陳小敏,陳 勇,吳海冰,辜運(yùn)富

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源學(xué)院，成都 溫江 611130)

四川12株野生靈芝遺傳多樣性的ISSR分析

陳小敏,陳 勇,吳海冰,辜運(yùn)富*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源學(xué)院，成都 溫江 611130)

目前靈芝生產(chǎn)菌種品性退化，故野生靈芝資源的篩選評價對于選育優(yōu)質(zhì)新品種具有重要意義。本研究從四川采集12株野生靈芝，采用苯酚-硫酸法、香草醛-高氯酸顯色法測定了子實體多糖和總?cè)坪?，并進(jìn)一步采用ISSR(inter-simple sequence repeat)和ITS(internal transcribed spacer)分子技術(shù)分析它們的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育特征。表明：SICAU-12子實體多糖含量、SICAU-5子實體總?cè)坪棵黠@高于其它菌株子實體。ISSR聚類分析顯示出供試菌株的總體相似性為0.52，相似系數(shù)為0.54時聚為兩大類群；系統(tǒng)發(fā)育樹將供試野生靈芝分為赤芝(Ganoderma Lucidum)和紫芝(Ganoderma Sinense)兩大類群。四川收集的野生靈芝菌株具有較為明顯的遺傳多樣性；SICAU-12多糖含量高、SICAU-5總?cè)坪扛?，具有潛在?yīng)用價值。

四川野生靈芝；多糖；總?cè)?；遺傳多樣性

靈芝隸屬于真菌界(Kingdom Fungi)，擔(dān)子菌門(Basidiomycota)，擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)，靈芝目(Ganodermatales)，靈芝科(Ganodermataceae)，有“仙草”、“瑞草”等稱呼，主要活性成分為多糖、三萜化合物等，具有抗癌、抗腫瘤、保肝解毒等方面的作用[1-3]。目前，人工栽培靈芝規(guī)模逐漸擴(kuò)大，生產(chǎn)栽培方式呈多樣化，但是栽培效益每況愈下。由于長期引種和環(huán)境因素的影響，導(dǎo)致靈芝菌種品性退化、名稱混雜[4]。菌種是靈芝產(chǎn)量低下、品質(zhì)難于控制的關(guān)鍵問題[5]，靈芝產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展依賴于優(yōu)質(zhì)靈芝新品種的選育。野生靈芝作為雜交育種的基礎(chǔ)材料，挖掘野生資源并對其進(jìn)行基礎(chǔ)研究具有十分重要的意義。野生靈芝的形態(tài)特征易受到野外環(huán)境的脅迫，形成了多樣化的表型特征，僅靠形態(tài)學(xué)特征難以真正鑒定靈芝菌種[6-7]，所以科學(xué)準(zhǔn)確地鑒定野生靈芝菌株的遺傳特性顯得尤為重要。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，人們開始從分子遺傳水平上認(rèn)識物種的遺傳特性，目前ITS和ISSR這兩種分子技術(shù)已廣泛用于探討真菌種內(nèi)變異和屬內(nèi)種間的親緣關(guān)系。真核生物rDNA的ITS區(qū)段保守性強(qiáng)且具有特異性[8-10]，張肖雅[11]等人采用ITS分子技術(shù)對11株靈芝菌株進(jìn)行了鑒定分析。ISSR[12]分子標(biāo)記技術(shù)穩(wěn)定、簡便、多態(tài)性豐富，在研究菌株遺傳多樣性上具有優(yōu)越性，被廣泛用于大型食用真菌的遺傳多樣性研究[13]。四川氣候類型多變，擁有豐富的林木資源，靈芝資源豐富。本文利用ISSR分子標(biāo)記、ITS測序技術(shù)對12株四川野生靈芝進(jìn)行遺傳多樣性分析，并結(jié)合子實體多糖和總?cè)坪康戎笜?biāo)來綜合評價收集到的野生靈芝的多樣性及應(yīng)用價值，以期為豐富靈芝資源庫，選育高活性成分的優(yōu)質(zhì)靈芝新品種及科學(xué)管理靈芝菌種提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試野生菌株12株，采自四川攀枝花市、峨眉山市、樂山市等地(見表1)。

1.2 靈芝子實體多糖測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備[14]：無水葡萄糖60℃烘干至恒重，精確稱取0.10g，加水定容至100mL。分別吸取0、20、60、100、160、200、300μL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，水補(bǔ)足至2mL，各加入1mL5%的苯酚溶液和5mL濃硫酸，室溫下反應(yīng)30min，490nm處比色測定其吸光度。將采集到的成熟子實體60℃烘干至恒重，粉碎過60目篩。精確稱取0.50g，加50mL超純水，沸水回流2h后過濾。取濾液加入無水乙醇至終濃度為75%，低溫醇沉過夜，Sevage試劑(氯仿/正丁醇5∶1)去蛋白。吸取上清液，各加入1mL 5%的苯酚溶液和5mL濃硫酸，室溫下反應(yīng)30min，490nm處測定吸光度。

表1 供試菌株

1.3 靈芝子實體總?cè)茰y定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備[14]：準(zhǔn)確稱取10mg齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，氯仿溶解定容至100mL。分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，100℃水浴蒸干溶劑，加0.3mL5%香草醛-冰醋酸，1.4mLHClO4，混勻，60℃水浴20min，冰水浴冷卻，加5mL冰醋酸，混勻后548nm處測吸光度。精密稱取子實體樣品2g于100mL容量瓶中，加入氯仿超聲30min后過濾。吸取濾液1mL，100℃水浴蒸干溶劑，加0.3mL5%香草醛-冰醋酸，1.4mLHClO4，混勻，60℃水浴20min，冰水浴冷卻，加5mL冰醋酸，混勻后548nm處測吸光度。

1.4 菌種分離

用75%乙醇對野生靈芝表面進(jìn)行消毒，無菌環(huán)境下取黃豆大小菌肉于PDA斜面培養(yǎng)基中，25℃避光培養(yǎng)5～8d，菌種純化后即得野生靈芝菌株。

1.5 DNA的提取及ISSR擴(kuò)增

挑取斜面培養(yǎng)基表面生長旺盛的菌絲，液氮研磨，按照Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工Sangon Biotech)給定的步驟進(jìn)行操作，提取出的DNA于-20℃保存?zhèn)溆?。在前期的試驗中，選用引物P1-P49進(jìn)行ISSR擴(kuò)增，結(jié)果表明引物P8(5'-GGAGGAGGAGGAGGA-3')擴(kuò)增效果最佳，譜帶穩(wěn)定、清晰、多態(tài)性豐富。反應(yīng)體系為20μL：2×Taq PCR Master Mix 10μL (TIANGEN)、DNA模板1μL(10ng.μL-1)、引物P8 2μL(10μmol.L-1)，ddH2O補(bǔ)齊至20μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性2min；94℃變性1min，52℃復(fù)性1min，65℃延伸8min，30個循環(huán)；65℃最終延伸16min；4℃終止反應(yīng)。取PCR產(chǎn)物8μL在含EB的2%瓊脂糖凝膠上水平電泳檢測，80V/cm電泳90min，以DNA MarkerDL2000作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，自動凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測。根據(jù)ISSR擴(kuò)增出的譜帶圖，將同一位置條帶出現(xiàn)與否記為1、0，構(gòu)建數(shù)字化矩陣，用軟件NTSYSpc2.1進(jìn)行遺傳聚類分析[15]。

1.6 ITS測序

用通用引物ITS1和ITS4對12個靈芝菌株ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增[16]。反應(yīng)體系為50μL：2×Taq PCR Master Mix25μL(TIANGEN)、引物ITS1/ITS4各0.5μL(10μmol.L-1)、DNA模板1μL(10ng.μL-1)，加ddH2O補(bǔ)齊至50μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，32個循環(huán)；72℃最終延伸1min；10℃終止反應(yīng)。取PCR產(chǎn)物3μL在含EB的1%瓊脂糖凝膠上水平電泳檢測，120V/cm電泳20min，以DNA MarkerDL2000作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，自動凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測。將其產(chǎn)物交由擎科生物技術(shù)有限公司(成都)完成測序，向NCBI提交供試菌株的ITS序列，獲得序列號：KX262896-KX262907。

1.7 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)基礎(chǔ)處理，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析由SPSS 20完成。利用NTSYSpc2.1構(gòu)建基于ISSR分析的聚類圖譜，利用MEGA5的Neighbor-Joining tree程序構(gòu)建基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝子實體多糖和總?cè)坪?/p>

供試靈芝子實體多糖和總?cè)坪咳绫?所示。由表2可知，SICAU-12子實體的多糖含量顯著高于其他靈芝菌株子實體，為1.37%，SICAU-8子實體多糖含量最低，為0.72%，SICAU-7、SICAU-12兩個菌株的子實體多糖含量顯著高于其它菌株。由表2可以看出，不同靈芝子實體總?cè)坪坑兄黠@的差異，SICAU-5含量最高，為1.37%，SICAU-4的含量最低，僅為0.43%。

表2 不同靈芝菌株子實體多糖、總?cè)坪?/p>

注：小寫字母a-i表示95%置信度的顯著性差異

2.2 ISSR聚類分析

ISSR-PCR擴(kuò)增出的條帶大小在2000bp～100bp之間，聚類圖譜如圖1所示。由圖1可知，供試的12個靈芝菌株總體相似性為0.52，具有明顯的遺傳多樣性。遺傳相似系數(shù)小于0.52時，所有的菌株都聚為一類；在0.54的相似系數(shù)水平上，供試菌株聚為2大類群，SICAU-1、SICAU-4、SICAU-5、SICAU-6、SICAU-7和SICAU-10 等6個菌株聚為一類，其余6個菌株聚為一類。SICAU-1和SICAU-10的遺傳相似系數(shù)高達(dá)0.96，兩者的遺傳關(guān)系最近；SICAU-6和SICAU-9的遺傳關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖1 供試靈芝菌株的ISSR聚類分析

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹

將測序得到的12個靈芝菌株ITS序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對，選擇匹配度最高的參比菌株(如圖2所示)，對12個供試菌株和6個GenBank參比序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

圖2 供試菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，加粗為供試菌株

由圖2可知，與供試靈芝菌株相似性高的為Ganoderma Lucidum(赤芝)和Ganoderma Sinense(紫芝)。供試12個野生靈芝菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹主要分為兩個大支，菌株SICAU-1、SICAU-2、SICAU-3、SICAU-6、SICAU-10、SICAU-11、SICAU-12與赤芝(Ganoderma lucidum，GU213476、GU213478、EF188277)聚在一個大群中。菌株SICAU-4、SICAU-5、SICAU-7、SICAU-8和SICAU-9等5個菌株與紫芝(Ganoderma sinense，HQ235633、DQ424982、DQ425014)聚在第二個群中。

3 討論

本試驗測定了四川不同地區(qū)采集的12株野生靈芝子實體多糖和總?cè)坪?，靈芝多糖和三萜類化合物是靈芝主要的活性物質(zhì)，起著關(guān)鍵藥效作用[17-18]。供試靈芝菌株子實體多糖含量在0.72%～1.37%范圍之間，總?cè)坪吭?.43%～1.37%之間，采集的四川地區(qū)野生靈芝子實體的多糖和總?cè)坪坑兄黠@的差異性，SICAU-12子實體多糖含量、SICAU-5總?cè)坪孔罡?。付立忠等人分析與評價12 個靈芝品種的子實體多糖和三萜含量，多糖含量為0.75%～1.16%，三萜含量為0.41%～1.19%[14]。對比前人研究結(jié)果，菌株SICAU～7、SICAU-12子實體多糖含量及SICAU-5三萜含量更高，說明這3株野生靈芝在藥效方面上更具潛在的應(yīng)用價值。

靈芝的生長易受到野外環(huán)境的影響，造成靈芝形態(tài)特征的多樣性，因此傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類法不能有效區(qū)分野生靈芝菌株。分子生物學(xué)的發(fā)展，推動了分子標(biāo)記法在菌株鑒定上的應(yīng)用。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)自1994年由Ziekiewicz提出以來，廣泛用于食用菌遺傳多樣性[19-20]和菌株的鑒定鑒別[21-22]。不同的靈芝菌株的DNA序列存在差異，在ISSR-PCR擴(kuò)增時DNA序列與引物結(jié)合，不同菌株就會出現(xiàn)獨(dú)特的ISSR條帶，因此，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)能反應(yīng)出供試菌株間的遺傳多樣性。在本試驗中，供試野生靈芝菌株的ISSR電泳圖譜具有明顯的差異性，聚類分析顯示出相似系數(shù)小于0.52時，供試菌株聚為一類，相似系數(shù)為0.54時，聚類兩大類群，說明供試12株靈芝菌株間表現(xiàn)出明顯的遺傳多樣性。

近年來，研究人員采用DNA序列分析研究微生物的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)，食用菌的DNA序列研究集中在rDNA上，基于ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹是目前研究食用菌種間、種內(nèi)水平差異的主要分子手段[23-24]。本研究中基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹將供試菌株分為赤芝和紫芝兩大類群，這與相似系數(shù)為0.54的ISSR聚類分析結(jié)果相似。SICAU-1、SICAU-2、SICAU-3、SICAU-6、SICAU-10、SICAU-11和SICAU-12與赤芝聚在一個大群中；SICAU-4、SICAU-5、SICAU-7、SICAU-8和SICAU-9與紫芝聚在另一個大群中。

綜上所述，本研究運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記和ITS測序?qū)λ拇ú煌貐^(qū)收集到的12株野生靈芝菌株進(jìn)行遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育分析，同時測定了這些野生資源的多糖和三萜化合物含量。結(jié)果表明，供試四川野生靈芝菌株具有明顯的遺傳多樣性；SICAU-12多糖含量、SICAU-5總?cè)坪扛?，且二者的遺傳關(guān)系遠(yuǎn)，可作為潛在高活性物質(zhì)的靈芝新品種雜交親本。

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2017-03-18

四川省“十三五”育種攻關(guān)項目資助(2016NYZ0040)

陳小敏(1992- )，女，四川什邡人，碩士研究生，研究方向為食用菌品種選育。*為通訊作者。