吉力爾鬼，乃古沙黑，杜家明，余仲東

(1.布拖縣林業(yè)局，四川 布拖616350；2.通江縣林業(yè)局，四川 通江 621055；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

小葉楊葉片內(nèi)生菌Botryospaeriadothidea對(duì)楊樹枝干致病性研究

吉力爾鬼1，乃古沙黑1，杜家明2，余仲東3,*

(1.布拖縣林業(yè)局，四川 布拖616350；2.通江縣林業(yè)局，四川 通江 621055；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

Botryospaeria屬真菌引起的潰瘍病是危害樹木較嚴(yán)重的病害之一，在世界各地造成了嚴(yán)重的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)后果。本文在分離陜西省內(nèi)兩個(gè)不同地域小葉楊葉片內(nèi)生菌的過程中，得到大量的Botryospaeria菌株，通過培養(yǎng)特征和形態(tài)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，葉片內(nèi)生菌Botryospaeria菌株和樹干分離的楊樹潰瘍病菌B.dothidea無明顯差別。內(nèi)生菌B.dothidea是寶雞地區(qū)的優(yōu)勢(shì)菌株，且只出現(xiàn)在早春時(shí)節(jié)。采用人工打孔接種法，將葉片內(nèi)生Botryospaeria回接到三倍體毛白楊2年生枝條上發(fā)現(xiàn)，葉片內(nèi)生葡萄座腔菌對(duì)枝條具有明顯的致病性，但相比枝干上分離的潰瘍病菌B.dothidea菌株，其致病性要弱。

小葉楊;潰瘍?。籅otryospaeria；內(nèi)生菌

Botryospaeria屬真菌是全球分布的病原真菌，寄主范圍十分廣泛，可為害多種針葉樹和闊葉樹。針葉樹中的杉木屬、落葉松屬、松屬、雪松屬、北美紅杉屬、刺柏屬、柏木屬和鐵杉屬等11個(gè)屬可被侵染，而該屬真菌侵染的闊葉樹達(dá)40 屬之多，其中楊樹被害患病的情況居多[1]。通常，Botryospaeria屬真菌為害林木枝干及果實(shí)，引起枝枯、潰瘍、流膠和果腐等，如楊樹水泡型潰瘍病,蘋果干腐病、輪紋病,桃梅等核果類果樹流膠病等[2]，然而在小葉楊健康葉片的分離中，我們分離到大量的枝干病原物，如Botryospaeria、Cytospora、Phompsis、Thielavia等屬傳統(tǒng)樹木潰瘍病菌。為探明它們的生態(tài)學(xué)功能及與枝干潰瘍病菌在形態(tài)和致病性上的異同點(diǎn)，我們以Botryospaeriaspp.為材料，比較分析了葉片內(nèi)生Botryospaeria真菌(簡(jiǎn)稱EB)和枝干潰瘍病菌(簡(jiǎn)稱CB)在形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)上的差異，及它們對(duì)三倍體毛白楊2 a生枝條的致病性的差異。

1 材料和方法

1.1 樣品采集與分離

2013年春季和秋季分別在鳳縣南鳳，太白縣的鸚鴿桃川、石灰廠，榆林榆陽區(qū)的無定河、青云、紅山等地設(shè)點(diǎn)，每點(diǎn)4～5棵樹，分別從樹冠的東南西北4個(gè)方向采集小葉楊(Populussimonii)健康葉片，標(biāo)記采集地點(diǎn)，時(shí)間等，裝入塑封袋，冰盒保存，帶回實(shí)驗(yàn)室分離。首先將表面消毒后的葉片接種到PDA培養(yǎng)基上，編號(hào)后在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，并定期觀察菌落生長(zhǎng)情況、生長(zhǎng)特征等，對(duì)細(xì)菌污染的葉片進(jìn)行重新接種。每個(gè)方向接種2個(gè)葉片，8個(gè)重復(fù)。消毒方法為：1%次氯酸鈉消毒2 min后，無菌水漂洗2次，每次1 min。以某種或某一類內(nèi)生真菌的菌株數(shù)量占分離到總菌株數(shù)量的百分比(相對(duì)分離率 RF)，來反映不同種類的內(nèi)生真菌在總菌群中所占據(jù)的優(yōu)勢(shì)程度。

1.2Botyosphaeria篩選及鑒別

根據(jù)培養(yǎng)形態(tài)特征，挑選純化可能的Botryosphaeria菌落。待菌落形成子實(shí)體后，依據(jù)形態(tài)學(xué)特征確定Botryosphaeria菌株并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3Botryosphaeria致病性測(cè)定

取2 a生大小均勻的三倍體毛白楊枝條，截成長(zhǎng)12 cm 枝條，頂端用蠟封后置燒杯中水培5～7 d，以確定枝條生命力是否旺盛。將培養(yǎng)好的Botryosphaeria菌株P(guān)DA菌落用直徑0.5 cm的大孔器打菌餅進(jìn)行人工接種，用封口膜密封。每個(gè)枝條3個(gè)接種孔，2個(gè)接菌餅，另一個(gè)(在相對(duì)一面)接無菌的PDA。以分離自青楊上的楊樹潰瘍病菌Botryosphaeriadothidea(來自大連，編號(hào)NW2011-003)為對(duì)照，接種方法同前。在25 ℃ 的溫室中光照培養(yǎng)15 d，用游標(biāo)卡尺測(cè)量病斑大小，取均值進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生菌的分離情況

在地理氣候迥異的6個(gè)采集點(diǎn)中，從葉片中共分離內(nèi)生真菌1 160株，隸屬3目、11科、35屬。其中在太白鸚鴿的優(yōu)勢(shì)菌群為交鏈孢屬(Alternariasp.，RF=18.55%)、單隔孢屬(Ulocladiumsp.，RF=31.44%)、莖點(diǎn)霉屬(Phomasp. ，RF=17.01%)；桃川的優(yōu)勢(shì)菌群有交鏈孢屬(Alternariasp.， RF=21.05%)、單隔孢屬(Ulocladiumsp.，RF=17.54%)、莖點(diǎn)霉屬(Phomasp. ，RF=11.11%)、毛殼菌屬(Chaetomiumsp. ，RF=11.70%)、梭孢殼屬(Thielaviasp. ，RF=10.53%)；鳳縣南鳳優(yōu)勢(shì)菌群有交鏈孢屬(Alternariasp. ，RF=13.83%)、單隔孢屬(Ulocladiumsp. ，RF=14.36%)、枝孢霉屬(Cladosporium.sp. ，RF=14.11%)、擬莖點(diǎn)霉屬(Phomopsissp. ，RF=14.36%)；榆林紅山優(yōu)勢(shì)菌群為交鏈孢屬(Alternariasp.， RF=24.06%)、單隔孢屬(Ulocladiumsp. ，RF=10.38%)、莖點(diǎn)霉屬(Phomasp. ，RF=32.08%)、殼蕉孢屬(Cytosporasp. ，RF=10.38%)；青云優(yōu)勢(shì)菌群為交鏈孢屬(Alternariasp. ，RF=30.97%)、單隔孢屬(Ulocladiumsp.，RF=12.26%)、殼蕉孢屬(Cytosporasp.， RF=14.84%)；無定河的優(yōu)勢(shì)菌群為交鏈孢屬(Alternariasp.， RF=37.92%)、單隔孢屬(Ulocladiumsp. ，RF=34.17%)。

Botryosphaeria屬真菌僅在4月份寶雞的鳳縣南鳳和太白縣桃川、石灰廠楊樹上分離到。在全部分離樣點(diǎn)中，Botryosphaeria菌株相對(duì)分離率RF=1.03%；但在寶雞的3個(gè)分離點(diǎn)中RF=4.62% ，屬于優(yōu)勢(shì)菌群。陜北榆林的青云、紅山、無定河沒有分離到。Botryosphaeria屬菌株標(biāo)記為SHC-1-E2-2(2)、SHC-4-W1-2(2)、TC-2-E2-1(1)、FN-1-E2-1(1)、FN-2-N2-1(1)、TC-4-W2-4(1)、FN-4-N1-1(1 )、FN-4-E1-1(2)、FN-4-W1-1(1)，所有菌株均保存在西北農(nóng)林科技大學(xué)森林病理室。從培養(yǎng)特征和分生孢子形態(tài)特征和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)看，所有的Botryosphaeria菌株可能為同于一個(gè)種，即葡萄座腔菌Botryosphaeriadothidea。

在空間上，Botryosphaeriadothidea的發(fā)生與地理環(huán)境密切相關(guān)，寶雞地區(qū)相對(duì)榆林地區(qū)來講，降雨量和空氣濕度有明顯的差異，可能是影響B(tài).dothidea分布的主要原因。在時(shí)間上，內(nèi)生Botryosphaeria屬菌株只出現(xiàn)在4月至5月中旬，說明小葉楊葉片中葡萄座腔菌菌落很可能來自該菌越冬后子囊孢子的侵染。其定殖機(jī)理需進(jìn)一步研究。

2.2Botryosphaeria菌株致病性測(cè)定結(jié)果

小葉楊葉片內(nèi)生Botryosphaeriadothidea接種三倍體毛白楊都能導(dǎo)致枝條形成明顯的潰瘍擴(kuò)展斑，而且各菌株致病性幾乎相似。與枝干潰瘍病菌B.dothudea接種結(jié)果比較，內(nèi)生葡萄座腔菌的致病性相對(duì)較弱，病斑擴(kuò)增速度慢，但病斑大小均勻，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差僅0.05; 而潰瘍病菌B.dothidea病斑擴(kuò)增迅速，病斑大，但病斑差異較大，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差5.04。

圖2 Botryosphaeria的人工接種(左：CB；右：CE)

3 結(jié)論與討論

小葉楊葉片內(nèi)生葡萄座腔菌Botryosphaeriadothidea的發(fā)生與濕潤(rùn)的環(huán)境氣候條件有關(guān)。本研究中， 僅在4—5月份的寶雞地區(qū)3個(gè)采集點(diǎn)葉片中分離到，而在其他時(shí)間和地點(diǎn)沒能分離到葉片內(nèi)生葡萄座腔菌。B.dothidea很可能以子囊孢子侵染葉片，葉片周圍濕潤(rùn)的微環(huán)境氣候條件為子囊孢子的成功定值創(chuàng)造了條件。在7—9月材料的分離中，Botryosphaeria主要以無性形態(tài)存在于樹體或環(huán)境中，寶雞地區(qū)的3個(gè)采集點(diǎn)和陜北的3個(gè)采集點(diǎn)都未能分離到，說明Botryosphaeria分生孢子可能很難定植于葉片。葉片內(nèi)生葡萄座腔菌接種抗性較強(qiáng)的三倍體毛白楊實(shí)驗(yàn)表明，該菌仍然具有較強(qiáng)的致病性，但相對(duì)于枝干潰瘍病菌Botryosphaeriadothidea來說，其致病性較弱，其中的原因尚不清楚。

在小葉楊葉片內(nèi)部分離到的內(nèi)生真菌中有許多是多種樹木病原菌例如Cytosporasp.，Botrysphaeriasp.，Valsasp.、Collectotrichumsp.、Phomasp.等，它們可引起許多楊樹潰瘍病、腐爛病、炭疽病等病害。Botrysphaeriaspp.被報(bào)道是許多樹木的內(nèi)生真菌，在全球氣候變化或樹木樹勢(shì)衰退的情況下可以轉(zhuǎn)變成病原菌，引起樹木潰瘍癥狀[3]。病原真菌和內(nèi)生真菌的關(guān)系至今還不是很清楚，植物組織中許多內(nèi)生真菌，在寄主植物的衰老階段，也會(huì)以病原菌的方式出現(xiàn)；有許多學(xué)者認(rèn)為，當(dāng)宿主植物的防御能力與病原菌的致病力達(dá)到一個(gè)平衡的時(shí)候，植物病原菌就不會(huì)表現(xiàn)致病能力，反而是以一種內(nèi)生菌的方式存在的[4]。也有人認(rèn)為環(huán)境條件和氣候特征等因素的改變是這種關(guān)系改變主要誘導(dǎo)因素，在植物處在環(huán)境脅迫的狀態(tài)下，內(nèi)生真菌就會(huì)引起植物變現(xiàn)病害，當(dāng)植物處在適宜的環(huán)境條件下，這種潛在的病原菌可能就會(huì)延遲病害癥狀的出現(xiàn)，以一種內(nèi)生真菌的狀態(tài)存在于植物組織中[5-6]。在全球氣候變化下，研究?jī)?nèi)生菌這種平衡轉(zhuǎn)化關(guān)系對(duì)揭示森林的衰退和次生病蟲害的爆發(fā)有著重要的理論意義，本文研究結(jié)果對(duì)樹干潰瘍病類的侵染和傳播為害方式提供了一個(gè)新的視野。

[1] 吳小芹，何月秋，劉忠華.葡萄座腔菌屬所致樹木潰瘍病發(fā)生與研究進(jìn)展[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2001,25(1):423-430.

[2] 張星耀,趙仕光,呂全等.樹木潰瘍病病原真菌類群分子遺傳多樣性研究II-Bot ryosphaeria 屬28S-DNA-PCR-RFLP 和RAPD 的解析[J].林業(yè)科學(xué),2000,36 (2) :75-81.

[3] Carroll G C．1986．The biology of endophytism in plants with particullosphere[M]．London： Cambridge Press，205-222.

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[5] Arnold A E，Herre E A． Canopy cover and leaf age affect colonization by tropical fungal endophytes：Ecological pattern and process inTheobromacacao[J]．Mycologia，2003,95：388-398.

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EndophyticBotryosphaeriadothideafrom Leaves ofPopulussimoniiPathogenesis to Branch of Poplar

JILI Er-gu1, NAIGU Sha-hei1, DU Jia-ming2, YU Zhong-dong3,*

(1.ButuoForestryBureau,Butuo,Sichuan616350; 2.TongjiangForestryBureau,Tongjiang,Sichuan621055;3.NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100)

Botryosphaeriacanker is one of the most danger disease, causing serious ecologic and economic lost worldwide. In this study, we collected endophyticBotryosphaeriastrains isolated fromPopulussimoniiat Baoji and Yulin, two distinctive geo-ecological locus in Shaanxi Province. Results showed endophyticBotryosphaeriastrains had no significant difference from canker pathogenB.dothideamorphologically. The endophyticBotryosphaeriaspecieres appeared only in the humid area at early spring in Baoji region, and it was one of advantageous endophyte communities ofPopulussimoniiin this region. The pathogenesis of endophyticBotryosphaeriadothideawas so forward checked by inoculation in triploidPopulustomentosae2-year-old cuttings artificially, and showed a positive pathogenesis result. However, this pathogenesis of endophyticB.dothideais weaker than that of canker pathogenicB.dothidea.

Populussimonii; canker;Botryospaeria; endophyte

2016-11-10

國(guó)家自然科學(xué)基金(NO.31670650)。

吉力爾鬼(1978-)，男，四川布拖縣人，林業(yè)工程師,主要從事林業(yè)資源管理工作。

S763.15

A

1001-2117(2017)02-0012-03

*通訊作者