杜藝 錢白音 李素霞 李宓

·實驗研究·

鹽酸曲美他嗪對大鼠腎臟急性缺血-再灌注損傷及氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響

杜藝 錢白音 李素霞 李宓

目的 觀察鹽酸曲美他嗪(trimetazidine，TMZ)預(yù)處理對大鼠腎組織急性缺血再灌注損傷及氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。方法 選擇SD大鼠90只，隨機均分為A、B兩組。A組給予TMZ，劑量10 mg/kg，灌胃5 d后建立缺血再灌注(ischemia-reperfusion injury，IR1)、缺血再灌注后處理(ischemic postconditioning，IPO1)、假手術(shù)(sham operated，S1) 模型；B組生理鹽水灌胃5 d后建立缺血再灌注(IR2)、 缺血再灌注后處理(IPO2)、 假手術(shù)(S2)模型。檢測各組末次恢復(fù)腎臟血供0、6、12、24、48 h后血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD) 水平。結(jié)果 與IR1組相比，IR2組6 h 的VCAM-1、MDA及24 h、48 h時BUN、SCr、VCAM-1、MDA、腎小管損傷程度評分明顯較IR1組上升，SOD下降；IPO2組與IPO1組相比，6 h、12 h、24 h時VCAM-1、MDA均明顯升高，SOD下降；24 h BUN、SCr、腎小管損傷程度評分也明顯上升；IR1組與IPO1組相比，在24 h時除SCr外，BUN、VCAM-1、MDA、腎小管損傷程度評分均上升，SOD下降，48 h時VCAM-1、腎小管損傷程度評分明顯較IPO1組上升，SOD下降；IPO2組與IR1組相比，在12 h、24 h時，VCAM-1、MDA、腎小管損傷程度評分均上升，SOD下降；在48 h時除MDA外，BUN、SCr、VCAM-1、腎小管損傷程度評分明顯上升，SOD下降(P均>0.05)。結(jié)論 在大鼠腎臟缺血再灌注損傷發(fā)生之前即預(yù)防性使用TMZ可減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，使血清VCAM-1水平下降，與單純?nèi)毖俟嘧⒑筇幚?IPO)比較，氧化應(yīng)激反應(yīng)明顯減輕，VCAM-1水平降低。

鹽酸曲美他嗪；缺血再灌注損傷；氧化應(yīng)激；黏附分子

缺血再灌注損傷是導(dǎo)致急性腎損傷的關(guān)鍵因素之一。大量研究表明，腎臟在缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IR)期間可通過氧自由基生成增加[1-2]、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、多種凋亡調(diào)控基因的表達(dá)改變和黏附分子表達(dá)增加等途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其中內(nèi)皮細(xì)胞損傷、黏附分子表達(dá)增加、氧化-抗氧化平衡系統(tǒng)紊亂可能是IR導(dǎo)致急性腎小管上皮細(xì)胞壞死的重要因素之一[3]。因此，需要不斷的尋找可以減輕腎臟氧化應(yīng)激反應(yīng)、降低黏附分子表達(dá)的藥物，以改善急性腎損傷的預(yù)后。曲美他嗪是一種新型的心肌代謝類藥物，可以通過其抑制脂肪酸β氧化，促進(jìn)葡萄糖有氧氧化，從而起到抗心肌缺血，改善心功能的作用。目前，國內(nèi)外的研究認(rèn)為，它可能通過抗氧化應(yīng)激的機制對心臟產(chǎn)生一定的保護(hù)作用[4-6]，本研究即觀察鹽酸曲美他嗪(trimetazidine，TMZ)在腎臟IR時對其氧化應(yīng)激狀態(tài)及血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1)的影響。

材料與方法

一、實驗材料

健康雄性SD大鼠90只(中山大學(xué)實驗動物中心)15周齡，體質(zhì)量(263±10)g；TMZ(法國施維雅藥廠)；血清尿素氮(BUN)、 血肌酐(SCr)、VCAM-1、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；721分光光度計(上海精密科學(xué)儀器公司)；光學(xué)顯微鏡(日本olymus公司)。

二、動物模型制作與分組

隨機將大鼠分為A、B兩組，每組45只，適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d，溫度約為23 ℃，濕度60%，12 h交替照明，自由飲水、飲食。第3天，A組給予生理鹽水稀釋的TMZ 10 mg·kg-1·d-1灌胃5 d，再隨機分為缺血再灌注(IR1)組、缺血再灌注后處理組(ischemic postconditioning，IPO1)、假手術(shù)(S1)組，每組15只。B組大鼠生理鹽水灌胃，生理鹽水用法、用量同TMZ，再隨機分為缺血再灌注(IR2)組、缺血再灌注后處理(IPO2)組、假手術(shù)(S2)組，每組15只。參考Basile等[7]的方法制備缺血再灌注的急性腎損傷動物模型， 缺血再灌注后處理(IPO)：在缺血45 min后用血管夾同時給予雙側(cè)腎臟恢復(fù)血供20 s、阻斷血供20 s處理，反復(fù)10次后恢復(fù)血供。假手術(shù)組：手術(shù)方法同上，但僅分離出大鼠雙側(cè)腎動脈，不進(jìn)行夾閉。手術(shù)后肉眼觀察腎臟恢復(fù)灌注，除在0 h時取標(biāo)本組沒有縫合腹腔，剩余大鼠均逐層縫合腹腔。各組缺血過程保持大鼠肛溫在36.5～37.0 ℃。

三、血清BUN、SCr、VCAM-I、MDA、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)水平檢測

在末次恢復(fù)腎臟血供0、6、12、24、48 h，取A、B組缺血再灌注、缺血再灌注后處理大鼠各3只分別經(jīng)眶后靜脈叢采集靜脈血2～3 ml，離心(3 000 r/min)15 min，取血清于-20 ℃保存，待測血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)。2組各時間點采血樣本均為3只?；瘜W(xué)比色法檢測血BUN、SCr。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附檢測法(ELISA)測定VCAM-I、MDA、SOD。

四、腎臟組織形態(tài)學(xué)觀察

脊椎脫臼法處死大鼠、開腹，取部分腎組織用100 ml/L甲醛固定，常規(guī)脫水、包埋、切片后行HE和PAS染色。光鏡下觀察形態(tài)，參考Paller等的方法進(jìn)行評分，隨機選擇10個無重疊視野(×200)，每個視野下隨機選擇10處腎小管，共按100個腎小管計分，分?jǐn)?shù)越高表示腎小管損傷程度越嚴(yán)重。

五、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用完全隨機設(shè)計的單因素方差分析(ANOVA)，2組比較采用獨立樣本t檢驗，多組之間的兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

與IR1組比較，IR2組6 h的VCAM-1、MDA及24 h、48 h時BUN、SCr、VCAM-1、MDA、腎小管損傷程度評分明顯較IR1組上升，SOD下降。與IPO1組比較，IPO2組6 h、12 h、24 h時VCAM-1、MDA均明顯升高，SOD下降；24 h的BUN、SCr、腎小管損傷程度評分也明顯上升。IR1組與IPO1組比較，在24 h時除SCr外，BUN、VCAM-1、MDA、腎小管損傷程度評分均上升，SOD下降，48 h時VCAM-1、腎小管損傷程度評分明顯較IPO1組上升，SOD下降。IPO2組與IR1組比較，在12 h、24 h時，VCAM-1、MDA、腎小管損傷程度評分均上升，SOD下降；在48 h時除MDA外，BUN、SCr、VCAM-1腎小管損傷程度評分明顯上升，SOD下降(P均>0.05)。(表1)

討 論

IR的概念于1960年首次提出,指缺血組織或器官重獲血流灌注或氧供應(yīng)后,對組織或者器官所產(chǎn)生的損傷作用。腎臟IR是急性腎衰竭的常見原因, 也是腎臟移植術(shù)后影響移植物早期功能恢復(fù)和移植物長期存活的主要因素之一。本研究顯示，SD大鼠無論在IR或IPO時均發(fā)生了急性腎損傷，A、B兩組SD大鼠在24 h及48 h后均出現(xiàn)了血BUN、SCr及腎小管損傷程度評分的上升，與相應(yīng)對照組比較有顯著性差異，且出現(xiàn)了早期的MDA及SOD的下降，說明在IR或IPO時均存在氧化應(yīng)激反應(yīng)。在正常的腎臟，VCAM-1僅表達(dá)于鮑曼氏囊的壁層上皮細(xì)胞和少數(shù)的近曲小管上皮細(xì)胞，而內(nèi)皮細(xì)胞不表達(dá)VCAM-1。本實驗中A、B兩組SD大鼠的血清VCAM-1水平均在6 h時與相應(yīng)對照組比較顯著上升，說明在IR或IPO時早期均已出現(xiàn)小管上皮細(xì)胞損傷，且VCAM-1主要參與免疫細(xì)胞的黏附與遷移，在免疫炎癥反應(yīng)中具有重要的作用，可能IR或IPO的早期即有免疫炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

TMZ在心肌的保護(hù)作用中主要通過增強組織葡萄糖氧化代謝、恢復(fù)糖酵解和碳水化合物之間的耦聯(lián)，在耗氧較少的情況下產(chǎn)生三磷酸腺苷，同時減輕心肌細(xì)胞內(nèi)酸中毒和高鈣血癥、限制炎癥反應(yīng)以及減少氧自由基生成等抗缺血再灌注損傷從而起到保護(hù)心肌的作用[8-11]。本研究顯示，IR2組與IR1組比較，6 h、24 h、48 h時IR2組的VCAM-1、MDA及24 h、48 h時BUN、SCr、腎小管損傷程度評分明顯較IR1組上升，SOD下降；IPO2組與IPO1組比較，6 h、12 h、24 h時VCAM-1、MDA均明顯升高，SOD下降，24 h時BUN、SCr、腎小管損傷程度評分均明顯上升，SOD下降，說明經(jīng)過TMZ預(yù)處理的SD大鼠無論在IR或IPO時均可以緩解急性腎損傷的程度，減輕腎小管損傷及氧化應(yīng)激反應(yīng)，使血清VCAM-1水平下降。

表1 各組BUN、SCr、VCAM-1、MDA、SOD水平及腎小管損傷程度評分的比較

注：與相應(yīng)的S1組、S2組比較,aP<0.05；與IR2組比較,bP<0.05；與IPO2組比較,cP<0.05；與IPO1組比較,dP<0.05；與IPO2組比較,eP<0.05

急性腎缺血再灌注損傷后處理對缺血再灌注損傷的保護(hù)作用已經(jīng)得到公認(rèn)，IPO現(xiàn)已經(jīng)是臨床中對缺血-再灌注損傷治療的一個重要手段，如在冠心病的治療、器官移植中的運用[12-15]，其保護(hù)機制可能與抑制氧自由基堆積、增強機體的抗氧化能力、抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載及細(xì)胞凋亡等有關(guān)。近年來對急性腎損傷的藥物的研究進(jìn)展將其分為抑制細(xì)胞死亡類、抗炎類和修復(fù)類等，但在美國腎臟替代治療仍是唯一被聯(lián)邦食品藥品管理局認(rèn)可的治療急性腎損傷的有效措施，尚沒有藥品得到認(rèn)可，因此本實驗同時與急性腎缺血再灌注損傷后處理對腎臟的保護(hù)作用做對比，進(jìn)一步觀察曲美他嗪的保護(hù)作用。本實驗中IR1組與IPO1組相比，在24 h時除SCr外，BUN、VCAM-1、MDA、腎小管損傷程度評分均上升，SOD下降亦證實IPO的保護(hù)作用，同時IPO2組與IR1組相比，在12 h、24 h時，VCAM-1、MDA、腎小管損傷程度評分均上升，SOD下降；在48 h時BUN、SCr亦明顯上升(P均>0.05)，提示實驗前使用TMZ可獲得與缺血后處理相似的收益。

綜上所述，在IR發(fā)生前即預(yù)防性使用TMZ可以減輕腎臟IR的氧化應(yīng)激反應(yīng)，使VCAM-1水平下降。

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The influence of trimetazidine hydrochloride on acute ischemia-reperfusion injury of endothelial cells and oxidative stress response of rat kidney

DUYi,QIANBai-yin,LISu-xia,LIMi.

TheFifthAffiliatedHospitalofSunYat-SenUniversityRenalMedicineBloodpurificationCenter,Zhuhai519000,China

Objective To observe the effects of trimetazidine (TMZ) preconditioning on endothelial cell injury and oxidative stress in rats with acute renal ischemia-reperfusion. Methods 90 SD rats were randomly divided into A and B groups. Group A was given TMZ at a dose of 10 mg/kg. After lavaged for 5 days, ischemia-reperfusion injury (IR1), ischemic postconditioning (IPO1), sham operated (S1) were established. In the same way, the IR2, IPO2 and S2 were established in group B after 5 days of saline enema. The levels of serum creatinine (SCr), urea nitrogen (BUN), vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1), malondialdehyde (MDA) superoxide dismutase (SOD) were measured at 0, 6, 12, 24 and 48 h after the last recovery of kidney blood supply in each group. Results Compared with IR1 group, the levels of VCAM-1, MDA at 6 h and BUN, SCr, VCAM-1, MDA and renal tubular injury score at 24 and 48 h in IR2 group were significantly higher than those in IR1 group, while SOD was decreased; Compared with IPO1 group, the levels of VCAM-1 and MDA at 6, 12 and 24 h and BUN, SCr and renal tubular injury score at 24 h in IPO2 group were significantly increased, while SOD was decreased at 6, 12 and 24 h; Compared with IPO1 , apart from SCr, the levels of BUN, VCAM-1, MDA and renal tubular injury score at 24 h in IR1 group were increased and the levels of VCAM-1, renal tubular injury score at 48 h in IR1 group were significantly increased, and SOD was decreased at both time points; Compared with IR1 group, the levels of VCAM-1, MDA and renal tubular injury score at 12 and 24 h in IPO2 group were increased, while SOD were decreased and apart from MDA, the levels of BUN, SCr, VCAM-1 and renal tubular injury score at 48 h in IPO2 group were significantly increased, while SOD was decreased (P>0.05). Conclusions Compared with IPO alone, using TMZ can reduce the oxidative stress response and decrease the serum VCAM-1 level before the occurrence of IR in rats.

Trimetazidine hydrochlorid; Ischemia-reperfusion injury; Oxidative stress response; Vascularcelladhe-sionmoleculel

10.3969/j.issn.1671-2390.2017.05.009

廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金(No.WSTJJ20101210640102196912170323)

519000 珠海，中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院腎內(nèi)科血液凈化中心

2016-10-23

2017-02-02)