盧 柳 ， 張 軍 ， 周碧君 ， 張 旭 ， 趙夢(mèng)婕 ， 何 娜 ， 王開功 ， 文 明 ， 張 海

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 ， 貴州貴陽(yáng)550025； 2.貴州省六盤水市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 ， 貴州六盤水553001)

牛乳頭狀瘤病診斷及其病毒基因型分析

盧 柳1， 張 軍2， 周碧君1， 張 旭1， 趙夢(mèng)婕1， 何 娜1， 王開功1， 文 明1， 張 海1

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 ， 貴州貴陽(yáng)550025； 2.貴州省六盤水市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 ， 貴州六盤水553001)

對(duì)貴州省晴隆縣某種牛場(chǎng)暴發(fā)的疑似牛乳頭狀腫瘤病進(jìn)行診斷，采用流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀觀察、病理切片觀察、PCR檢測(cè)和分子分型。結(jié)果顯示，該種牛場(chǎng)牛乳頭狀瘤病發(fā)病率為35%(7/20)。瘤體多呈結(jié)節(jié)狀及菜花狀，顏色多呈灰白色。病理切片顯示，瘤體呈現(xiàn)角質(zhì)化過(guò)度和細(xì)胞空泡化現(xiàn)象。遺傳進(jìn)化樹分析顯示，貴州省晴隆縣暴發(fā)的牛乳頭狀腫瘤病是由BPV2型牛乳頭瘤病毒所引起。本研究為貴州地區(qū)牛乳頭狀瘤病的科學(xué)防控提供了一定的理論依據(jù)。

牛乳頭狀瘤 ； 診斷 ； 基因型分析

牛乳頭狀瘤病是由牛乳頭瘤病毒(Bovinepapillamavirus,BPV)引起的一種皮膚或部分黏膜發(fā)生的慢性增生性傳染性疾病，也稱為“牛疣”[1]。牛乳頭狀瘤病于1929年被首次報(bào)道之后，現(xiàn)在在世界各地都廣泛流行并傳播，加拿大、澳大利亞、英國(guó)、美國(guó)和德國(guó)等均有該病的報(bào)道[2]。近兩年在我國(guó)新疆、東北和海南地區(qū)也有該病的報(bào)道[3-4]。牛乳頭狀瘤病是牛常見的良性腫瘤疾病，但嚴(yán)重時(shí)瘤體會(huì)由良性變成惡性腫瘤而引起家畜的死亡，因此會(huì)給養(yǎng)牛場(chǎng)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。根據(jù)最新報(bào)道，BPV可分為14個(gè)基因型[5]，不同基因型的病毒可以引起不同部位的病理變化，且BPV具有很強(qiáng)的種屬特異性，很難感染除宿主以外的其他動(dòng)物[6-7].

近年來(lái)，貴州省不斷從其他地方引進(jìn)優(yōu)良品種牛，牛養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，在發(fā)展養(yǎng)牛業(yè)的同時(shí)也帶來(lái)了本地區(qū)未發(fā)生過(guò)的疾病。2016年1月晴隆縣某種牛場(chǎng)暴發(fā)疑似牛乳頭狀瘤病，通過(guò)對(duì)該種牛場(chǎng)進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，臨床觀察、對(duì)疑似病料進(jìn)行了病理觀察、PCR檢測(cè)和分子分型，為該病在貴州省的科學(xué)防控提供了一定指導(dǎo)。

1 材料

1.1 病料 貴州省晴隆縣某種牛場(chǎng)患病種牛經(jīng)臨床診斷，外科手術(shù)摘除病牛體表的乳頭樣腫瘤物，送至貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院動(dòng)物疫病研究所保存。

1.2 主要試劑 2×TaqPCR Master Mix、DNA提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技有限公司；膠回收試劑盒，購(gòu)自O(shè)MEGA公司；載體pMD19-T，購(gòu)自TaKaRa公司；DL-2 000 DNA Marker，購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞由貴州大學(xué)動(dòng)物疫病研究所保存。

2 方法

2.1 流行病學(xué)及臨床癥狀調(diào)查 調(diào)查種牛場(chǎng)的養(yǎng)殖規(guī)模，種牛品種，牛乳頭狀瘤發(fā)病率、死亡率；牛乳頭狀瘤形狀、大小以及發(fā)病部位等。2.2 病理組織學(xué)檢查 觀察發(fā)病種牛的乳頭樣腫瘤物形態(tài)特征，取皮膚腫瘤樣物經(jīng)4%多聚甲醛溶液中固定，制作病理切片，光鏡觀察組織病理學(xué)變化。

2.3 引物設(shè)計(jì) 參考GenBank公布的各型BPV L1基因序列，設(shè)計(jì)1對(duì)引物P1：5′-ATGGCGTTGTGGCAACAAG-3′，P2：5′-TTAAGCTTTGATTTTTTTTC-3′，引物由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。

2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè) 通過(guò)引物P1/P2對(duì)奶牛病變皮膚進(jìn)行PCR檢測(cè)，反應(yīng)采用25 μL體系，反應(yīng)體系為：2xTaqPCR Maeter Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2.0 μL，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足體積至25 μL。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2.5 基因序列測(cè)定與分子分型 將克隆的陽(yáng)性質(zhì)粒，送上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。利用DNAStar等軟件對(duì)BPV晴隆株和GenBank登錄的BPV不同型的流行基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，用MEGA5.0軟件進(jìn)行同源性分析，并采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

3 結(jié)果與分析

3.1 流行病學(xué)調(diào)查和臨床癥狀觀察 該種牛場(chǎng)2015年12月向澳大利亞引進(jìn)的安格斯種牛，牛乳頭狀腫瘤病發(fā)病率為35%(7/20)，無(wú)病牛死亡。臨床觀察發(fā)現(xiàn)牛乳頭狀腫瘤多發(fā)生在面部、眼睛周圍、頸部等位置。嚴(yán)重病例在面部、頸部均能見到大面積乳頭狀瘤狀物，瘤體間單獨(dú)或者連成一片生長(zhǎng)。瘤體多呈菜花狀，顏色呈灰白色，表面光滑或粗糙、質(zhì)地堅(jiān)硬。

3.2 病理組織學(xué)切片結(jié)果 對(duì)皮膚腫瘤樣物病理組織切片，經(jīng)H.E.染色鏡檢顯示，表皮與真皮增生；腫瘤細(xì)胞呈梭形或星型，核呈卵圓形；表皮細(xì)胞呈現(xiàn)過(guò)度角質(zhì)化和部分顆粒細(xì)胞空泡化的現(xiàn)象，結(jié)果見中插彩版圖1A和1B。3.3 PCR檢測(cè)結(jié)果 牛乳頭狀瘤疑似病料中，PCR檢測(cè)陽(yáng)性樣品，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，所擴(kuò)增的目的PCR產(chǎn)物的大小約1 494 bp，結(jié)果見圖2。

圖2 牛乳頭狀瘤疑似病料PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果

M：DL-2 000 DNA Marker； 1～3：擴(kuò)增結(jié)果； —：陰性對(duì)照

3.4 BPV L1基因核苷酸序列同源性分析 將本實(shí)驗(yàn)克隆的L1基因(命名為BPV-QL1)與GenBank上公布的16株BPV各型的L1基因的對(duì)應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示,貴州省晴隆流行株與BPV2、BPV2-SW01和BPV2-AKS01參考株的核苷酸同源性分別為99.1%、99.9%、99.4%，同時(shí)與BPV13參考株、BPV1參考株的核苷酸同源性也達(dá)88.8%、84.4%，結(jié)果見圖3。

3.5 BPV L1 基因遺傳進(jìn)化樹分析 L1基因是BPV基因組中比較保守的衣殼蛋白，通常用于各型病毒之間的基因分型。將各型BPV的L1基因序列進(jìn)行對(duì)比分析，并采用NJ法(Neighbor-JingMethod)構(gòu)建BPV系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)。經(jīng)DNAStar分析表明，BPV-GZ01與BPV2處于同一遺傳進(jìn)化分支，所以BPV-QL1屬于2型牛乳頭瘤病毒，且與BPV-1、BPV-13親緣關(guān)系比較接近。

4 討論

牛乳頭狀瘤病毒(BPV)屬于乳多空病毒(papovavirus)科乳頭狀病毒屬[10]的一種雙鏈DNA病毒，已報(bào)道有14個(gè)基因型，還有很多假定基因型。在本研究中，根據(jù)牛的臨床癥狀[8-9]查閱相關(guān)資料，針對(duì)BPV L1保守序列設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆測(cè)序后與報(bào)道的牛乳頭狀瘤病毒14個(gè)基因型進(jìn)行同源性和遺傳進(jìn)化樹分析，證實(shí)該牛場(chǎng)發(fā)生的牛乳頭狀瘤病為2型牛乳頭瘤病毒感染。臨床觀察牛乳頭狀瘤為灰白色，菜花狀，質(zhì)地堅(jiān)硬，表面略有粗糙。病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)牛乳頭狀瘤有過(guò)度角質(zhì)化和部分顆粒細(xì)胞的空泡化現(xiàn)象。

圖3 BPV-QL1株與BPV不同基因型的L1基因核苷酸序列比較BPV1(X02346)、BPV2(M20219)、BPV2-SW01(KC878306)、BPV2-AKS01(KM455051)、BPV3(AF486184)、BPV4(X05817)、BPV5(AF457465)、BPV6(AJ620208)、BPV7(DQ217793)、BPV8(DQ098913)、BPV9(AB331650)、BPV10(AB331651)、BPV11(AB543507)、BPV12(JF834523)、BPV13(JQ798171)、BPV14(KP276343)

圖4 L1基因序列構(gòu)建的不同基因型BPV系統(tǒng)進(jìn)化樹

發(fā)病牛和健康牛群居是導(dǎo)致牛之間互相感染牛乳頭狀瘤病毒的主要原因。該病一般呈良性經(jīng)過(guò)，死亡率不高，但康復(fù)時(shí)間比較長(zhǎng)，可用手術(shù)方法摘除瘤體，術(shù)后及時(shí)護(hù)理，并加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，及時(shí)隔離病牛等措施進(jìn)行預(yù)防和治療。

近兩年貴州省大力發(fā)展養(yǎng)牛業(yè)，從國(guó)外和省外引進(jìn)了優(yōu)質(zhì)的種牛，同時(shí)許多外來(lái)疾病也隨之帶入，從而威脅著貴州省養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展，給養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)巨大的挑戰(zhàn)。此次診斷為貴州地區(qū)外來(lái)疾病的科學(xué)防控提供了一定的理論依據(jù)。

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Diagnosis of Bovine Papilloma and the Virus Genetyppe Analysis

LU Liu1， ZHANG Jun1， ZHOU Bi-jun1， ZHANG Xu1， ZHAO Meng-jie1， HE Na1，WANG Kai-gong1， WEN Ming1， ZHANG Hai1

(1.College of Animal Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China; 2.Animal Health Supervision Institute of Liupanshui City， Liupanshui 553001， China)

The purpose of this study was to diagnose the outbreak of suspected cattle papillary tumor in a cattle farm in Qinglong County in Guizhou province by the epidemiological investigation, clinical symptoms, pathological observation, PCR molecular detection and molecular typing. The results showed that the cattle farm bovine papilloma incidence rate was 35% (7/20). The tumor was nodular and cauliflower, and the color was gray. Pathological section showed that the tumor body had the phenomenon of stratum corneum and vacuole. Genetic evolutionary tree analysis showed that the outbreak of bovine papillary tumor in Qinglong County, Guizhou province was caused by the BPV2 type of bovine papilloma virus. This study provides a theoretical basis for the scientific prevention and control of bovine papilloma in Guizhou area.

Bovine papilloma ; diagnosis ; genotype analysis

ZHOU Bi-jun

2016-11-15

貴州省黔南州社會(huì)發(fā)展科技重大計(jì)劃項(xiàng)目《喀斯特石漠化林草牧綜合治理技術(shù)研究與示范》[黔南社發(fā)科(20140325)]；貴州現(xiàn)代肉牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)(GZCYTX2015-0302-02)；貴州省農(nóng)業(yè)委員會(huì)科技專項(xiàng)《動(dòng)物疫病防控能力提升專項(xiàng)》(黔農(nóng)財(cái)[2015]149號(hào))；“貴州省動(dòng)物疫病防控與獸醫(yī)公共衛(wèi)生保障科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)”(黔科合人才團(tuán)隊(duì)[2015]4016號(hào));貴州省農(nóng)業(yè)委員會(huì)科技計(jì)劃項(xiàng)目 [2016-01號(hào)]；貴州大學(xué)大學(xué)生“SRT”計(jì)劃項(xiàng)目(貴大SRT字(2015)094號(hào))

盧柳(1994-)，女，本科生，就讀于動(dòng)物醫(yī)學(xué)專業(yè)，E-mail:15761632703@163.com

周碧君，E-mail:zhoubijungzu@eyou.com

S852.65+3

A

0529-6005(2017)05-0009-03