鄧穎慧+蘇麗娜+龐艷華+郭亞飛+王芬+廖霞俐+楊波

摘 要 采用飽和水溶液法制備了大豆苷元分別與兩種氨基修飾β環(huán)糊精（ACD） 即單6氨基β環(huán)糊精（NCD） 和單6乙二胺基β環(huán)糊精（ENCD） 的固體包合物，并獲得最佳包合條件：大豆苷元與環(huán)糊精投料比為3∶1（n/n） ，攪拌時(shí)間為72 h，分別獲得83%和67%的產(chǎn)率。利用X射線粉末衍射和熱重分析對其進(jìn)行了表征，證實(shí)了兩種包合物的形成。利用Job′s曲線法確定了主客體的包合比為1∶1，并利用熒光光譜滴定分析測得其包合穩(wěn)定常數(shù)KS分別為899.2和203.8 L/mol。水溶性實(shí)驗(yàn)表明，通過與NCD和ENCD形成包合物，25℃下大豆苷元在水中的溶解度由原來的8.31 μg/mL增至15.2和13.2 mg/mL，分別提高了約1800和1500倍。

關(guān)鍵詞 大豆苷元；氨基修飾β環(huán)糊精；固體包合物；包合行為；水溶性

1 引 言

大豆苷元，即7，4′二羥基異黃酮（Daidzein，圖1） ，又名黃豆苷元、大豆黃酮、大豆素等，是一種重要的異黃酮類化合物，主要存在于豆科類植物如大豆和葛根中。研究表明，大豆苷元具有多種重要的藥理作用，主要包括抗血栓和動(dòng)脈粥樣硬化的形成[1]、抗糖尿病[2，3]、抗氧化[4，5]、骨骼保護(hù)[6，7]及抗腫瘤等作用[8，9]，同時(shí)，大豆苷元還通過在腸道中代謝為Sequol而具有雌激素樣的作用[10，11]。但是，大豆苷元溶解性差，穩(wěn)定性低，口服吸收差，致使其生物利用度低，體內(nèi)吸收量少，大大阻礙了其藥理作用的有效發(fā)揮[12，13]?；瘜W(xué)修飾手段，如成酸[14，15]、成鹽[16，17]和糖苷化[18，19]等，是近年來報(bào)道的提高大豆苷元的水溶性最為常見的途徑。但是，這些方法常存在制備困難、水溶性提高程度有限及大豆苷元活性受到影響等不利因素。因此，改善大豆苷元的水溶性，對提高其生物利用度、開發(fā)其藥用價(jià)值等均具有重要意義。

環(huán)糊精（Cyclodextrin， CD） 是直鏈淀粉在環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶作用下生成的一系列環(huán)狀寡糖的總稱，通常含有6～8個(gè)D（+）吡喃葡萄糖單元，分別稱為α， β和γ環(huán)糊精。環(huán)糊精具有“內(nèi)疏水、外親水”的截錐狀分子結(jié)構(gòu)，能與眾多有機(jī)/無機(jī)分子通過多種非共價(jià)相互作用，如范德華力、氫鍵作用、疏水作用等形成水溶性的主客體包合物或組裝成復(fù)雜的超分子體系。當(dāng)將環(huán)糊精作為超分子主體應(yīng)用于難溶藥物或生物活性分子時(shí)，可大大提升其水溶性、穩(wěn)定性和生物利用度等性質(zhì)[20～22]。

本實(shí)驗(yàn)室近年致力于以環(huán)糊精為主體的天然藥物超分子體系研究[23～27]，發(fā)現(xiàn)用氨基等基團(tuán)修飾β環(huán)糊精后，可極大地提升其水溶性。本研究以兩種氨基修飾的β環(huán)糊精衍生物（ACD） ，即單6氨基β環(huán)糊精（NCD） 和單6乙二胺基β環(huán)糊精（ENCD） 為主體，采用飽和水溶液法分別制備了它們與大豆苷元的固體包合物，優(yōu)化了包合條件，通過X射線粉末衍射（XRD） 和熱重（TG） 分析等手段對它們進(jìn)行了表征，采用熒光光譜法確定了包合平衡常數(shù)和包合比，同時(shí)對包合物的水溶性進(jìn)行測試。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Shimadzu RF5301PC熒光分光光度計(jì)（日本島津公司）； D/Max3B X射線衍射儀（日本理光公司）； NETZSCH STA449F3同步熱分析儀（德國耐馳公司） 。

大豆苷元（純度>98%，阿拉丁試劑） 、β環(huán)糊精（食品級(jí)，98%，孟州華興） 為直接購買使用，NCD和ENCD為參考本實(shí)驗(yàn)室已有方法[28，29]自制。其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 大豆苷元與氨基修飾β環(huán)糊精固體包合物的制備 在室溫（25℃） 及避光條件下，取大豆苷元76 mg（0.3 mmol） 溶于5 mL無水乙醇中，同時(shí)按一定比例取氨基修飾β環(huán)糊精溶于20 mL蒸餾水（pH≈7.0） 中，混合兩種溶液。室溫避光攪拌一定時(shí)間之后，減壓蒸去體系中的溶劑，再加少量水溶解。過濾除去其中的不溶固體，并用0.45 μm微孔濾膜過濾，得到澄清濾液。減壓蒸干后， 于40℃真空干燥24 h，即得到固體包合物。通過對大豆苷元與氨基修飾β環(huán)糊精的投料比及攪拌時(shí)間的優(yōu)化，以固體包合物的產(chǎn)率為指標(biāo)獲取兩種固體包合物形成的最佳條件。

2.2.2 XRD分析 分別取大豆苷元、NCD、ENCD及它們的固體包合物作X射線粉末衍射分析。測試條件為：Cu靶，Kα輻射源（k=1.5460 ） ，電壓為40 kV，電流為100 mA，掃描速率為5°/min。

2.2.3 熱力學(xué)性能測試 對大豆苷元、NCD、ENCD及它們的包合物進(jìn)行了熱性質(zhì)研究。熱分析條件為：氮?dú)饬魉贋?0 mL/min，升溫速率為10℃/min，并由室溫升到400℃。

2.2.4 熒光光譜滴定 采用熒光光譜滴定法測定大豆苷元與β環(huán)糊精衍生物的包合穩(wěn)定常數(shù)KS。首先，配制Na2CO3NaHCO3緩沖溶液（pH 10.5） ，并用其配制0.01 mol/L氨基修飾β環(huán)糊精溶液及3.0×105 mol/L大豆苷元溶液。取8支10 mL比色管，分別加入大豆苷元溶液1.0 mL，然后依次加入氨基修飾β環(huán)糊精溶液0， 0.2， 0.4， 0.6， 0.8， 1.0， 1.2， 1.5和2.0 mL。所有待測比色管均用緩沖溶液定容至10 mL，室溫下超聲30 min后，在λex/λem = 385/468 nm波長下測定。

2.2.5 水溶性測試 采用飽和水溶液稱重法來進(jìn)行包合物的水溶性測試。分別在2 mL蒸餾水（pH≈7.0） 中加入過量固體包合物，25℃避光劇烈攪拌1 h。濾紙過濾除去不溶固體后，再用0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液減壓蒸干，稱重，以此計(jì)算包合物在水中的溶解度。

3 結(jié)果與討論

3.1 大豆苷元/NCD固體包合物的制備

在大豆苷元/NCD固體包合物的制備過程中，大豆苷元與NCD的投料比（大豆苷元∶NCD，摩爾比） 及包合攪拌時(shí)間對生成包合物的收率有一定的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：隨著攪拌時(shí)間延長，收率隨之提高，且至72 h時(shí)基本達(dá)到平衡，此時(shí)繼續(xù)延長攪拌時(shí)間對提高收率不再起作用，這時(shí)包合脫包的可逆過程基本達(dá)到平衡。此外，隨著投料比的增加，收率也隨之增加。當(dāng)大豆苷元與NCD的投料比為3∶1時(shí)，收率基本趨于平衡，此時(shí)繼續(xù)提高投料比也不會(huì)導(dǎo)致收率的明顯變化。因此，經(jīng)篩選確定該包合物制備的最佳條件為：大豆苷元與NCD的投料比為3∶1，包合時(shí)間為72 h，此時(shí)收率為83%。具體的投料比和攪拌時(shí)間對包合物回收率所產(chǎn)生的影響如表1所示。

3.2 大豆苷元/ENCD固體包合物的制備

與大豆苷元/NCD固體包合物的制備過程相似，包合攪拌時(shí)間和投料比這兩個(gè)因素同樣對大豆苷元/ENCD固體包合物的收率產(chǎn)生明顯影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著攪拌時(shí)間的延長，產(chǎn)率隨之提高，且當(dāng)攪拌時(shí)間為72 h時(shí)，收率達(dá)到最大；隨著投料比的增加，收率也隨之增大。當(dāng)大豆苷元與ENCD的投料比為3∶1（n/n） 時(shí)，收率達(dá)到最大。因此確定包合物制備的最佳條件為：大豆苷元與環(huán)糊精投料比為3∶1（n/n） ，包合時(shí)間為72 h時(shí)，產(chǎn)率為67%。具體的條件篩選過程如表2所示。

3.3 XRD分析

采用XRD分析對大豆苷元在形成包合物前后的晶體/非晶體形態(tài)進(jìn)行了表征。圖2為大豆苷元、NCD、ENCD及它們之間的兩種固體包合物的XRD圖譜。從圖2可見，大豆苷元本身呈現(xiàn)典型的晶體形態(tài)（a） ，而兩種氨基修飾β環(huán)糊精NCD和ENCD均為無定形態(tài)粉末（b和d） 。而在形成包合后，兩種包合物均不再表現(xiàn)出大豆苷元的晶體形態(tài)特征，而是更多地呈現(xiàn)與其主體（NCD和ENCD） 相似的無定形態(tài)特征。通常，環(huán)糊精如與另一組分只形成簡單的物理混合物時(shí)，其XRD分析結(jié)果將呈現(xiàn)兩者圖譜的簡單加合。因此，該變化可初步證明大豆苷元與氨基修飾β環(huán)糊精之間形成了主客體包合物，而非物理混合物。

3.4 包合物的熱力學(xué)性能

通過熱重（TG） 分析對大豆苷元形成包合物前后的熱力學(xué)性質(zhì)的改變進(jìn)行了探討。圖3記錄了大豆苷元、NCD、ENCD及兩種固體包合物的TG曲線，大豆苷元在308.82℃開始分解（曲線a） ，NCD在303.25℃開始分解（曲線b） ，而大豆苷元/NCD包合物在296.83℃開始分解（曲線c） ，即形成包合物后分解溫度較大豆苷元和NCD均有所降低。另一方面，ENCD的分解溫度為272.91℃（曲線d） （其中向上的尖峰應(yīng)為儀器誤差） ，而與大豆苷元形成包合后，包合物的分解溫度降至245.04℃（曲線e） 。從包合前后主、客體及包合物之間熱重曲線的明顯區(qū)別可進(jìn)一步證實(shí)大豆苷元與兩種氨基修飾β環(huán)糊精均形成了包合物。

3.5 包合比的確定

以Na2CO3NaHCO3緩沖溶液（pH 10.5） 配制大豆苷元分別與NCD和ENCD的混合溶液。保持大豆苷元與氨基修飾β環(huán)糊精的總濃度不變（3.0 × 105 mol/L） ，使大豆苷元在其中的物質(zhì)的量的比率在0.1～0.9變化。通過測定它們的熒光強(qiáng)度變化獲得Job′s曲線（圖4） ，進(jìn)而得到大豆苷元的兩種包合物的包合比。由圖4可見，從曲線中最高點(diǎn)所對應(yīng)的橫坐標(biāo)（0.5） 可知，大豆苷元與兩種氨基修飾β環(huán)糊精的包合化學(xué)計(jì)量比均為1∶1，此結(jié)果與本研究組之前的研究結(jié)果[30]一致。

3.6 包合穩(wěn)定常數(shù)的測定

NCD和ENCD與大豆苷元的混合溶液的熒光光譜曲線如圖5所示。熒光光譜曲線均是以Na2CO3NaHCO3緩沖溶液（pH 10.5） 為介質(zhì)而測得，檢測波長為：λex/λem=385/468 nm。

由于大豆苷元與NCD和ENCD的包合比均為1∶1，所以其包合穩(wěn)定常數(shù)Ks滿足公式（1） ：

KS： 包合穩(wěn)定常數(shù)（L/mol）；[CD]0和[CD]分別為環(huán)糊精的初始濃度及環(huán)糊精濃度（mol/L）； [Daidzein]0和[Daidzein]分別為大豆苷元的初始濃度及大豆苷元濃度（mol/L）； [CD·daidzein]：環(huán)糊精/大豆苷元包合物的濃度（mol/L）；ΔF： 大豆苷元熒光強(qiáng)度的變化；Δε： 有無環(huán)糊精時(shí)大豆苷元的摩爾消光系數(shù)差值。

由此可推出公式（2） ：

其中，ΔF可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)中環(huán)糊精濃度改變測得的熒光強(qiáng)度差值計(jì)算得到，然后根據(jù)非線性最小二乘法計(jì)算得到包合物的KS值。表3給出了兩種包合物包合穩(wěn)定常數(shù)KS及吉布斯自由能變化ΔG，兩種氨基修飾β環(huán)糊精對大豆苷元的包結(jié)能力NCD>ENCD，這與兩者在同一條件下的包合收率大小一致（83%和67%） ，表明包合能力的強(qiáng)弱可能影響氨基修飾β環(huán)糊精與同一客體形成包合物的收率。

3.7 包合物的水溶性

通過飽和水溶液法測試表明，大豆苷元與NCD及ENCD形成包合物后，在水中的溶解度分別提高至15.2和13.2 mg/mL（以大豆苷元的質(zhì)量計(jì)算） ，相對于同樣條件下大豆苷元本身的溶解度（8.31 μg/mL） 分別提高了約1800和1500倍。與此同時(shí)，與文獻(xiàn)報(bào)道的β環(huán)糊精常見衍生物如2羥丙基β環(huán)糊精（HPβCD） [30，32]、磺丁基醚β環(huán)糊精（SBEβCD） [31]以及β環(huán)糊精[32]等相比，本研究所使用的兩種氨基修飾β環(huán)糊精對大豆苷元具有更強(qiáng)的增溶能力（見表4） 。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利用飽和水溶液法制備的大豆苷元與兩種氨基修飾β環(huán)糊精NCD和ENCD的固體包合物，均可明顯提高大豆苷元的水溶性，形成包合物后，大豆苷元在水中的溶解度分別提高了約1800和1500倍，對大豆苷元的增溶能力強(qiáng)于已報(bào)道的環(huán)糊精及其衍生物。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為設(shè)計(jì)和開發(fā)新的大豆苷元的水溶性制劑提供新的研究思路。

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