陶尚琨 王國梁 劉文德

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

稻瘟病菌機(jī)械敏感性離子通道的鑒定及功能分析

陶尚琨 王國梁 劉文德

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

稻瘟病是水稻上危害最為嚴(yán)重的病害之一，其病原菌為子囊菌門稻瘟病菌。作為模式真菌，研究稻瘟病菌的致病機(jī)理不僅能為其病害防治提供理論依據(jù)，也給其它病原真菌提供借鑒意義。離子通道是細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換的窗口，具有成為防治靶標(biāo)的潛力，對病害防控具有重要意義。機(jī)械敏感性離子通道是一類通過感受細(xì)胞膜張力變化來實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)外機(jī)械信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的離子通道。運(yùn)用生物信息學(xué)鑒定了稻瘟病菌的3條機(jī)械敏感性離子通道蛋白MoMsc1，MoMid1和MoYvc1，進(jìn)化分析表明它們在真菌里具有保守性。還對稻瘟病菌的小電導(dǎo)率機(jī)械敏感性離子通道蛋白MoMsc1進(jìn)行了功能分析，該基因沉默并未影響其生長發(fā)育、外界脅迫、細(xì)胞壁完整性及致病力。

稻瘟菌；機(jī)械敏感性離子通道；小電導(dǎo)率機(jī)械敏感性離子通道

稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）是對水稻產(chǎn)量造成嚴(yán)重?fù)p失的三大病原菌之一，由于其良好的分子操作性，目前已經(jīng)成為經(jīng)典的模式生物［1］。在自然界中，稻瘟病菌主要依靠分生孢子完成其侵染循環(huán)。分生孢子接觸到水稻葉片后2 h萌發(fā)形成芽管，8 h后芽管頂端逐漸膨大形成附著胞，附著胞分化出侵入釘并穿透寄主的表皮細(xì)胞，隨后擴(kuò)展形成侵入菌絲并造成葉部局部病斑［2］。在合適的溫濕度條件下，發(fā)病部位可產(chǎn)生大量的分生孢子，通過氣流傳播從而完成整個病害循環(huán)過程。

活細(xì)胞不停地進(jìn)行新陳代謝活動，就必須不斷地與周圍環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換，而離子通道就是物質(zhì)交換的窗口。永久性打開這些孔是致命的，所以通道通常處于關(guān)閉狀態(tài)。一旦感受外界刺激，構(gòu)象發(fā)生變化就能開啟，此過程稱為門控。根據(jù)門控機(jī)制的不同，可以將離子通道分為3類，電壓門控性，配體門控性和機(jī)械門控性。其中，機(jī)械門控性又稱機(jī)械敏感性離子通道（Mechanosensitive channel），這是一類通過感受細(xì)胞膜張力的變化來實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)外機(jī)械信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的通道。機(jī)械敏感性離子通道幾乎存在所有生物里，根據(jù)其結(jié)構(gòu)不同可以分為小電導(dǎo)率機(jī)械敏感性離子通道（MscS），壓電離子通道（Piezo）家族，瞬時受體電位離子通道（TRP）家族，退化蛋白/上皮鈉離子通道（DEG/NaC）和雙孔鉀離子通道（K2P）等［3，4］。

大腸桿菌（Escherichia coli）有兩條主要的機(jī)械敏感性離子通道，即MscS（小電導(dǎo)率機(jī)械敏感性離子通道）和MscL（大電導(dǎo)率機(jī)械敏感性離子通道），它們通過釋放滲透物質(zhì)比如離子和一些小分子有機(jī)物等參與滲透調(diào)節(jié)［5］。它們由膨壓導(dǎo)致的膜張力變化直接激活，起著“滲透安全閥”的作用［6］。擬南芥（Arabidopsis thaliana）有10條MscS-like（MSL）通道［7］。其中，MSL1參與維持線粒體非生物脅迫下的氧化還原狀態(tài)［8］，MSL2和MSL3參與維持葉綠體的形狀大小［9］，MSL8參與花粉粒的萌發(fā)過程［10］，定位在根部質(zhì)膜的MSL9和MSL10可能與低滲脅迫信號的傳導(dǎo)有關(guān)［11］，MSL10的N端的磷酸化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［12］。此外，衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）的Msc1參與葉綠體的定位［13］。在裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）里，定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Msy1起低滲沖擊作用［14］。目前，真菌里還報道一些重要的Ca2+透過機(jī)械敏感性離子通道。例如，在鑒定釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）質(zhì)膜上一條與動物同源的電壓門控Ca2+通道Cch1時，發(fā)現(xiàn)一條機(jī)械敏感性離子通道Mid1與其組成高親和的Ca2+吸收體系［15］。缺失Mid1通道導(dǎo)致細(xì)胞在低鈣條件下接觸α因子死亡，因而得其名［16］。此離子通道的功能在不同真菌里有一定差異。在粗糙脈胞菌（Neurospora crassa）里，不影響其交配但影響菌絲生長速率等［17］，在赤霉菌（Gibberella zeae）里影響子囊的飽和度等［18］。在某些致病真菌里，Mid1影響其致病力強(qiáng)弱［19，20］。另外，釀酒酵母（S. cerevisiae）液泡里發(fā)現(xiàn)一條重要的機(jī)械敏感性通道Yvc1［21］。Yvc1影響白色念珠菌（Candida albicans）的致病力［22］，但不影響玉米炭疽菌（Colletotrichum graminico）的致病力［23］。一些機(jī)械敏感性離子通道還參與生物的向觸性過程。如在白色念珠菌（C. albicans）里，Mid1被認(rèn)為與菌絲的向觸性有關(guān)［24］。用擬南芥（A. thaliana）的cDNA去互補(bǔ)缺失Mid1的釀酒酵母，發(fā)現(xiàn)擬南芥有一條Ca2+透過機(jī)械敏感性離子通道MCA1，該突變體不能穿透硬的瓊脂塊，表明其參與擬南芥的接觸感應(yīng)［25］。

據(jù)統(tǒng)計，全球每年因稻瘟病造成的水稻產(chǎn)量損失高達(dá)10%-30%［26］。稻瘟病防治已經(jīng)成為一項(xiàng)關(guān)系國計民生的研究課題。離子通道是細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換的渠道，對生物體具有至關(guān)重要的生理作用。因此，本研究中對稻瘟菌的機(jī)械敏感性離子通道進(jìn)行了鑒定和功能分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 稻瘟病菌野生型菌株Guy11由本實(shí)驗(yàn)室保存，MoMSC1基因沉默轉(zhuǎn)化子由本研究獲得。所有菌株在CM培養(yǎng)基（酵母提取物6 g/L，水解酪蛋白6 g/L，蔗糖10 g/L，瓊脂15 g/L）或燕麥培養(yǎng)基（燕麥30 g/L，瓊脂15 g/L）上于28℃光照培養(yǎng)。菌株長期保存采用濾紙片法。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 本實(shí)驗(yàn)所用載體pSilent1為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)張正光教授實(shí)驗(yàn)室惠贈。PCR引物合成及測序由北京華大基因公司完成，DNA Marker購自北京全式金公司，各種DNA聚合酶及dNTP購自Takara公司，常用限制性內(nèi)切酶及T4 DNA連接酶購自Fermentas公司，大腸桿菌感受態(tài)Trans-T1購自北京全式金公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司，PCR純化試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、gDNA removal試劑盒購自Promega公司，各種抗生素（潮霉素，卡那霉素，氨芐霉素）購自Roche公司，其他化學(xué)試劑皆購自鼎國公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 運(yùn)用裂殖酵母小電導(dǎo)率機(jī)械敏感性離子通道Msy1，釀酒酵母的2條Ca2+透過機(jī)械敏感性離子通道Mid1和Yvc1的氨基酸序列在稻瘟病菌全基因組數(shù)據(jù)庫中（http://www.broad. mit.edu/annotation/genome/ magnaporthe_grisea /Home. html）進(jìn)行Blast-P，搜索到其同源蛋白MGG_08304、MGG_12128、MGG_09828分 別 命 名 為MoMsc1、MoMid1、MoYvc1。將氨基酸序列與NCBI公布的所有生物體全基因組序列進(jìn)行比對，搜索到其它物種同系物。在SmartServer（http://smart.emblheidelberg. de/）以及CDD（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）對這些蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測，利用MEGA將比對結(jié)果進(jìn)行聚類分析產(chǎn)生系統(tǒng)發(fā)育樹，用Clustalx軟件進(jìn)行多重序列比對，用SOSUI signal軟件預(yù)測基因的信號肽，用EXPASy Proteomics Server預(yù)測蛋白質(zhì)的親水性和跨膜結(jié)構(gòu)，用SOPMA軟件預(yù)測基因的二級結(jié)構(gòu)。

1.2.2 載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化子的鑒定 根據(jù)基因沉默原理，在pSilent1載體的內(nèi)含子兩端插入從野生型菌株Guy11上擴(kuò)增出來的416 bp的特異性正向片段（F1/R1）和反向片段（F2/R2）［27］。從載體上產(chǎn)生的雙鏈RNA會被體內(nèi)自身的Dicer酶切出約20 bp的siRNA，形成RISC復(fù)合體，介導(dǎo)目標(biāo)基因的mRNA降解，從而達(dá)到基因沉默的目的。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物

1.2.3 菌絲正常生長及脅迫下分析 從菌落邊緣打孔0.5 mm的菌絲塊接種于完全培養(yǎng)基CM，在28℃黑暗培養(yǎng)7 d 后觀察菌落形態(tài)，分別添加滲透壓調(diào)節(jié)劑0.5 mol/L NaCl 和1.0 mol/L sorbitol，其中NaCl代表鹽脅迫，sorbitol作為保持滲透壓穩(wěn)定劑；分別添加細(xì)胞壁紊亂劑200 μg/mL CR（Congo red）和200 μg/mL CFW（Calcofluor white），其中CR能夠特異性地結(jié)合細(xì)胞壁中的β-葡聚糖，CFW可以特異性結(jié)合真菌細(xì)胞壁的主要成分幾丁質(zhì)，最后測量菌落直徑并拍照。以野生型菌株Guy11為對照，每個菌株設(shè)3個重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 生物學(xué)表型測定 分別統(tǒng)計野生型Guy11、MoMSC1基因沉默轉(zhuǎn)化子在燕麥平板10 d黑暗條件培養(yǎng)和隨后2 d誘導(dǎo)產(chǎn)孢后的分生孢子產(chǎn)量。將孢子懸浮液的濃度調(diào)節(jié)至1×104個/mL，分別吸取野生型和突變體的孢子液20 μL滴于載玻片上，置于28℃黑暗保濕培養(yǎng)，24 h后觀察附著胞形成率。每個菌株設(shè)3個重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 致病性分析 選取生長14 d對野生型菌株Guy11敏感的水稻品種幼苗（CO39），收集野生型Guy11、MoMSC1基因沉默轉(zhuǎn)化子菌株的分生孢子，將孢子濃度調(diào)節(jié)至5×104個/mL，用噴霧器將孢子懸浮液均勻噴灑至水稻葉片上，先置于28℃黑暗培養(yǎng)24 h，隨后置于28℃，12 h黑暗/光照交替培養(yǎng)，7 d后觀察發(fā)病情況和拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2 結(jié)果

2.1 稻瘟菌機(jī)械敏感性離子通道的鑒定

根據(jù)裂殖酵母小電導(dǎo)率機(jī)械敏感性離子通道Msy1，釀酒酵母的2條Ca2+透過機(jī)械敏感性離子通道Mid1和Yvc1的氨基酸序列在稻瘟病菌基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast-P，搜索到其同源蛋白MGG_08304、MGG_12128、MGG_ 09828分別命名為MoMsc1、MoMid1和MoYvc1，與Msy1、Mid1和Yvc1蛋白的氨基酸等同性（保守性）分別為42%、36%和41%。結(jié)構(gòu)域預(yù)測表明，MoMsc1有5個預(yù)測的跨膜域，MoMsc1及其同源蛋白均含有1個保守的Ca2+結(jié)合域EF-hand，該結(jié)構(gòu)位于第4-5個跨膜域之間，并且為真菌里的MscS家族所特有，說明它們可能參與細(xì)胞內(nèi)鈣離子的轉(zhuǎn)運(yùn)等過程（圖1-A）；MoMid1帶有1個N端信號肽，沒有預(yù)測的跨膜域，可能為質(zhì)膜定位的GPI錨定蛋白（圖1-B）；MoYvc1有8個預(yù)測的跨膜域，該家族屬于保守的TRP通道（圖1-C）。用MEGA對這些蛋白及其同源物進(jìn)行進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，它們在真菌里均為非常保守的蛋白。MoMsc1蛋白同源物及其數(shù)據(jù)庫登錄號分別為Magnaporthe oryzae（MGG_08304），Colletotrichum graminicola（GLRG_09371），Neurospora crassa（XP_961167），Schizosaccharomyces pombe（NP_587894），Aspergillus nidulans（XP_680840），Botrytis cinerea（G2YNJ4），Crytococcus neoformans（XP_776457）；MoMid1蛋白同源物及其登錄號分別為Magnaporthe oryzae（MGG_12128），Aspergillus fumigatus（XP_754048.1），Gibberella zeae（XP_387594.1），Claviceps purpurea（CAU66903.1），Saccharomyces cerevisiae（EGA81234.1），Candida albicans（XP_710952.1），Aspergillus nidulans（XP_682111.1），Crytococcus neoformans（XP_56917.1）；MoYvc1蛋 白 同 源物及其數(shù)據(jù)庫登錄號分別為Magnaporthe oryzae（MGG_09828），Saccharomyces cerevisiae（Q12324），Aspergillus fumigatus（A0A0J5PXM8），Candida albicans（Q5A2J7），Colletotrichum graminico（GLRG_09114），Aspergillus nidulans（A0A124BVQ3），Ustilaginoidea virens（A0A063BWY5）。

圖1 稻瘟菌機(jī)械敏感性離子通道蛋白Msc1，Mid1和Yvc1的結(jié)構(gòu)域預(yù)測、多重序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

2.2 稻瘟菌小電導(dǎo)率機(jī)械敏感性離子通道的功能分析

對上述3條機(jī)械敏感性離子通道進(jìn)行了基因敲除，然而多次實(shí)驗(yàn)未取得任何一個基因的敲除突變體，預(yù)示了這3個基因可能為稻瘟病菌生長必需基因。為了研究其功能，我們對其中的小電導(dǎo)率機(jī)械敏感性離子通道MoMSC1基因進(jìn)行了RNAi，挑選一批具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，以轉(zhuǎn)化子的cDNA基因組為模板，以β-tubulin（MGG_00604）進(jìn)行對照，利用引物Msc1-F/Msc1-R進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，32個PCR循環(huán)后可見其表達(dá)量差異情況，從中獲得3個表達(dá)量較低的MoMSC1基因沉默轉(zhuǎn)化子T3、T7、T12（圖2-A）。

菌絲在正常和脅迫環(huán)境下生長分析結(jié)果顯示，3個MoMSC1基因沉默轉(zhuǎn)化子和野生型菌株在這幾類培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)均無明顯變化（圖2-B），表明MoMSC1基因可能不參與調(diào)控稻瘟病菌的生長及細(xì)胞應(yīng)對鹽脅迫、滲透脅迫和維持細(xì)胞壁的穩(wěn)定性過程。此外，因?yàn)镽NAi沒法完全沉默該基因的表達(dá)，也有可能少量的MoMsc1蛋白的表達(dá)足以維持其生物學(xué)功能。

將野生型Guy11和MoMSC1基因沉默轉(zhuǎn)化子分別接種到燕麥培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)孢。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者的產(chǎn)孢量沒有顯著差異。為了闡明MoMSC1基因是否參與調(diào)控稻瘟病菌的分生孢子萌發(fā)和附著胞形成過程，將野生型Guy11和MoMSC1基因沉默轉(zhuǎn)化子的孢子懸浮液的濃度調(diào)節(jié)至1×104個/mL，分別吸取野生型和突變體的孢子20 μL滴于載玻片上，置于28℃黑暗保濕培養(yǎng)，24 h后統(tǒng)計分生孢子萌發(fā)率和附著胞形成率。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)（表2）MoMSC1基因沉默突變體與野生型比較無顯著性差異。上述結(jié)果表明，MoMSC1基因不參與稻瘟菌發(fā)育過程調(diào)控。綜上所述，小電導(dǎo)率機(jī)械敏感性離子通道MoMSC1基因沉默不影響調(diào)控稻瘟菌的生長發(fā)育過程。

最后，將野生型菌株Guy11、MoMSC1基因沉默轉(zhuǎn)化子的分生孢子（濃度為5×104個/mL）分別噴霧接種到水稻幼苗上，7 d后觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個MoMSC1基因沉默轉(zhuǎn)化子的致病能力與野生型比較無明顯差異，兩者在水稻葉片上均能形成典型的稻瘟病病斑（圖2-C）。這些結(jié)果表明，小電導(dǎo)率機(jī)械敏感性離子通道MoMSC1基因沉默不影響稻瘟菌的致病過程。

表2 稻瘟菌小電導(dǎo)率機(jī)械敏感性離子通道基因沉默轉(zhuǎn)化子的生物學(xué)表型

圖2 稻瘟菌小電導(dǎo)率機(jī)械敏感性離子通道蛋白MoMsc1的功能分析

3 討論

近年來，動植物里陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了大量具有重要生理意義的機(jī)械敏感性離子通道，但在絲狀真菌里相關(guān)報道還非常少。例如，TRPV4廣泛表達(dá)于多種動物組織中，不僅可被溫度變化及酸性pH激活，同時也可被低滲環(huán)境下脂肪酸所介導(dǎo)的細(xì)胞腫脹間接激活，被認(rèn)為是重要的滲透壓感受器，喪失該基因的小鼠（Mus musculus）表現(xiàn)出飲水減少趨勢及高滲狀態(tài)，對壓迫尾部及酸刺激引起的疼痛敏感性顯著降低［26］。另外，發(fā)現(xiàn)存在于動物的Piezo類通道也具有極其重要的生理意義，敲除果蠅（Drosophila melanogaster）的Piezo1后，機(jī)械性的傷害感受也同時消失，表明其參與有害刺激所致的生理反應(yīng)［27］。為此，有必要對絲狀真菌里機(jī)械敏感性離子通道進(jìn)行深入研究，探討其對真菌的生理意義。

MscS家族的進(jìn)化可能是從大腸桿菌開始的，通過以其TM3為骨架來添加不同序列進(jìn)而影響其生理特性［28］。因此，不同生物的MscS通道的生理功能差異較大。稻瘟菌是一種絲狀真菌，屬于多細(xì)胞真核生物，具有復(fù)雜的滲透調(diào)節(jié)體系，如其Hog信號途徑可以響應(yīng)多種環(huán)境下的滲透脅迫［29］。機(jī)械敏感性離子通道也被認(rèn)為可能參與生物的向觸性過程。在稻瘟菌里，G蛋白偶聯(lián)受體Pth11被認(rèn)為參與稻瘟菌的附著胞分化過程［30］，其通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平參與向觸性［31］。但該離子通道只是部分參與附著胞的分化，因此可能存在其他重疊的信號途徑也參與稻瘟菌的向觸性過程。眾所周知，Ca2+和cAMP都是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使。因此，對定位在質(zhì)膜上的Ca2+透過機(jī)械敏感性離子通道的深入研究或許有助于解釋這個問題。

4 結(jié)論

本文通過生物信息學(xué)鑒定了目前存在稻瘟病菌里的3條機(jī)械敏感性離子通道蛋白MoMsc1（MGG_08304），MoMid1（MGG_12128） 和MoYvc1（MGG_09828）。其中，MoMsc1有5個預(yù)測的跨膜域，含有1個位于第4-5個跨膜域之間保守的Ca2+結(jié)合域EF-hand，并且為真菌里的MscS家族所特有，說明它們可能參與細(xì)胞內(nèi)鈣離子的轉(zhuǎn)運(yùn)等過程；MoMid1帶有1個N端信號肽，沒有預(yù)測的跨膜域，可能為質(zhì)膜定位的GPI錨定蛋白；MoYvc1屬于TRP家族，存在8個預(yù)測的跨膜域。本實(shí)驗(yàn)還對稻瘟病菌的小電導(dǎo)率機(jī)械敏感性離子通道基因MoMSC1（MGG_08304）進(jìn)行了功能分析，該基因沉默并未影響稻瘟菌的生長發(fā)育、高鹽和高滲透壓脅迫及其致病力。

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（責(zé)任編輯 朱琳峰）

Identification and Functional Analysis of Mechanosensitive Channels in Magnaporthe oryzae

TAO Shang-kun WANG Guo-liang LIU Wen-de
（State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests，Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193）

Rice blast disease，caused by ascomycete Magnaporthe oryzae，is one of the most devastating diseases threatening rice production. Understanding its pathogenic mechanism not only provides strategies for disease control，but also generates new knowledge of fungal pathogenesis. Mechanosensitive channels，the window of material exchange，can be the biocontrol targets for disease control. These channels can sense changes of membrane tension and transduce this signal into intracellular environment. In this study，we identified three mechanosensitive channels（MoMsc1，MoMid1，and MoYvc1）in M. oryzae by bioinformatics method. The results showed that the three genes were evolutionarily conserved in fungi. Furthermore，we discovered that silence of MoMsc1，encoding the putative gene of mechanosensitive channel of small conductance in M. oryzae，did not affect its vegetative growth，asexual development，stress response，cell wall integrity and virulence.

Magnaporthe oryzae；mechanosensitive channel；mechanosensitive channel of small conductance

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1209

2017-01-09

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31422045）

陶尚琨，男，碩士研究生，研究方向：分子植物病理學(xué)；E-mail：shangkuntao@126.com

劉文德，男，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：分子植物病理學(xué)；E-mail：wendeliu@126.com

王國梁，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：分子植物病理學(xué)；E-mail：wang.620@osu.edu