曹團(tuán)武+周坤+黃文兵+時(shí)建偉+譚曉平+黃春林+冉嬡

摘 要 在不同溫度及模擬血液pH值條件下，采用熒光光譜法和紫外可見(jiàn)吸收光譜法研究了哈巴俄苷（Harpagoside， HAR）與人血清白蛋白（Human serum albumin， HSA）的結(jié)合反應(yīng)。結(jié)果表明，HAR有規(guī)律地使HSA內(nèi)源熒光猝滅，猝滅常數(shù)隨溫度升高而降低，其猝滅機(jī)制為兩者形成復(fù)合物而引起的的靜態(tài)猝滅； 不同條件下兩者結(jié)合常數(shù)KA均大于105 L/mol，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n≈1。由Van′t Hoff方程計(jì)算獲得了不同條件下HAR與HSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)，由ΔG、ΔH和ΔS均小于0可知，兩者結(jié)合的主要作用力是氫鍵和范德華力，且兩者結(jié)合是吉布斯自由能降低的自發(fā)過(guò)程。根據(jù)Frster非輻射轉(zhuǎn)移理論計(jì)，計(jì)算了不同條件下HAR與HSA的結(jié)合距離r在4.01～4.28 nm范圍內(nèi)，表明兩者結(jié)合過(guò)程發(fā)生了非輻射能量轉(zhuǎn)移。同步熒光光譜表征結(jié)果表明，HAR使HSA的色氨酸和酪氨酸殘基所處的微環(huán)境極性增強(qiáng)，疏水性減弱，導(dǎo)致HSA構(gòu)象發(fā)生了一定程度的改變。

關(guān)鍵詞 玄參； 哈巴俄苷； 人血清白蛋白； 熒光猝滅； 結(jié)合反應(yīng)

1 引 言

中藥活性成分是中藥防治疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)。從細(xì)胞和分子水平研究中藥及其有效成分的作用機(jī)理，對(duì)中藥的深入研究與開(kāi)發(fā)具有重要意義。藥物與生物大分子的相互作用研究，一直是藥理學(xué)、藥物化學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題?，F(xiàn)階段，在藥物與蛋白質(zhì)相互作用研究方面，主要針對(duì)它們之間的結(jié)合部位、作用力、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、熱力學(xué)常數(shù)，以及由此引起的蛋白質(zhì)構(gòu)型變化等方面[1，2]。人血清白蛋白（Human serum albumin， HSA）是血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，具有維持內(nèi)生理環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定作用，可與藥物小分子結(jié)合，并將其運(yùn)輸至身體的各個(gè)部位，是藥物發(fā)揮藥效和生理功能的重要載體和靶分子。應(yīng)用多種光譜法獲得中藥有效成分與HSA相互作用的各種數(shù)據(jù)，進(jìn)而分析兩者之間相互作用機(jī)理，對(duì)于揭示中藥藥理活性、進(jìn)行藥物分子設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)及藥物的臨床應(yīng)用等具有重要的指導(dǎo)意義[1～5]。

中藥玄參為玄參科（Scrophulariaceae）玄參屬（Scrophularia）植物玄參（Scrophularia ningpoensis Hemsl.）的干燥根，具有清熱涼血、滋陰降火、解毒散結(jié)之功效[6～9]。哈巴俄苷（Harpagoside， HAR）為環(huán)烯醚萜類化合物，是玄參中的主要化學(xué)成分和藥理活性成分之一，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，HAR苷具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗血小板聚集、保護(hù)血管內(nèi)皮層細(xì)胞、保護(hù)神經(jīng)元及提高免疫力等作用[10～14]。目前，關(guān)于HAR與HSA的結(jié)合反應(yīng)研究未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究以HSA為模型蛋白，利用熒光光譜法和紫外可見(jiàn)吸收光譜法研究HAR與HSA的結(jié)合作用機(jī)制，獲取了兩者相互作用的結(jié)合參數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、作用力類型以及HAR對(duì)HSA構(gòu)象的影響。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

F4500熒光光度計(jì)、UV4010紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本日立公司）； HH2數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海江星儀器有限公司）； UPTII10T優(yōu)普超純水器（四川優(yōu)普超純科技有限公司）； PHS3C pH計(jì)（上?？祪x儀器有限公司）； Eppendorf移液器（德國(guó)Eppendorf公司）。

哈巴俄苷（本實(shí)驗(yàn)室從玄參中分離得到，NMR鑒定結(jié)構(gòu)，HPLC鑒定純度>98%）用50%乙醇配制成1.0 × 103 mol/L儲(chǔ)備液，于4.0℃暗處保存，用時(shí)逐級(jí)稀釋至所需濃度； 人血清白蛋白（0.2 g/mL，批號(hào)為201511052，華蘭生物工程重慶有限公司），用0.05 mol/L 緩沖溶液TrisHCl（pH 7.40）配制成2.0×105 mol/L的儲(chǔ)備液4.0℃暗處保存，用時(shí)稀釋至所需濃度； 0.05 mol/L的TrisHCl緩沖溶液（pH=7.40）和0.04 mol/L BrittonRobinson緩沖溶液（BR，用0.2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)至pH 4.0， 7.0和9.0）； 乙醇、三羥甲基氨基甲烷、乙酸、硼酸等試劑均為分析純； 實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

熒光光譜和同步熒光光譜：在10 mL定量比色管中加入1.0 mL緩沖溶液、2.0 mL 2.0 × 106 mol/L HSA、適量HAR，使HAR濃度分別為4.0＼， 6.0＼， 15＼， 30＼， 40＼， 50＼， 60＼， 70和80 μmol/L，用去離子水定容后，在24℃、37℃和50℃下恒溫水浴2 h（整個(gè)體系保持NaCl濃度為0.9%，以維持生理?xiàng)l件下的離子強(qiáng)度）。固定激發(fā)波長(zhǎng)λex=280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm，用1 cm石英比色皿在280～500 nm范圍內(nèi)掃描HSA及HSAHAR體系的熒光光譜[15]。固定Δλ=60 nm和15 nm（Δλ=λem-λex），記錄HAR與HSA相互作用的同步熒光光譜； 在240～500 nm范圍內(nèi)的掃描HAR與HSA相互作用的紫外光譜[15]。

紫外吸收光譜：在10 mL定量比色管中加入1.0 mL緩沖溶液、2.0 mL 20 μmol/L的HSA和HAR，用去離子水定容后，在24℃、37℃和50℃下水浴恒溫2 h。以相應(yīng)溶液的空白為參比，在紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上，記錄HASHAR體系在250～500 nm范圍內(nèi)的紫外吸收光譜（1 cm的石英比色池）。

3 結(jié)果與討論

3.1 熒光猝滅機(jī)制及猝滅常數(shù)

許多分子能通過(guò)與熒光物質(zhì)相互作用（如激發(fā)態(tài)反應(yīng)、分子重排、能量轉(zhuǎn)移、形成基態(tài)復(fù)合物及碰撞猝滅等）而使其熒光強(qiáng)度下降的現(xiàn)象，稱為熒光猝滅[16，17]。HSA的內(nèi)源熒光主要來(lái)源于色氨酸殘基，當(dāng)小分子與HSA結(jié)合，會(huì)使色氨酸殘基的微環(huán)境發(fā)生改變而使其熒光強(qiáng)度發(fā)生改變[15]。在HSA溶液中，隨著HAR不斷加入，其濃度不斷增大，同時(shí)HSA的熒光強(qiáng)度逐漸降低（圖1），表明HAR可以有效猝滅HSA的內(nèi)源熒光。

靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅。靜態(tài)猝滅主要是由于猝滅劑分子和熒光物質(zhì)發(fā)生結(jié)合作用，形成了復(fù)合物而導(dǎo)致淬滅； 動(dòng)態(tài)猝滅主要是由于熱運(yùn)動(dòng)和分子碰撞引起的。不同猝滅機(jī)制可以根據(jù)溫度對(duì)結(jié)合常數(shù)的影響及測(cè)定熒光壽命的方法區(qū)別[16，18]。

判斷體系的熒光猝滅機(jī)制，可對(duì)猝滅過(guò)程的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按照SternVolmer方程[16]進(jìn)行處理。

根據(jù)SternVolmer方程，用F0/F對(duì)[Q]作圖（SternVolmer曲線），呈一條直線（圖2），通過(guò)該直線的斜率可計(jì)算得到動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)Ksv。在不同溫度和pH值條件下，根據(jù)SternVolmer曲線計(jì)算得到HAR對(duì)HSA的熒光猝滅常數(shù)（表1）。

通常，對(duì)于靜態(tài)猝滅，猝滅常數(shù)Ksv隨溫度的升高而減??； 而對(duì)于動(dòng)態(tài)猝滅，猝滅常數(shù)Ksv隨溫度的升高而增大[19，20]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)所得計(jì)算結(jié)果（表1），HAR與HSA結(jié)合反應(yīng)的動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)Ksv隨著溫度的升高而減小，表明HAR對(duì)HSA的熒光猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅。通常情況下，小分子猝滅劑對(duì)生物大分子的最大碰撞猝滅速率常數(shù)的閾值為2.0×1010 L/mol·s，如果計(jì)算所得的猝滅速率常數(shù)小于此閾值，表明為動(dòng)態(tài)猝滅機(jī)理； 若猝滅速率常數(shù)大于此閾值，則猝滅過(guò)程可能包含了靜態(tài)猝滅過(guò)程[18]。由計(jì)算所得的數(shù)據(jù)（表1）可知，在不同條件下，HAR對(duì)HSA的熒光猝滅速率常數(shù)Kq值均遠(yuǎn)大于最大碰撞猝滅速率常數(shù)的閾值，進(jìn)一步說(shuō)明了HAR對(duì)HSA的熒光猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅。根據(jù)以上分析，HAR對(duì)HSA的熒光猝滅過(guò)程主要是由兩者之間結(jié)合形成復(fù)合物而引起的靜態(tài)猝滅。

3.2 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

HAR對(duì)HSA的熒光猝滅機(jī)理主要為靜態(tài)猝滅。對(duì)于靜態(tài)猝滅過(guò)程，假設(shè)化學(xué)小分子Q在蛋白質(zhì)分子上有n個(gè)獨(dú)立且等同的結(jié)合位點(diǎn)，小分子化合物與蛋白質(zhì)大分子相互作用的結(jié)合常數(shù)KA及結(jié)合為點(diǎn)數(shù)n，可采用Scatchard方法，由公式（2）求出[20，21]。

lg[（F0-F）/F]=lgKA + nlg[Q]（2）

以lg[（F0-F）/F]為縱坐標(biāo)，lg[Q]為橫坐標(biāo)作圖，根據(jù)雙對(duì)數(shù)曲線的斜率和截距可以得到HAR與HSA相互作用的結(jié)合常數(shù)KA及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n。

在不同實(shí)驗(yàn)條件下，HAR與HSA按照靜態(tài)猝滅形成復(fù)合物模型，通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到雙對(duì)數(shù)曲線（圖3）均呈良好的線性關(guān)系（線性回歸系數(shù)>0.99）。根據(jù)雙對(duì)數(shù)曲線計(jì)算得到HAR與HSA相互作用的結(jié)合常數(shù)KA在1.20 × 105～2.98 × 106 L/mol之間，表明兩者之間有較強(qiáng)的結(jié)合作用； 結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n在1.09～1.44之間，數(shù)值接近于1，表明兩者可能形成一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)（表2）。在不同溫度和pH值條件下，HAR與HSA相互作用的結(jié)合常數(shù)存在一定差異，說(shuō)明體系的溫度和pH值對(duì)HAR與HSA的結(jié)合反應(yīng)有影響。

3.3 相互作用的熱力學(xué)參數(shù)和主要作用力

化合物（包括藥物小分子）與蛋白質(zhì)等生物大分子之間常借助氫鍵、靜電引力、范德華力和疏水作用力等非共價(jià)結(jié)合形成超分子復(fù)合物。不同化合物與蛋白質(zhì)結(jié)合的作用力類型不同，根據(jù)熱力學(xué)常數(shù)的符號(hào)與大小判斷作用力類型[4，22]。ΔG（自由能變）、ΔH（焓變）和ΔS（熵變）可通過(guò)Van′t Hoff方程[23]進(jìn)行計(jì)算：

其中，KA為對(duì)應(yīng)溫度下的結(jié)合常數(shù)，R為摩爾氣體常數(shù)，以lnKA對(duì)1/T作圖（圖4），由斜率和截距分別可以求出焓變?chǔ)和熵變?chǔ)，再由公式（4）可計(jì)算出不同條件下反應(yīng)的吉布斯自由能變?chǔ)。 從熱力學(xué)角度看，在一定溫度和壓力下，化合物與蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)能否自發(fā)進(jìn)行取決于體系的吉布斯自由能變?chǔ)，ΔG<0，有利于反應(yīng)自發(fā)進(jìn)行。根據(jù)反應(yīng)前后熱力學(xué)焓變?chǔ)和熵變?chǔ)的相對(duì)大小，判斷化學(xué)小分子與生物大分子之間的主要作用力類型的規(guī)律：當(dāng)ΔH>0、ΔS>0時(shí)， 為疏水作用力； 當(dāng)ΔH<0、ΔS>0時(shí)，為靜電作用力； 當(dāng)ΔH<0、ΔS<0時(shí)，為氫鍵和范德華力[24]。通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算了不同條件下HAR與HSA結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)常數(shù)（表2），結(jié)果表明：不同條件下HAR與HSA結(jié)合反應(yīng)的自由能變?chǔ)均小于0，表明兩者結(jié)合過(guò)程是自發(fā)進(jìn)行的； 熱力學(xué)焓變?chǔ)和熵HSA結(jié)合過(guò)程中氫鍵和范德華力是主要相互作用力。

3.4 結(jié)合距離

HSA有較強(qiáng)的熒光，且與HAR的吸收光譜有較大的重疊，作為給體（HSA）的熒光光譜和作為受體（HAR）的吸收光譜的重疊，可以說(shuō)明兩者有一定程度的能量轉(zhuǎn)移。根據(jù)Frster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論，當(dāng)HAR在HSA上的結(jié)合位點(diǎn)與色氨酸的距離小于7 nm時(shí)，將發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移[4～5]。HSA熒光發(fā)射光譜與HAR吸收光譜間的光譜重疊（見(jiàn)圖5）積分J可由式（5）求得[23]：

其中， F（λ）為HSA在波長(zhǎng)λ處的熒光強(qiáng)度， ε（λ）則為HAR在波長(zhǎng)λ處的摩爾消光系數(shù)，J為重疊面積。

能量轉(zhuǎn)移效率E與HSAHAR結(jié)合距離r及臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0有關(guān)，可由以下公式求得[21～23]：

其中， R0是指能量轉(zhuǎn)移效率E=50%時(shí)的臨界距離， K2為偶極空間取向因子（取值2/3）， N為介質(zhì)的折射指數(shù)（取值1.336）， Φ為給體的光量子效率（取值0.118）。

依據(jù)公式（5）求得HAR紫外吸收光譜與HSA熒光發(fā)射光譜的重疊的積分J，再根據(jù)式（6）和（7）計(jì)算得HAR與HSA結(jié)合反應(yīng)的R0，E、和r（表3）。結(jié)果表明，HAR與HSA反應(yīng)的結(jié)合距離r為4.08～4.29 nm， 小于7 nm，且符合了0.5R0

3.5 HAR對(duì)HSA構(gòu)象的影響

熒光光譜其最大發(fā)射波長(zhǎng)的偏移與蛋白質(zhì)氨基酸殘基周圍的微環(huán)境有關(guān)，同步熒光光譜可以提供關(guān)于蛋白質(zhì)構(gòu)象改變的信息。對(duì)于蛋白質(zhì)的同步熒光光譜，Δλ=15 nm時(shí)只表現(xiàn)酪氨酸殘基的熒光； Δλ=60 nm時(shí)僅表現(xiàn)色氨酸殘基的熒光[19，24]。

固定HSA的量，隨著HAR濃度增大，酪氨酸和色氨酸殘基的同步熒光強(qiáng)度均發(fā)生明顯的猝滅（圖6）。隨HAR濃度增大，色氨酸殘基的發(fā)射峰波長(zhǎng)有明顯的紅移，而酪氨酸殘基的發(fā)射峰波長(zhǎng)在HAR濃度較高時(shí)有紅移現(xiàn)象，說(shuō)明HAR的加入使HSA的構(gòu)象發(fā)生了一定程度的改變，可能使色氨酸和酪氨酸殘基所處的微環(huán)境極性增強(qiáng)，疏水性減弱。

4 結(jié) 論

本研究采用熒光光譜結(jié)合紫外可見(jiàn)吸收光譜，在不同pH值和溫度條件下，研究了HAR與HSA的相互作用，獲得了兩者結(jié)合反應(yīng)的熒光猝滅機(jī)制、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、結(jié)合距離、作用力類型、構(gòu)象變化等相關(guān)信息。結(jié)果表明，HAR對(duì)HSA的主要熒光猝滅機(jī)制為兩者形成復(fù)合物而引起的靜態(tài)猝滅，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1，氫鍵和范德華力是兩者結(jié)合的主要相互作用力，兩者相互作用存在非輻射能量轉(zhuǎn)移，HAR使HSA的絡(luò)氨酸和色氨酸殘基周圍的微環(huán)境發(fā)生了一定改變。HAR與HSA有較強(qiáng)的結(jié)合常數(shù)，說(shuō)明HAR能夠通過(guò)HSA被運(yùn)輸?shù)礁鱾€(gè)靶器官，進(jìn)而產(chǎn)生藥理功效。