dǎo)雄核發(fā)育二倍體途徑有以下幾種。(1)通過抑制第一次卵裂的方法獲得:Corley-Smith等[22]、趙振山等[23]、Nam等[24]、Brown等[25]和Kirankumar等[26]分別利用熱休克法阻止了斑馬魚、大鱗副泥鰍、泥鰍、虹鱒和六帶鲃的第一次卵裂,獲得了雄核發(fā)育二倍體。Parsons等[27]、Scheerer等[28]利用靜水壓抑制第一次卵裂獲得了虹鱒雄核二倍體個體。但是,通常這些雄核發(fā)育二倍體的成活率都很低;(2)通過融合兩個精子與失活的卵子受精獲得雄核發(fā)育二倍體:Araki等[29]用含有85 mmol/L CaCl2的人工精漿融合虹鱒精子,然后使其與用酌射線失活的卵子受精,孵化出0.11%的雄核發(fā)育二倍體;(3)利用四倍體得到的二倍體精子與遺傳失活卵受精的方法獲得雄核發(fā)育二倍,如Thorgaard等[30]和Arai等[31]使用從四倍體得到的二倍體精子與遺傳失活卵受精,分別獲得了虹鱒和泥鰍的雄核發(fā)育二倍體。林忠喬等[20]報道了利用自然四倍體泥鰍產(chǎn)生的二倍體精子與在3益冰水中處理60 min的卵子受精,可誘導(dǎo)雄核發(fā)育二倍體。對于雄性異型魚類的雄核發(fā)育二倍體,理論上XX雌和YY雄(超雄)以1頤1的比例分離[32]。Kikuchi等[2]根據(jù)基因組連鎖分析,進(jìn)一步確定紅鰭東方鲀性別決定機制為XX/XY型,且性別決定基因位于19號連鎖群的單一區(qū)域。本研究中獲得的紅鰭東方鲀雄核發(fā)育單倍體一種是含有來源于父本的X染色體,經(jīng)染色體加倍后形成雌性個體(XX),另一種是含有來源于父本的Y染色體,經(jīng)染色體加倍后形成超雄個體(YY)。因此,對于紅鰭東方鲀,雄核發(fā)育后代并非都是雄性后代,雌頤雄=1頤1。本研究結(jié)果顯示,單倍體率最高可達(dá)86.7%,說明有43.4%的個體含有Y染色體。因為只有獲得含有Y染色體的單倍體,加倍后才能獲得YY超雄魚。YY超雄魚與正常雌魚(XX)雜交可獲得100%的雄魚。

本研究結(jié)果表明,無需用射線使卵子失活,僅用冷休克方法,可以成功誘導(dǎo)紅鰭東方鲀雄核發(fā)育單倍體,雄核發(fā)育單倍體率高達(dá)86.7%。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究誘導(dǎo)紅鰭東方鲀雄核發(fā)育二倍體奠定了理論基礎(chǔ)。

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Optim ization of inducing conditions for cold shocked androgenetic haploid in red fin puffer Takifugu rubripes

ZHOU He,ZHANG Rui,XU Qi-zheng,MA Tian-yu,JIANG Zhen-hua, ZHUANG Zi-xin,GAO Jun,JIANG Zhi-qiang,LIYa-juan
(Key Laboratory ofMarine Bio-resources Sustainable Utilization in Liaoning Province蒺s University,Key Laboratory ofMariculture&Stock Enhancement in North China蒺s Sea,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

In a three factor and three level orthogonal experiment L9(34),fertilized eggs of redfin puffer Takifugu rubripes were exposed to water temperature of 0,2,and 4益(A)for 30,45,and 60 min(B),and initial treat-ment time of2,5,and 8 min(C)in order to explore amethod of inducing androgenetic haploid of redfin puffer by cold shocked without inactivation.Then the chromosome number was counted in one embryo and microsatellite a-nalysis was performed in the offspring.The results showed that themaximal haploid ratewas observed in the embry-os 8min after fertilization treated at4益for30min(86.7%)and 5min after fertilization treated at4益for60min (80.0%).The intuitive analysis revealed that the optimal inducing androgenetic haploid was conducted under con-ditions of 8 min after fertilization at4益for 60 min with initial treatment time of8 min.The order of three factors influencing androgenetic haploid was expressed as treatment temperature>treatment initial time>treatment duration. Themicrosatellite analysis showed that the genes of androgenetic offspringswere all derived from male redfin puffer. The findings indicate that the redfin puffer had androgenetic haploid rate of 86.7%by cold shock treatment,and that lay the foundation for the further study of redfin puffer androgenetic diploid.

Takifugu rubripes;cold shock;androgenetic;haploid;orthogonal experiment

S965.1

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.03.010

2095-1388(2017)03-0316-07

2017-03-29

國家自然科學(xué)基金資助項目(41606178);遼寧省博士科研啟動基金資助項目(201501185);遼寧省教育廳重點實驗室基礎(chǔ)研究項目(LZ2015010)

周賀(1985—),女,博士。E-mail:zhouhe@dlou.edu.cn

李雅娟(1961—),女,博士,教授。E-mail:liyajuan@dlou.edu.cn