祁 琳,王 川，梅國華，溫曉昶，毛立群，金 鑫，李 玲，王 越

(武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院 1.藥材科, 2.口腔科，天津 300162；武警后勤學(xué)院 3.病原生物和免疫學(xué)教研室,4.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)教研室，5.藥理學(xué)教研室，天津 300309)

低氧狀態(tài)下紅景天苷經(jīng)HIF-1α信號通路調(diào)節(jié)人成骨樣MG-63細胞表型表達的研究

祁 琳1,王 川2，梅國華3，溫曉昶4，毛立群3，金 鑫5，李 玲5，王 越3

(武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院 1.藥材科, 2.口腔科，天津 300162；武警后勤學(xué)院 3.病原生物和免疫學(xué)教研室,4.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)教研室，5.藥理學(xué)教研室，天津 300309)

目的 研究低氧狀態(tài)下紅景天苷對成骨細胞表型表達的調(diào)控作用及其作用機制。方法 MTT法檢測細胞增殖能力；采用Annexin V/PI雙染法分析低氧誘導(dǎo)的細胞凋亡情況；磷酸苯二鈉法檢測成骨細胞分化的早期標志性基因堿性磷酸酶(ALP)活性；RT-PCR技術(shù)檢測低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、抑癌基因VHL蛋白(pVHL)、骨鈣素(OC)、成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2及Osterix mRNA表達水平；采用ELISA法檢測VEGF及OC的蛋白表達水平和I型膠原的含量；Western blot技術(shù)檢測HIF-1α、pVHL、Osterix、Runx2的蛋白表達水平；免疫熒光共聚焦顯微鏡技術(shù)觀察HIF-1α的核轉(zhuǎn)位情況；熒光素酶報告基因檢測技術(shù)檢測HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果 低氧狀態(tài)下紅景天苷促進MG-63細胞增殖，抑制由低氧誘導(dǎo)的MG-63細胞凋亡，促進Osterix、Runx2表達及通過增加ALP活性、Ⅰ型膠原和OC含量促進成骨細胞分化成熟。進一步研究發(fā)現(xiàn)，低氧狀態(tài)紅景天苷可下調(diào)HIF-1α的表達及核轉(zhuǎn)位，而上調(diào)其轉(zhuǎn)錄活性及下游靶基因VEGF的表達。結(jié)論 低氧狀態(tài)下紅景天苷通過調(diào)節(jié)HIF-1α/VEGF信號通路促進成骨細胞增殖和分化，同時抑制由低氧誘導(dǎo)的成骨細胞凋亡。

紅景天苷；低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α；成骨細胞；增殖；分化；凋亡；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)

骨質(zhì)疏松癥是影響老年人健康及生活質(zhì)量的嚴重問題，它是一種以骨量減少和骨微結(jié)構(gòu)的破壞為特征，導(dǎo)致骨脆性增加和易于發(fā)生骨折的代謝性骨病。研究發(fā)現(xiàn)，生理性的骨量丟失常常發(fā)生在氧分壓很低的地方，骨組織血供減少可導(dǎo)致骨量丟失。已有研究證實[1-2]，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松骨組織血流減少、毛細血管數(shù)量降低，使成骨細胞處于低氧狀態(tài)。大量的研究表明，缺血缺氧性疾病以及大氣中的氧氣降低，都會導(dǎo)致骨代謝的變化，從而引發(fā)骨量丟失，骨丟失過程中骨內(nèi)血供較少所致的低氧信號與伴隨的骨生成減少密切相關(guān)。

低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor, HIF-1)是調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)的核心轉(zhuǎn)錄因子，目前研究認為HIF-1是誘導(dǎo)低氧基因和修復(fù)細胞內(nèi)微環(huán)境的核心轉(zhuǎn)錄因子[3]。在生理和病理條件下，骨組織血供的減少會使骨系細胞處于低氧狀態(tài)，成骨細胞位于骨小梁的表面，首先感受骨組織內(nèi)血流變化和氧壓力降低，故成骨細胞的低氧感應(yīng)以及HIF-1α對成骨細胞功能的調(diào)控對于骨的塑形改造具有重要意義。低氧條件下骨形成與血管生成之間關(guān)系密切，軟骨內(nèi)成骨和骨折修復(fù)過程依賴于血管的侵入。最近研究發(fā)現(xiàn)[4]，成骨細胞特異性HIF-1α基因敲除小鼠的骨生成能力明顯減低，而抑癌基因VHL蛋白(von hippel-lindau protein, pVHL)敲除(HIF-1α過表達)小鼠的骨內(nèi)血管生成和骨生成能力明顯增加。HIF-1α可通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)使骨內(nèi)新生血管增加，而促進骨發(fā)育和骨折愈合過程中的骨生成。上述結(jié)果表明，HIF-1α在骨形成耦聯(lián)血管生成的過程中起重要的調(diào)控作用。

藏藥紅景天系景天科紅景天屬多年生草本或亞灌木植物，具有抗缺氧、促血管新生及抗骨質(zhì)疏松等多種藥理作用。多項研究表明其主要活性成分紅景天苷具有肝保護[5]和神經(jīng)保護[6-8]功效，這種保護作用主要得益于該化合物的抗氧化活性[9]。此外，另有研究報道[10]紅景天苷還可通過上調(diào)HIF-1α表達并誘導(dǎo)其核轉(zhuǎn)位從而抑制缺氧誘導(dǎo)的大鼠心肌細胞發(fā)生凋亡，提示紅景天苷可通過激活HIF-1α信號通路發(fā)揮抗心肌缺氧作用。而紅景天苷是否也通過激活HIF-1α信號通路，調(diào)節(jié)骨代謝與骨再生中發(fā)揮作用的研究尚未見報道。

本研究利用人成骨樣MG-63細胞，探討低氧狀態(tài)下紅景天苷經(jīng)HIF-1α/VEGF信號通路對成骨細胞表型表達的調(diào)控作用，為全面深入闡明紅景天苷促進骨生成的作用機制奠定基礎(chǔ)，也為今后臨床應(yīng)用紅景天苷治療和預(yù)防骨質(zhì)疏松癥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 紅景天苷(A0076)購自中國藥品生物制品檢定所，氯化鈷(GF1826)為美國Sigma公司產(chǎn)品；MTT(303H0524)購自美國Sigma公司；Annexin V/PI凋亡試劑盒(B32057)購自美國的BioLegend公司；ALP測試盒(22209)為南京的建成生物工程研究所產(chǎn)品；TRIzol Reagent(P4525)為天根生化科技有限公司產(chǎn)品；HiFiScript cDNA Synthesis Kit(10144)，2×Es Taq MasterMix(00201505) 購自北京康為世紀生物科技有限公司；人骨鈣素(osteocalcin, OC)定量酶聯(lián)檢測試劑盒(B1015)，人Ⅰ型膠原定量酶聯(lián)檢測試劑盒(B1517)為上海森雄公司產(chǎn)品。BCA蛋白定量試劑盒(IC111189)購自美國的Pierce公司。酶標儀購自美國的Bio-Rad公司；UV-1206型紫外分光光度計為日本的島津產(chǎn)品；流式細胞儀為Beckman Coulter Cytomics FC500； JY96-Ⅱ超聲細胞粉碎機購自寧波新芝科器研究所；TCS SP5激光掃描共聚焦顯微鏡購自Leica；凝膠成像分析系統(tǒng)為美國的GelPro 4.5；核酸定量儀購自德國Eppendorf公司。

1.2 細胞系和細胞培養(yǎng) 人成骨樣細胞系MG-63為美國ATCC公司產(chǎn)品，購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。使用含F(xiàn)BS(100 g·L-1)的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入100 IU·L-1青霉素及100 mg·L-1鏈霉素。

1.3 細胞低氧損傷模型的建立 化學(xué)低氧模型建立：取狀態(tài)良好的成骨細胞消化后接入平皿中，待細胞生長成單層的，飽和度達到90%左右，將細胞用含F(xiàn)BS(10 g·L-1)的DMEM代替正常培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，并向其中加入氯化鈷水溶液，使其終濃度為0.5 mmol·L-1，然后放入孵育箱培養(yǎng)24 h。

1.4 MTT法檢測細胞增殖活性 取對數(shù)生長期的細胞用胰酶消化并計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為8×107個·L-1, 100 μl/孔接種在96孔培養(yǎng)板中。24 h后，換含F(xiàn)BS(10 g·L-1)的高糖DMEM培養(yǎng)24 h使細胞同步化。加入紅景天苷預(yù)處理(1、10、100、1 000 nmol·L-1)，作用24 h后，加入氯化鈷水溶液，使其終濃度為0.5 mmol·L-1，作用24 h。在結(jié)束培養(yǎng)前4 h，將96孔板離心(1 700 r·min-1，10 min)，棄去上清。避光加入100 μL/孔MTT(0.5 g·L-1)，5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心，棄去上清，每孔加入DMSO 100 μL/孔，充分震蕩，使細胞內(nèi)的藍紫色結(jié)晶充分溶解，用酶標儀測定各孔A492值。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 調(diào)整細胞濃度為6×108個·L-1，1 mL/孔接種在6孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)24 h后，更換含F(xiàn)BS(10 g·L-1)的高糖DMEM培養(yǎng)24 h使細胞同步化。加入藥物預(yù)處理，設(shè)空白對照組及低氧對照組。藥物作用24 h后，加入氯化鈷水溶液，空白對照組及低氧對照組加入三蒸水。24 h后，將細胞收集于EP管中，并計數(shù)，離心(800 r·min-1，1 min)，再用培基重懸，離心。棄去上清液，用PBS緩沖液洗兩次后加入binding buffer，調(diào)整細胞濃度，使之為109個·L-1，從中吸取100 μL并加入5 μL Annexin Ⅴ和10 μL PI,避光孵育15 min后加入400 μL binding buffer。過300目篩網(wǎng)使之成為單個細胞懸液，然后上機。使用FlowJo 7.6軟件分析實驗結(jié)果。

1.6 ALP活性的測定 調(diào)整細胞濃度為2×108個·L-1(使用無酚紅的完全培養(yǎng)基)，以1 mL/孔接種在12孔板上。24 h后，使用含F(xiàn)BS(10 g·L-1)的無酚紅DMEM高糖培養(yǎng)基同步化24 h。藥物處理及低氧方法同上。結(jié)束培養(yǎng)，將培養(yǎng)液收集起來，離心(10 min，1 500 r·min-1)，收集上清，進行細胞外ALP活性的測定。用0.01 mol·L-1PBS緩沖液將細胞洗滌3次，最后1次將PBS吸干，加入1 g·L-1的Triton X-100，500 μL/孔，反應(yīng)3 min，使用加樣器將其充分吹打，收集到1.5 ml的Ependorf管中，使用超聲破碎儀將細胞破碎，離心(10 min，1 500 r·min-1)，吸出上清，用于測定細胞內(nèi)ALP的活性。

1.7 RT-PCR反應(yīng) 調(diào)整細胞濃度為6×108個·L-1，將2 mL細胞液接種在60 mm培養(yǎng)皿中，藥物處理及低氧方法同上，經(jīng)D-Hank′s洗滌之后按照Trizol的試劑說明書進行提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進行RT-PCR反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件參照說明書進行，PCR反應(yīng)體系：cDNA 2.0 μL，2×Premix Taq 10 μL，上、下游引物各10 pmol，加雙蒸水至總體積20 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 mins預(yù)變性；94 ℃ 30 s變性，59 ℃ 45 s退火，72 ℃ 1 min延伸，39個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 mins。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR反應(yīng)液5 μL于12 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果應(yīng)用Bio-Rad公司的Quantity One軟件進行分析，以靶基因/ β-actin光密度的比值作為mRNA的相對表達豐度。

1.8 OC、人Ⅰ型膠原及VEGF的ELISA檢測 接種細胞(2×108個·L-1)于12孔板中，1 ml/孔，按上述方法處理細胞后收集培養(yǎng)上清，按照ELISA試劑盒的說明書檢測培養(yǎng)上清中OC與Ⅰ型膠原的含量。

1.9 HIF-1α、pVHL、Runx2及Osterix蛋白表達水平檢測 調(diào)整細胞濃度為7.5×108個·L-1，取細胞液2 ml接種在60 mm培養(yǎng)皿中，藥物處理及低氧方法同上。把蛋白自SDS-PAGE膠上轉(zhuǎn)移到PVDF膜上后，將PVDF膜放入雜交袋中，向其中加入50 g·L-1的脫脂奶粉作為封閉液，封口后，放置在37 ℃恒溫搖床上封閉1 h后，用50 g·L-1的脫脂奶粉將一抗稀釋到合適的濃度，在37 ℃恒溫搖床上慢速shaking 2 h后翻面放于4 ℃冰箱中過夜，慢速shaking, d2，在37 ℃恒溫搖床上復(fù)溫1 h后經(jīng)TBST buffer在室溫搖床上漂洗后再用50 g·L-1脫脂奶粉稀釋的二抗置于37 ℃孵育1 h，使用TBST 漂洗之后再經(jīng)TBS漂洗，然后和化學(xué)發(fā)光底物檢測試劑盒的A、B混合液作用4 min，使用保鮮膜將其覆蓋，用膠帶將其固定，最后X-ray底片曝光。使用Scion Image軟件進行分析，將靶蛋白/β-actin的灰度作為蛋白相對表達豐度。

1.10 細胞瞬時轉(zhuǎn)染及熒光素酶報告基因的檢測 按照LipofectamineTM2 000的說明書將HRE-luc和SV40-β gal 共轉(zhuǎn)染至MG-63細胞。轉(zhuǎn)染24 h后，換含10 g·L-1FBS高糖DMEM培養(yǎng)，加入紅景天苷預(yù)處理(10、100 nmol·L-1)，設(shè)對照組，作用24 h后，再加入氯化鈷水溶液作用24 h，收集細胞裂解液，分別測定熒光素酶活性和β-半乳糖苷酶活性，以二者之比作為熒光素酶的相對活性。

1.11 免疫熒光共聚焦技術(shù) 調(diào)整細胞濃度為4×108個·L-1，取1 mL細胞懸液接種于放有蓋玻片的6孔板中爬片，藥物處理及低氧方法同上，結(jié)束培養(yǎng)后， PBS緩沖液漂洗細胞3次， 40 g·L-1多聚甲醛固定10～15 min， PBS緩沖液振蕩洗滌細胞2～3次，用含5 g·L-1Triton X的PBS透化10 min， PBS緩沖液振蕩洗滌細胞3次，使用含30 g·L-1BSA的封閉液，室溫封閉60 min，加入一抗，4 ℃濕盒過夜，PBS緩沖液振蕩洗滌細胞3次，加入FITC標記的二抗，室溫濕盒避光2 h，用PBS緩沖液避光振蕩洗滌細胞3次，DAPI復(fù)染細胞核，室溫4 min，避光靜置，用PBS緩沖液避光振蕩洗滌細胞2次，封片，4 ℃避光保存,觀察結(jié)果。

1.12 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析。組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)。用Excel軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析、處理圖表。

2 結(jié)果

2.1 低氧狀態(tài)下紅景天苷對MG-63細胞增殖功能的影響 選擇1 nmol·L-1～1 000 nmol·L-1劑量范圍的紅景天苷預(yù)處理MG-63細胞，24 h后模擬低氧，如Fig 1所示，與正常對照組相比，低氧組可明顯抑制MG-63細胞增殖活性，而紅景天苷劑量組均明顯促進細胞的增殖。

Fig 1 Regulation of proliferation in human osteoblastic MG-63 cell by salidroside for 2 days in hypoxia environment

Detection of cell proliferation by MTT;**P<0.01vsvehicle control;##P<0.01vshypoxia-treated sample

2.2 低氧狀態(tài)下紅景天苷對MG-63細胞凋亡功能的影響 模擬低氧處理MG-63細胞24 h，低氧誘導(dǎo)的細胞凋亡率明顯增加，其凋亡率可達31.62%；與低氧模型組相比，紅景天苷(10、100 nmol·L-1)預(yù)處理組的細胞凋亡率分別下降約10%和15%(Fig 2)。

Detection of cell apoptosis by Annexin V/PI double staining with flow cytometry;**P<0.01vsvehicle control;##P<0.01vshypoxia-treated sample

2.3 低氧狀態(tài)下紅景天苷對MG-63細胞分化功能的影響 為驗證紅景天苷是否通過增強ALP活性，增加Ⅰ型膠原含量，促進MG-63細胞的早期分化。首先模擬低氧處理MG-63細胞24 h，細胞內(nèi)ALP活性及細胞上清中的I型膠原含量均明顯降低；經(jīng)紅景天苷預(yù)處理細胞48、96、144 h后再誘導(dǎo)其低氧，分別測定細胞內(nèi)的ALP活性及細胞上清中的Ⅰ型膠原含量，研究結(jié)果表明，紅景天苷作用48 h后，能夠明顯增強細胞內(nèi)的ALP活性(Fig 3)，且紅景天苷100 nmol·L-1組能明顯改善由低氧導(dǎo)致的Ⅰ型膠原分泌量降低(Fig 4)。上述結(jié)果提示，紅景天苷可能通過增強MG-63細胞ALP的活性及增加MG-63細胞分泌Ⅰ型膠原，促進MG-63細胞的早期分化。

Fig 3 The effect of salidroside on enhancing ALP activity of the MG-63 cells in hypoxia environment

Detection of ALP activity by ELISA;**P<0.01vsvehicle control;##P<0.01vshypoxia-treated sample

Fig 4 Regulation of type Ⅰ collagen synthesis in human osteoblastic MG-63 cells in hypoxia environment by salidroside

Detection of type Ⅰ collagen synthesis by ELISA;**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vshypoxia-treated sample

細胞內(nèi)OC的表達水平可影響MG-63細胞的晚期分化。模擬低氧處理MG-63細胞24 h后，細胞OC mRNA的轉(zhuǎn)錄水平明顯下降，同時OC分泌量降低；經(jīng)紅景天苷預(yù)處理后，OC mRNA的轉(zhuǎn)錄水平及OC分泌量明顯上升(Fig 5)。上述結(jié)果提示，紅景天苷可能通過促進MG-63細胞OC mRNA的表達量及蛋白分泌量來促進MG-63細胞的晚期分化。

Fig 5 Effect of salidroside on OC expression in MG-63 cells in hypoxia environment

A:Detection of OC gene expression by RT-PCR; B: Detection of OC protein secretion by ELISA;*P<0.05vscontrol group;##P<0.01vshypoxia-treated sample

2.4 紅景天苷對MG-63細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2、Osterix表達的影響 模擬低氧處理MG-63細胞24 h后，細胞的Runx2 mRNA及蛋白表達水平明顯下降；與低氧對照組相比，紅景天苷預(yù)處理組Runx2 mRNA水平及蛋白表達量明顯升高(Fig 6A,6B)。同時，低氧可使MG-63細胞的Osterix mRNA及蛋白的表達水平明顯下降；紅景天苷預(yù)處理組可明顯上調(diào)Osterix mRNA及蛋白表達水平(Fig 7A,7B)。

2.5 紅景天苷對MG-63細胞HIF-1α信號通路的影響 HIF-1α是骨代謝和骨再生過程中調(diào)節(jié)骨形成耦聯(lián)血管生成的重要介導(dǎo)因子。應(yīng)用Western blot、 RT-PCR及ELISA技術(shù)檢測細胞內(nèi)pVHL、HIF-1α和VEGF的表達水平。HIF-1α的上游調(diào)控基因pVHL能夠識別HIF-1α，通過蛋白泛素化水解系統(tǒng)將其降解，模擬低氧處理MG-63細胞24 h后，pVHL的表達量明顯降低，HIF-1α及其下游靶基因VEGF的表達水平明顯上升；經(jīng)紅景天苷預(yù)處理后，與低氧組相比，pVHL mRNA及蛋白表達水平提高，在一定程度上抑制了其下游過表達的HIF-1α大量聚集造成的細胞損傷，而VEGF的表達量明顯增加(Fig 8A、B、C)。

Fig 6 Effect of salidroside on Runx2 expression in MG-63 cells in hypoxia environment

A:Detection of Runx2 gene expression by RT-PCR; B: Detection of Runx2 protein expression by Western blot

Fig 7 Effect of salidroside on Osterix expression in MG-63 cells in hypoxia environment

A: Detection of Osterix gene expression by RT-PCR; B: Detection of Osterix protein expression by Western blot

HIF-1由α和β兩個亞基組成， HIF-1α必須轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)與HIF-1β形成二聚體后才轉(zhuǎn)化為有活性的HIF-1。應(yīng)用免疫熒光共聚焦顯微鏡技術(shù)觀察低氧環(huán)境下紅景天苷是否影響HIF-1α的核轉(zhuǎn)錄。結(jié)果顯示，經(jīng)紅景天苷處理的MG63細胞與低氧組比較，細胞核中HIF-1α表達量有所降低(Fig 8E)。細胞瞬時轉(zhuǎn)染及熒光素酶報告基因檢測實驗結(jié)果表明低氧可使HIF-1α基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性增加，而經(jīng)紅景天苷處理后，其轉(zhuǎn)錄活性較低氧組進一步增加(Fig 8D)。

3 討論

近年來，紅景天苷對骨的影響得到廣泛地關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)[11-12]，紅景天苷通過激活HIF-1α及VEGF的表達促進心肌細胞增殖，降低低氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡，增加細胞的存活率。另有文獻報道，紅景天苷抗凋亡的機制可能是激活PI(3)K/Akt信號通路，通過轉(zhuǎn)錄因子NF-κB激活抗凋亡蛋白Bcl-2及Bcl-x，同時通過抑制Bad、caspase-3及caspase-9活性影響凋亡信號通路[13-14]。本文研究證明，低氧環(huán)境下紅景天苷可明顯增加成骨細胞的存活率，明顯降低其凋亡率，與Zhang和譚洪玲等報道一致[6,15]。

Fig 8 Effects of salidrosdie on components of HIF-1α pathway in MG-63 cells in a hypoxia environment

A: Detection of the mRNA levels of HIF-1α, pVHL and VEGF by semi-quantitative RT-PCR;B: Western blot analysis of HIF-1α and pVHL protein expression;C:The level of VEGF secretion into the cell culture supernatants was analysed by ELISA;D:Effect of salidroside on the transcriptional activity of HIF-1α;E:Effect of salidroside on the translocation of HIF-1α(Original section, ×400).**P<0.01vsvehicle control;##P<0.01vsCoCl2

ALP、Ⅰ型膠原、OC是成骨細胞體外分化的重要指標。ALP是參與骨等礦化組織代謝和再生的一種功能性標志酶，在成骨初期大量表達，其表達隨著細胞分化的發(fā)展而增強[16]，其活性反映了成骨細胞的早期分化能力。Ⅰ型膠原是細胞早期成骨分化的一個重要標志，它是骨有機質(zhì)的主要成分，可以很好地反映骨代謝水平。OC是由分化后期成骨細胞特異性分泌的一種非膠原蛋白, 主要參與骨的生長發(fā)育，維持骨的正常礦化，是成骨細胞晚期分化、成熟的特異性標志物， 也是骨形成或骨轉(zhuǎn)換的重要標志。本研究發(fā)現(xiàn)低氧會降低ALP活性，抑制細胞分泌I型膠原和OC，從而抑制成骨細胞的分化，這與高文魁等[17]研究結(jié)果一致。經(jīng)紅景天苷預(yù)處理后，ALP活性、Ⅰ型膠原含量及OC含量明顯上升，提示低氧環(huán)境下紅景天苷可以促進成骨細胞的早期及晚期分化能力。

Runx2又稱核心接合因子α1，是成骨細胞分化成熟所必需的特異性轉(zhuǎn)錄因子。Runx2的表達是成骨細胞分化的開始，體外實驗[18]表明Runx2可激活I(lǐng)型膠原、OC、骨鈣蛋白等基因的啟動子活性從而誘導(dǎo)其表達，促進成骨細胞的分化。Runx2缺失的小鼠由于成骨細胞分化不發(fā)生，導(dǎo)致膜內(nèi)骨化和軟骨內(nèi)骨化完全缺失。Osterix是Runx2的下游轉(zhuǎn)錄基因，是繼Runx2之后發(fā)現(xiàn)的成骨分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，屬鋅指DNA結(jié)合蛋白。目前認為Runx 2在成骨細胞分化的起始階段觸發(fā)骨基質(zhì)蛋白的形成，但同時又會使其維持在較早期的階段而阻止成骨細胞的進一步分化，故Runx2的作用是提供大量的未成熟成骨細胞。而成骨細胞的最終分化成熟則需要Osterix的作用，缺乏Osterix的小鼠缺乏成骨細胞，沒有顱骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨，同時成骨細胞分化的各種標志物的表達水平也嚴重降低或缺如。結(jié)合本研究結(jié)果推測，低氧狀態(tài)下紅景天苷可能通過上調(diào)Runx2、Osterix表達水平提高成骨細胞ALP活性、促進細胞分泌I型膠原和OC，進而影響成骨細胞分化。

細胞處在低氧狀態(tài)時，HIF-1α大量聚集并轉(zhuǎn)運到細胞核內(nèi)和HIF-1β結(jié)合成復(fù)合物HIF-1，作為轉(zhuǎn)錄因子與低氧反應(yīng)元件(hypoxia reaction element, HRE)結(jié)合，進一步激活諸如VEGF、紅細胞生成素等上百種下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，進而引發(fā)組織細胞的一系列耐氧適應(yīng)性反應(yīng)，改善組織或細胞的低氧狀態(tài)。研究表明[19]，HIF-1α對成骨細胞的調(diào)控作用對于骨組織的再生和塑形起著關(guān)鍵性作用。本研究發(fā)現(xiàn)，低氧環(huán)境下紅景天苷可以明顯下調(diào)MG63細胞HIF-1α的表達量，由此我們推測紅景天苷可能對成骨細胞具有保護作用，降低細胞對低氧刺激產(chǎn)生的應(yīng)激性反應(yīng)強度。HIF-1的下游靶基因VEGF是促進血管生成最主要的生長因子，VEGF與骨的形成與修復(fù)密切相關(guān)，其表達水平直接影響到成骨的血供、形成速度與質(zhì)量。VEGF的產(chǎn)生受局部氧濃度的調(diào)節(jié)，低氧可導(dǎo)致HIF-1表達量增加，進而刺激多種細胞分泌VEGF使其表達量上升[20]。我們研究發(fā)現(xiàn)，低氧環(huán)境下紅景天苷可以明顯下調(diào)HIF-1α表達及核轉(zhuǎn)位，而熒光素酶報告基因檢測結(jié)果表明紅景天苷可使HIF-1α基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性增加，由此我們推測，低氧狀態(tài)下紅景天苷可能通過加速HIF-1α與HIF-1β結(jié)合，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子與HRE結(jié)合，進一步激活下游靶基因VEGF的轉(zhuǎn)錄，改善組織或細胞的低氧狀態(tài)，從而促進成骨細胞的表型表達。

綜上所述，紅景天苷可能通過調(diào)節(jié)HIF-1α/VEGF信號通路來調(diào)控成骨細胞的增殖、分化及凋亡,這為全面深入闡明紅景天苷促進骨生成的作用機制奠定基礎(chǔ)，同時也為今后臨床應(yīng)用紅景天苷治療骨折和促進骨再生提供科學(xué)依據(jù)。

(致謝：本課題主要在武警后勤學(xué)院病原生物和免疫學(xué)教研室實驗室完成，部分工作在院內(nèi)重點實驗室完成。由王越教授、李玲講師以及3名碩士研究生祁琳、王川、張鵬共同完成，在此，向他們致以最衷心的感謝。)

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Effect of salidroside on regulating phenotypic expression of human osteoblast-like MG-63 cells through HIF-1α signal passway

QI Lin1,WANG Chuan2,MEI Guo-hua3,WEN Xiao-chang4,MAO Li-qun3,JIN Xin5, LI Ling5,WANG Yue3

(1.DeptofPharmacy; 2.DeptofStomatology,theAffiliatedHospitalofCollegeofLogistics,CPAF,Tianjin300162,China;3.DeptofPathogenicBiologyandImmunology; 4.TeachingandResearchBasicMedicalExperimentTechnology； 5.DeptofPharmacology,CollegeofLogistics,CPAF,Tianjin300309,China)

Aim To investigate the effect of salidroside on the phenotypic expression of osteoblast and the possible molecular mechanism in hypoxia environment.Methods MTT, Annexin V/PI double staining, alkaline phosphatase(ALP) activity assay and enzyme-linked immnosorbent assay(ELISA) were performed respectively to detect the effect of salidroside on regulating phenotypic expression of MG-63 cells exposed to hypoxia. Then RT-PCR and Western blot were conducted to detect the expression levels of Osterix and Runx2 which were related to differentiation. At last, we investigated the expression levels of components of the HIF-1α pathway by RT-PCR,Western blot and ELISA, respectively. Immunofluorescence confocal microscope technology and luciferase reporter assay were performed to explore nuclear translocation and transcriptional activity of HIF-1α.Results Salidroside could markedly promote MG-63 cell proliferation, inhibit hypoxia-induced apoptosis, stimulate cell differentiation and promote expression levels of components of the HIF-1α pathway in hypoxia environment.Conclusion Salidroside could regulate phenotypic expression of MG-63 cells through HIF-1α/VEGF signaling pathway in hypoxia environment.

salidroside; hypoxia-inducible factor(HIF)-1α;osteoblast; proliferation; differentiation; apoptosis; vascular endothelial growth factor(VEGF)

時間：2017-5-25 17:44 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170525.1744.036.html

2017-01-15,

2017-03-05

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81273520，81572852)；天津市自然科學(xué)基金資助項目(No 15JCYBJC28900, 12JCZDJC26300)；武警后勤學(xué)院科學(xué)技術(shù)研究項目(No WHJ201508, WHJ201509, WYKFM201609)

祁 琳(1987-)，女，碩士生，研究方向：抗骨病藥物分子機制，E-mail：qilin19870728@sina.com; 王 川(1986-)，男，碩士生，研究方向：口腔種植外科，E-mail：wangchuan920@qq.com; 李 玲(1976-)，女，博士，講師，研究方向：抗骨病藥物分子機制，通訊作者，E-mail：liling5257@126.com; 王 越(1968-)，女，博士，教授，研究方向：抗骨病藥物分子機制，通訊作者，E-mail：wangyue6808@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.06.018

A

1001-1978(2017)06-0836-08

R284.1；R329.24；R329.25；R681；R845.22；R977.6