儲彬彬+羅立強+馬艷紅

摘 要 水生植物浮萍能夠富集高濃度的砷，是植物過濾修復(fù)技術(shù)的代表，其耐受機理備受關(guān)注。本研究利用同步輻射X射線熒光光譜（Synchrotron radiation Xray fluorescence， SRXRF）和X射線吸收近邊結(jié)構(gòu)譜（Xray absorption near edge structure， XANES）技術(shù)，開展了鉛鋅礦區(qū)天然富砷浮萍樣品中砷元素的微區(qū)分布和形態(tài)特征研究。微區(qū)SRXRF分析了兩個單片浮萍樣品FP1和FP2，單點掃描時間分別為5 s和2 s，光斑尺寸分別為70 μm×80 μm和100 μm×100 μm；對FP2樣品選擇了6個位置進行了微區(qū)XANES單點形態(tài)分析，掃描的能量范圍為11.81～11.96 keV；整體XANES形態(tài)分析是針對壓片的浮萍樣品，掃描的能量范圍為11.67～12.27 keV。結(jié)果表明，浮萍樣品整體和微區(qū)XANES數(shù)據(jù)均表明砷形態(tài)為As；SRXRF微區(qū)分析發(fā)現(xiàn)浮萍中砷元素具有顯著的葉脈分布特征，在一定濃度范圍內(nèi)，砷并不擴散到進行光合作用的葉肉中，有利于減輕砷對葉片的毒害作用，可能是浮萍耐受砷的一個保護機制。

關(guān)鍵詞 浮萍； 砷； 微區(qū)分布； 形態(tài)

1 引 言

全球約有1.5億人的飲用水受到砷污染[1]， 我國也有多處水資源受砷污染的報道， 臺灣嘉義南臺[2]、新疆奎屯[3]、內(nèi)蒙河套平原[4]、山西山陰縣[5]等地先后出現(xiàn)了地方性飲水型砷中毒。植物過濾作為一種環(huán)境友好、低成本的植物修復(fù)技術(shù)，在過去20年逐漸發(fā)展起來。水生植物浮萍能富集高濃度的砷，是植物過濾修復(fù)技術(shù)的代表。如浮萍（Lemna minor）在64 μmol/L As和As溶液暴露6天，分別富集砷17408和8674 μg/g，富集系數(shù)可達3626和1807[6]。

因而，浮萍耐受As的機理也備受關(guān)注。Zhang等[7]通過一種特定的γ谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制劑（LButhionine sulphoximine）對浮萍影響的對比實驗發(fā)現(xiàn)，加入該抑制劑不僅會減少As還原成As，還會抑制植物螯合肽（PCs）的合成，降低了浮萍攝取和耐受As的能力，從而認為PCs在浮萍（Wolffia globosa）對砷的耐受性和解毒方面起著重要作用；Leo等[8]通過對比實驗，發(fā)現(xiàn)浮萍（Lemna gibba）比魁葉萍（Salvinia minima）對As的耐性指數(shù)（Tolerance index）高20%，主要是由于浮萍面對As脅迫時，會增加硫酸鹽的吸收和代謝，從而促進谷胱甘肽和非蛋白巰基的合成，參與細胞解毒。Leo等[9]認為花青素、非蛋白巰基和抗氧化物清除酶在浮萍（Lemna gibba）耐受As的毒性中起著一定作用。這些研究主要探討的是浮萍中某種化合物在As耐受和解毒中的作用，但從元素微區(qū)分布特征和微區(qū)形態(tài)的角度，討論浮萍對As的耐受性的研究還未見報道。另外，這些研究都是針對實驗室培養(yǎng)的浮萍，天然情況下浮萍的這些特征是否有變化，也有待研究。

本研究針對鉛鋅礦區(qū)天然的富As浮萍（Lemna minor），通過SRXRF和XANES技術(shù)，研究浮萍中As的微區(qū)分布特征和微區(qū)形態(tài)，探討其與As耐受性的關(guān)系。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

利用XSeries電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICPMS，美國Thermo Fisher公司）進行浮萍及所在水體中砷總量的測定。前處理試劑包括HNO3和H2O2（MOS級，北京化學(xué)試劑研究所的）； 實驗用水為去離子水（室溫電阻率約18 MΩ·cm）。

用于形態(tài)分析的化合物標準為：三苯基砷（Triphenylarsine，（C6H5）3As，Alfa Aesar公司）； 洛克沙腫（Roxarsone，C6H6AsNO6，Adamasbeta公司）； 二甲基砷酸（Dimethylarsinic acid，（CH3）2AsO2H，Dr.Ehrenstorfer公司）； Na2HAsO4·7H2O（Chem Service公司）。上述化合物均購自上海安譜科學(xué)儀器有限公司，純度約為98%。

2.2 樣品的采集和處理

采集了南京鉛鋅礦區(qū)附近菜園水溝中的浮萍（Lemna minor）及水樣。浮萍樣品用網(wǎng)撈出后，剔除雜物，用水清洗多次后，用去離子水沖洗3次，后續(xù)不同的分析采用不同的處理流程。（1）總砷測定的浮萍樣品 洗凈的浮萍用紗布包裹后，自然晾干，研磨粉碎后，稱取0.5000g浮萍干樣，進行ICPMS含量分析，其消解流程參照文獻[10]。（2）微區(qū)SRXRF元素分析和微區(qū)XANES形態(tài)分析的浮萍樣品 用密封盒采集含水的新鮮浮萍帶至上海同步輻射實驗現(xiàn)場，取單片浮萍樣品用去離子水沖洗后吸干水分，將浮萍的根和葉分離，放入3M膠帶，立即進行實驗。（3）整體XANES形態(tài)分析的浮萍樣品 洗凈的浮萍樣品用濾紙吸干水分后，進行冷凍干燥，干燥后樣品研磨至顆粒直徑小于74 μm，利用壓片機制成直徑為5 mm 的樣片， 20℃保存， 待測。

水樣分兩部分處理：一部分是用0.22 μm濾膜過濾后加入HNO3；一部分加入HNO3后再經(jīng)0.22 μm濾膜過濾。 二者HNO3的最終濃度均為2%。處理后的水樣用ICPMS測定。

2.3 同步輻射SRXRF和XANES形態(tài)分析

單片浮萍的微區(qū)SRXRF元素分析和微區(qū)XANES形態(tài)分析在上海同步輻射裝置BL15U1光束線上的硬X射線微聚焦線站進行。SRXRF分析了兩個單片浮萍樣品，分別為FP1浮萍的葉和根以及FP2浮萍的葉，單點掃描時間分別為5 s和2 s，光斑尺寸分別為70 μm×80 μm和100 μm×100 μm。微區(qū)XANES分析了浮萍FP2，光斑尺寸約為200 μm×200 μm，掃描的能量范圍為11.81～11.96 keV。

壓片浮萍的整體XANES砷形態(tài)分析在上海同步輻射裝置BLl4Wl光束線上的X射線吸收站譜進行。采用Si（111）雙晶單色器，用固體探測器熒光模式測定樣品，并在后電離室加濾波片鍺（Ge）。由于自然界沒有純砷的標樣，故利用靠近砷吸收邊能量（11867 eV）的金片（11919 eV）進行能量校正。校準后開始樣品的測定。采集樣品的能量范圍為11.67～12.27 keV。另外，砷的化合物標樣，含砷量較高，將其均勻涂在3M膠帶中，透射模式下測定。

利用PyMCA軟件進行熒光數(shù)據(jù)解譜；利用Igor Pro軟件進行面掃描數(shù)據(jù)的處理；利用Athena和Origin軟件進行樣品和標樣的形態(tài)分析和對比。

3 結(jié)果與討論

3.1 浮萍及水體中砷的含量

利用ICPMS分析了鉛鋅礦區(qū)浮萍及其所在水體中As的含量。浮萍樣品中As的含量為（46.5±0.15）μg/g， 超過了該菜園中蔬菜As的含量（0.097～43.0 μg/g）[11]，遠高于食品中As的限量值0.05～1.5 μg/g[12]。然而，該浮萍所在水體中As的含量91.0 μg/L，并未超過地表水Ⅴ類水體中As的限值100 μg/L[13]。該地浮萍對水As的富集系數(shù)約為511倍，富集作用較顯著。

此外，通過對比不同水樣處理方式可知，加酸后過濾的水樣中As的含量為（91.0±0.16） μg/L，是過濾后加酸的水樣中As的含量（（37.2±0.42） μg/L）的2.4倍，差異并不顯著。然而該水體中Pb含量在上述兩種處理方法后的水樣中含量分別為450和0.469 μg/L，相差近1000倍[10]。這說明As和Pb在水中賦存位置不同，Pb主要存于水懸浮物中，而As主要存于水溶液中。

3.2 浮萍中元素的SRXRF微區(qū)分布特征

SRXRF微區(qū)分析是通過圈定元素感興趣區(qū)，計算感興趣區(qū)內(nèi)電子計數(shù)之和進行元素在不同點的面掃描分析。因而感興趣區(qū)的選擇是SRXRF微區(qū)分析中的重要部分。在XRF中，第n個元素的kβ譜線與第n+1元素的kα譜線存在重疊干擾，因此需要針對樣品中的元素特征，選擇無重疊干擾的譜線作為元素的感興趣區(qū)。從單片浮萍葉的60s SRXRF光譜圖（圖1）可見，浮萍中主要含Mn， Fe， Zn和As，并含有少量的Cu和Pb。圖1中紅色劃線部分是圈定的各元素感興趣區(qū)?？紤]到Mnkβ對Fekα， Cukβ對Znkα的譜線重疊干擾，故選擇Fe和Zn的kβ譜線作為感興趣區(qū)。由于Mn含量高，且樣品中無其它元素譜線重疊干擾Mnkα，故選擇Mnkα譜線作為感興趣區(qū)；同理，譜線中來見Ni的譜峰，故不存在Nikβ譜峰干擾Cu kα的現(xiàn)象，故選擇Cukα為Cu的感興趣區(qū)。譜圖中，As和Pb的譜峰均出現(xiàn)，但是Askα（10543 eV）和Pb Lα （10551eV）譜線重疊嚴重，故分別選擇Askβ和PbLβ為As和Pb的感興趣區(qū)。浮萍中各元素的感興趣區(qū)如下：Mn 5600～6150 eV，F(xiàn)e 6900～7200 eV， Cu 7800～8240 eV， Zn 9370～9800 eV， As 11600～11850 eV， Pb 12450～12750 eV。 此外，圈定了Compton峰的感興趣區(qū)（15400～15700 eV）用于后續(xù)的背景和基體校正。

浮萍樣品的SRXRF元素微區(qū)分布如圖2所示。每點的元素感興趣區(qū)計數(shù)除以Compton感興趣區(qū)的計數(shù)，以此強度比制圖（圖2）。采用Compton強度比有利于降低因電離室計數(shù)、死時間的波動等外界因素的影響，也可在一定程度上減小樣品厚度、平整度及共存元素等的影響。

浮萍根部的微區(qū)分布顯示了元素在根部的不均勻分布。從圖2的FP1的根部掃描圖可見，Pb， Zn和Cu高點在根冠部位，Mn在根尖部位，F(xiàn)e在根部中間部位，而As在根部分布相對比較均勻。

浮萍葉片部分的元素微區(qū)分布指示了浮萍耐受砷的一種保護機制。該地浮萍中砷元素含量較高，砷元素的微區(qū)分布特征具有明顯的規(guī)律性。從圖2可見，砷元素主要沿浮萍的側(cè)脈（Lateral vein）和中間葉脈（Middle of vein）分布，并在根和葉相交的節(jié)點（Node）處含量達到最高，而營養(yǎng)元素Fe， Mn， Cu， Zn等并無此分布特征，這些營養(yǎng)元素幾乎充滿了整個葉片。這說明浮萍中砷與營養(yǎng)元素的存儲有所不同，砷通過浮萍根部傳輸并保存在葉脈中，在一定濃度范圍內(nèi)，砷并不擴散到葉片其它部位（如進行光合作用的葉肉中）。葉脈主要由維管束組成，為葉的支持結(jié)構(gòu)，不含葉綠素，不進行光合作用。砷在葉脈維管束中聚集的特點在砷超富集植物蜈蚣草的研究中也有報道[14]。砷的這種分布特性有利于減輕砷對葉片的毒害作用，可能是浮萍耐受砷毒害產(chǎn)生的保護機制。而有害元素鉛在此次實驗中含量較低，為了避免砷的干擾，鉛感興趣區(qū)選定的是熒光產(chǎn)額相對較低的Lβ譜線，故鉛的計數(shù)很低，在此次實驗中Pb的分布特征并不明顯，需要針對高鉛含量的浮萍樣品做進一步分析。

元素相關(guān)性分析有助于推測元素間的吸收和存儲關(guān)系。針對圖2中FP2樣品，圈定了兩個區(qū)域進行了元素相關(guān)性分析，見圖2 FP2As 中兩個紅色方形區(qū)域。大區(qū)域涵蓋了主要的葉片部分，含樣品點532個；小區(qū)域主要針對根和葉相交的節(jié)點處，含樣品點49個。相關(guān)性分析結(jié)果見表1。從整個葉片區(qū)域來看，分析點較多，As與Mn， Fe， Cu， Zn， Pb等元素均在0.01水平上顯著正相關(guān)；從小的As富集區(qū)域來看，As與Mn和Fe具有顯著正相關(guān)，As與Cu， Zn， Pb均無相關(guān)性。這些相關(guān)性表明，對于同一浮萍樣本，元素之間的吸收可能存在相似性，但在局部位置元素的存儲存在差異性。這在其它植物中也有相似發(fā)現(xiàn)，如，砷超富集植物大葉井口邊草（Pteris nervosa）葉柄、中脈和羽葉中，As與K， Ca， Mn， Fe， Cu和Zn等元素相關(guān)性在0.01水平上均顯示強正相關(guān)，而在根部As只與Fe有相關(guān)性[15]；蜈蚣草的成熟葉片中，As與Mn是顯著負相關(guān)（r=0.795），而年輕葉片中，Mn不受As影響[16]；稻粒中，As與Fe無相關(guān)性，但稻葉中，As與Fe相關(guān)性顯著[17]。

3.3 浮萍中As的吸收譜形態(tài)分析

浮萍的單點微區(qū)XANES和整體XANES分析結(jié)果分別如圖3和圖4所示，砷在新鮮的浮萍樣品以As形式存在；浮萍不同部位的單點微區(qū)XANES分析結(jié)果顯示，各點之間As形態(tài)無明顯差異。這與Zhang等[18]通過HPLCICPMS研究的無根浮萍（Wolffia globosa）90%為As的結(jié)果相似。已有多篇文獻報道植物中砷以As形式存在[19，20]，但部分植物中不同部位中As的形態(tài)卻有差異。如蜈蚣草（Pteris vittata）孢子在As培養(yǎng)液中生長后進行X射線吸收譜分析，發(fā)現(xiàn)根部主要是As（90%±4%），葉片主要是As（95%±1%），而葉片主脈則含有24% As和76% As [21]。本實驗中天然浮萍樣品整體和微區(qū)XANES均顯示砷形態(tài)為As。雖然As的毒性大于As，但As比As更容易排除細胞外，因此有學(xué)者認為， 將As還原成As是生物解毒的機制之一[22]。

另外，研究發(fā)現(xiàn)浮萍砷形態(tài)受實驗條件的影響。從圖4可見，新鮮的浮萍樣品為As，而非新鮮的浮萍樣品（X射線照射約115 min，之后冷凍保存2個多月）As形態(tài)已經(jīng)變?yōu)锳s。 As的浮萍樣品雖然一直冷凍保存，但曾做過Pb的XANES形態(tài)測試，接收了X射線照射。砷的形態(tài)易受多種因素影響，如Webb等[23]研究的蜈蚣草葉片鮮樣砷為As，而烘干的樣品砷卻變成了As； Meirer等[20]研究發(fā)現(xiàn)As的營養(yǎng)液在48 h后也會有部分（<30%）被氧化成As。本實驗中浮萍樣品砷形態(tài)變?yōu)锳s， 可能是由于X射線照射引起。

4 結(jié) 論

鉛鋅礦區(qū)菜園水溝中浮萍對As具有明顯富集作用。SRXRF微區(qū)分析發(fā)現(xiàn)， 浮萍中砷元素具有顯著的葉脈分布特征，即砷元素沿著浮萍的側(cè)脈和中間葉脈分布，并在根和葉相交的節(jié)點處含量達到最高。砷的這種分布特性有利于減輕砷對葉片的毒害作用，這可能是浮萍耐受砷的保護機制。另外，浮萍中砷的XANES分析表明其為As，但是樣品經(jīng)X照射并放置一段時間后，As被氧化為As。微區(qū)XANES分析表明，浮萍的不同部位中，砷的形態(tài)與浮萍整體的XANES形態(tài)分析結(jié)果相同，為As化合物，且各點之間As形態(tài)無明顯差異。

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