蔡擴(kuò)軍 ， 李愛巧 ， 何 生 ， 楊啟元 ， 韓義忠 ， 陳發(fā)喜 ， 梁望旺

(1. 烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心 ， 新疆烏魯木齊830063 ； 2. 烏魯木齊市米東區(qū)畜牧獸醫(yī)站 ，新疆烏魯木齊831400 ； 3.烏魯木齊市米東區(qū)三道壩畜牧獸醫(yī)站 ， 新疆烏魯木齊831403 ；4. 重慶市動物疫病預(yù)防控制中心 ， 重慶渝北401102)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒烏魯木齊分離株GP5基因遺傳變異分析

蔡擴(kuò)軍1， 李愛巧1， 何 生2， 楊啟元1， 韓義忠3， 陳發(fā)喜1， 梁望旺4

(1. 烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心 ， 新疆烏魯木齊830063 ； 2. 烏魯木齊市米東區(qū)畜牧獸醫(yī)站 ，新疆烏魯木齊831400 ； 3.烏魯木齊市米東區(qū)三道壩畜牧獸醫(yī)站 ， 新疆烏魯木齊831403 ；4. 重慶市動物疫病預(yù)防控制中心 ， 重慶渝北401102)

為對烏魯木齊市豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的分子遺傳變異情況進(jìn)行研究與分析，應(yīng)用RT-PCR方法對疑似感染PRRSV豬的組織臟器進(jìn)行PRRSV GP5基因的擴(kuò)增，將陽性樣品PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測序，并應(yīng)用分子生物學(xué)軟件對測序結(jié)果進(jìn)行比對和遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果顯示,5株病毒分離株GP5基因全長均為603 bp，與JXA1株親緣關(guān)系較近，同屬于美洲株的同一基因亞群。本試驗(yàn)結(jié)果為掌握烏魯木齊市PRRSV的分子遺傳變異情況提供了依據(jù)。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒 ； GP5基因 ； 遺傳變異

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)，是由豬繁殖PRRSV引起的一種高度接觸性急性傳染病。主要引起懷孕母豬的繁殖障礙以及仔豬的呼吸系統(tǒng)疾病，對幼齡仔豬具有較強(qiáng)的致病性和較高的病死率。該病自1987年首次在美國發(fā)現(xiàn)，其后在世界各主要養(yǎng)豬國家廣泛流行，目前該病已成為危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要病毒性疾病之一[3]。

PRRSV易發(fā)生變異，其中GP5是變異最大的結(jié)構(gòu)蛋白[1-2]。因此，GP5基因的變異情況在一定程度上反應(yīng)了PRRSV整個(gè)基因組序列的變異情況。本文通過對烏魯木齊市PRRSV流行毒株的ORF5基因序列進(jìn)行測序，并跟國內(nèi)外代表毒株進(jìn)行比對分析，以期為該地區(qū)PRRS防制提供必要的分子流行病學(xué)信息。

1 材料與方法

1.1 病料樣品 疑似感染PRRSV豬的肺、淋巴結(jié)、扁桃體等組織病料。

1.2 主要試劑 病毒核酸純化試劑盒、RT-PCR一步法試劑盒，購自TaKaRa公司。

1.3 引物設(shè)計(jì) 上游引物：5'-CCCGTTGGAATGGTACTCCTCAACTG-3'；下游引物：5'-CGGGGTCTGAT TGCTGGTAATCAGAAT-3'。預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的片段大小773 bp。

1.4 GP5基因的擴(kuò)增與測序 參照病毒核酸純化試劑盒說明書對PRRSV陽性組織樣品的總RNA進(jìn)行提取。按照RT-PCR一步法試劑盒對提取的RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，將PCR陽性產(chǎn)物進(jìn)行測序。

1.5 基因序列遺傳進(jìn)化分析 應(yīng)用GenBank Blast和DNAStar生物學(xué)分析軟件對擴(kuò)增的核苷酸序列進(jìn)行分析，并與GenBank中登錄的PRRSV GP5基因序列和推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，利用和Mega6.0軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴(kuò)增結(jié)果 用RT-PCR法從9份疑似感染PRRSV的樣品中擴(kuò)增出5份與預(yù)期片段大小相符的特異性片段，擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

圖1 分離毒株ORF5 基因的擴(kuò)增

M：DL-1 000 DNA Marker； 1-3，9：擴(kuò)增陰性； 4-8：擴(kuò)增陽性； 10：陽性對照； 11陰性對照

2.2 目的基因的序列測定結(jié)果 送去測序的5株GP5基因全長均為603 bp，編碼201個(gè)氨基酸，登錄NCBI 利用Blast對測序結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果表明，擴(kuò)增得到的5條序列為PRRSV 0RF5基因序列，命名為WLMQ-1-5株。

2.3 PRRSV GP5基因核苷酸與氨基酸序列同源性對比分析 將本試驗(yàn)從陽性樣品擴(kuò)增出的5株P(guān)RRSV GP5基因與GenBank上國內(nèi)外已發(fā)表的15株P(guān)RRSV GP5基因序列進(jìn)行同源性分析比較，比對結(jié)果見圖2和圖3。

圖2 分離株ORF5 基因核苷酸同源性比較

圖3 分離株ORF5 基因編碼氨基酸同源性比較

2.4 PRRSV ORF5序列遺傳進(jìn)化關(guān)系 將烏魯木齊市5株P(guān)RRSV GP5基因序列與GenBank上國內(nèi)外已登錄的15株P(guān)RRSV GP5基因構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(圖4)，結(jié)果顯示，本試驗(yàn)測序鑒定的病毒分離株與歐洲株LV親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，與經(jīng)典PRRSV毒株BJ-4株、VR2332株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與以PRRSV JXA1株為代表的國內(nèi)其他幾株分離毒株在同一個(gè)分支上，說明親緣關(guān)系最近，屬于美洲株(Type 2)同一亞群。說明所分離的毒株可能由國內(nèi)流行毒株進(jìn)化而來。

圖4 PRRSV ORF5序列遺傳進(jìn)化關(guān)系

3 討論

PRRSV屬于有囊膜RNA病毒，歸屬套式病毒目(Nidovirales)，動脈炎病毒科(Arteriviridae)，動脈炎病毒屬(Arterivirus)，基因組約為15 kb，包括ORFla、ORFlb、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5a、ORF5、ORF6和ORF710個(gè)開放性閱讀框(ORF)[3-5]。由ORF5編碼的GP5糖蛋白是該病毒主要的免疫原性結(jié)構(gòu)蛋白之一，具有良好的抗原性，在病毒吸附和進(jìn)入宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮作用，能引起機(jī)體產(chǎn)生具有保護(hù)作用的有效免疫應(yīng)答。該糖蛋白內(nèi)含一段中和病毒的區(qū)域和作為病毒最保守區(qū)前導(dǎo)序列的2個(gè)糖基化位點(diǎn)，對受體具有識別作用，同時(shí)具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能。PRRSV的GP5研究表明，豬感染PRRSV后，ORF5基因的多個(gè)位點(diǎn)在病毒增殖過程中具有較高的變異率，是目前PRRSV的遺傳變異分析和基因進(jìn)化樹的構(gòu)建主要依據(jù)[6-8]。PRRSV同其他有囊膜的RNA病毒一樣，自然選擇壓力導(dǎo)致基因組變異率極高，造成疫苗免疫失敗，從而造成疫病的反復(fù)流行。因此預(yù)防該病的主要方法之一就是選擇當(dāng)?shù)亓餍卸局曜鳛橐呙绫尘斑M(jìn)行免疫。

本試驗(yàn)烏魯木齊5個(gè)分離株與美洲型JXA1遺傳關(guān)系較近，可歸屬同一基因亞群，這有利于烏魯木齊市PRRS 的凈化。理論上以美洲型JXA1株或HPRRSV毒株制成的弱毒疫苗和滅活苗，其免疫保護(hù)力應(yīng)高于RespPRRS MLV 疫苗和CH-1a 滅活苗。但相比滅活苗，弱毒苗能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生更高的中和抗體，從而提供更好的保護(hù)[9]，但要注意弱毒疫苗的回復(fù)突變導(dǎo)致毒力返強(qiáng)[10]。同時(shí)，本試驗(yàn)也在一定程度上反應(yīng)了PRRSV的同源性與其在空間上的分布或時(shí)間上的差異存在較強(qiáng)的對應(yīng)關(guān)系。

[1] Key K F, Haqshenas G, Guenette D K,etal. Genetic variation and phylogenetic analyses of the ORF5 gene of acute porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates[J]. Vet Microbiol, 2001, 83(3):249-263.

[2] Chen J, Liu T, Zhu C G,etal. Genetic variation of Chinese PRRSV strains based on ORF5 sequence[J]. Biochem Genet, 2006, 44(9-10):425-435.

[3] Conzelmann K K, Visser N, Van Woensel P,etal. Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the arterivirus group[J]. Virology, 1993, 193(1):329-339.

[4] Neumann E J, Kliebenstein J B, Johnson C D,etal. Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome on swine production in the United States[J]. J Am Vet Med Assoc, 2005, 227: 385-392.

[5] Stadejek T, Stankevicius A, Storgaard T,etal. Identification of radically different variants of porcine reproductive and respiratorysyndrome virus in Eastern Europe: towards a common ancestor forEuropean and American viruses[J]. J Gen Virol, 2002, 83: 1861-1873.

[6] Liu J K, Wei C H, Yang X Y,etal. Genetic diversity and evolutionary characterization of Chinese porcine reproductive and respiratory syndrome viruses based on NSP2 and ORF5[J]. Arch Virol, 2013, 158: 1811-1816.

[7] 石娜, 尹杰超, Dante Z, 等. 豬IL-15與PRRS病毒GP5基因核酸疫苗免疫效力[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 41(1): 97-102.

[8] Itou T, Tazoe M, Nakane T,etal. Analysis of open reading frame 5 in Japanese porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates by restriction fragment length polymorphism [J]. J Vet Med Sci, 2001, 63(11):1203-1207.

[9] Zuckermann F A, Garcia E A, Luque I D,etal. Assessment of the efficacy of commercial porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) vaccines based on measurement of serologic response, frequency of gamma-IFN-producing cells and virological parameters of protection upon challenge[J]. Vet Microbiol, 2007, 123(1-3):69-85.

[10] 梁望旺, 楊克禮, 伍銳, 等. 豬繁殖與呼吸綜合征病毒分離株GP5 基因的遺傳變異與系統(tǒng)進(jìn)化分析[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 28(5): 595-599.

Genetic variation and phylogenetic analysis of glycoprotein 5 gene of pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus inUrumqi

CAI Kuo-jun1, LI Ai-qiao1, HE Sheng2, YANG Qi-yuan1, HAN Yi-zhong3, CHEN Fa-xi1, LIANG Wang-wang4

(1.Urumqi Animal Disease Control and Diagnosis Center, Urumqi 830063, China; 2. Animal Husbandry and Veterinary Station of Midong District of Urumqi, Urumqi 831400, China; 3.Animal Husbandry and Veterinary Station of Sandao ba District of Urumqi，Urumqi 831403，China；4. Chongqing Animal Disease Prevention and Control Centre, Chongqing 401102, China)

To study and analyze the molecular genetic variations of pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV) in Urumqi, the GP5 genes of suspected PRRSV positive samples were amplified by RT-PCR.PCR products of positive samples were cloned and sequenced．The results of alignment analysis showed that all the full length of GP5 from 5 isolates was 603bp, and they were closely related to the JXA1strain and belonged to the same subgroup. This study would provide the basis for mastering the molecular genetic variation of PRRSV in Urumqi．

porcine reproductive and respiratory syndrome virus; GP5 gene; variation and phylogenetic

LI Ai-qiao

2016-07-07

新疆維吾爾自治區(qū)科技廳科技援疆項(xiàng)目(201491165)；烏魯木齊市科技局應(yīng)用開發(fā)研究計(jì)劃(Y141210013)

蔡擴(kuò)軍(1985-)，男，獸醫(yī)師，碩士，主要從事動物疫病診療工作，E-mail：caikuojun@163.com

李愛巧，E-mail：laq4616369@126.com

S852.65

A

0529-6005(2017)05-0020-03