郭振華，陳鑫鑫，郭軍慶，喬松林

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450002)

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研究論文

豬繁殖與呼吸綜合征病毒主要流行毒株檢測(cè)方法的建立

郭振華，陳鑫鑫，郭軍慶，喬松林*

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450002)

旨在建立針對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒田間主要流行毒株的鑒別診斷方法。通過(guò)比對(duì)當(dāng)前田間主要流行毒株的基因序列，分別設(shè)計(jì)了針對(duì)ORF5基因的通用引物和針對(duì)Nsp2基因的鑒別引物。RT-PCR結(jié)果顯示，兩對(duì)引物針對(duì)不同的毒株均可以擴(kuò)增出特異性的目的條帶，通用引物可以用來(lái)檢測(cè)田間主要的流行毒株，鑒別引物可以區(qū)分當(dāng)前田間主要流行的不同毒株。所建立的檢測(cè)方法具有良好的特異性和敏感性，可以方便地應(yīng)用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分子流行病學(xué)監(jiān)控和快速檢測(cè)診斷，具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；ORF5基因；Nsp2基因；反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)感染引起的，以母豬繁殖障礙和不同年齡段的豬呼吸系統(tǒng)疾病為主要特征的傳染性疫病[1]。美國(guó)在1987年首次報(bào)道了PRRS的發(fā)生，歐洲在1991年分離到了PRRSV，隨后本病在世界范圍內(nèi)廣泛流行[2]。PRRSV屬于動(dòng)脈炎病毒科(Arteriviridae)，動(dòng)脈炎病毒屬(Arterivirus)，有囊膜，基因組為單股正鏈RNA，大小約15 kb，有11個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frame，ORF)，編碼16個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白和8個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白[3]。

基于基因組序列及抗原特性差異，PRRSV可以分為兩大基因型，即以歐洲型毒株LV為代表的基因Ⅰ型和以美洲型毒株VR-2332為代表的基因Ⅱ型。隨著PRRSV毒株的不斷變異，每個(gè)基因型又分為若干個(gè)亞型或者譜系(lineage)[1,4,5]。我國(guó)在1996年，由郭寶清等首次分離到了PRRSV，命名為CH-1株，隨后PRRSV在我國(guó)各地呈流行性狀態(tài)。分子遺傳學(xué)分析顯示，我國(guó)流行的毒株主要屬于美洲型[6]。2006年，由高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Highly pathogenic PRRSV，HP-PRRSV)導(dǎo)致的PRRS在我國(guó)暴發(fā)并大范圍流行，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失。代表性毒株JXA1基因組分析顯示，HP-PRRSV的Nsp2編碼區(qū)具有特征性的不連續(xù)30個(gè)氨基酸的缺失(481位和533-561位氨基酸)[7]。之后的分子流行病學(xué)研究顯示，HP-PRRSV逐步成為田間流行的優(yōu)勢(shì)毒株[5]。2013年以來(lái)，一種新的PRRSV變異毒株在田間被檢測(cè)到，代表性毒株分子遺傳學(xué)分析顯示，該流行毒株與北美地區(qū)流行毒株具有很近的遺傳距離，與北美地區(qū)流行的代表性毒株NADC30在Nsp2編碼區(qū)具有一致的缺失模式——不連續(xù)131個(gè)氨基酸的缺失(323-433位、482位、504-522位氨基酸)，隨后的分子流行病學(xué)研究顯示，NADC30-like毒株在我國(guó)多個(gè)地區(qū)呈流行態(tài)勢(shì)[8-11]。

因此，目前我國(guó)田間流行的PRRSV毒株大致分為3類，即以CH-1a為代表的經(jīng)典類毒株(CH-1a-like strains)，以JXA1位代表的HP-PRRSV類毒株(HP-PRRSV)，以JL580為代表的NADC30-like類毒株(NADC30-like strains)。PRRSV的快速檢測(cè)和毒株種類的確定，對(duì)于PRRS的防控具有重要的指導(dǎo)意義。目前基于RT-PCR和RT-qPCR技術(shù)建立了多種檢測(cè)不同PRRSV流行毒株的方法，如針對(duì)歐洲型、美洲型和高致病性PRRSV的鑒別診斷[12]。但毒株的確定往往要依賴于ORF5基因的序列測(cè)定和分子進(jìn)化樹分析，對(duì)技術(shù)人員要求較高，得到結(jié)果也需要更長(zhǎng)的時(shí)間。本研究通過(guò)對(duì)田間主要流行的代表性毒株進(jìn)行序列比對(duì)分析，設(shè)計(jì)了針對(duì)ORF5基因的通用引物，主要用于不同美洲型毒株的檢測(cè)；同時(shí)根據(jù)當(dāng)前主要流行毒株Nsp2編碼區(qū)特征性的堿基序列缺失模式，設(shè)計(jì)了一對(duì)鑒別引物，通過(guò)比較RT-PCR產(chǎn)物片段的大小，可以快速確定PRRSV毒株類別的檢測(cè)方法。該方法具有良好的敏感性和特異性，具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 引物設(shè)計(jì)參考毒株及GenBanK登錄號(hào)分別為：CH-1a(AY032626)、BJ-4(AF331831)HuN4(EF635006)、JXA1(EF112445)、NADC30(JN654459)、JL580(KR706343)；RT-PCR所用模板來(lái)源毒株及GenBanK登錄號(hào)：BJ-4(AF331831)和HN07由本實(shí)驗(yàn)保存。

1.1.2 主要試劑 病毒基因組提取試劑盒Viral RNA/DNA Extraction Kit、逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(RNase H-)、6聚體隨機(jī)引物Hexadeoxyribonucleotide mixture- pd(N)6、Oligo (dT)15 Primer、DL2 000 DNA Marker、Mighty TA-cloning Kit購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)；TaqPlus Master Mix購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 本研究所使用的引物序列信息見(jiàn)表1。序列比對(duì)使用DNA Man軟件進(jìn)行分析，引物由生工生物(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 RNA提取及cDNA的合成 按Viral RNA/DNA Extraction Kit使用說(shuō)明書從細(xì)胞培養(yǎng)物(BJ-4和HN-07)、組織樣品(HNzm1、HNam2、HNhx)中提取總RNA；按照M-MLV(RNase H-)說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體條件為：Hexadeoxyribonucleotide mixture- pd(N)6(100 μmol/L)和Oligo (dT)15 Primer(50 μmol/L)各0.5 μL。反轉(zhuǎn)錄程序：30℃ 10 min，42℃ 60 min，70℃ 15 min，4℃ 10 min。將反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系(25 μL)如下：2 xTaqPlus MasterMix 12.5 μL，cDNA模板2 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)參數(shù)如下：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物采用15 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。

1.2.4 基因克隆與測(cè)序 采用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，利用凝膠回收試劑盒回收目的片段，連接pMD19-T載體后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂氨芐青霉素抗性的LB平板，37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜。菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆，PCR反應(yīng)體系和條件同1.5，最后將陽(yáng)性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 序列分析 利用生物學(xué)軟件MEGA6.0對(duì)擴(kuò)增的ORF5基因和參考毒株的ORF5基因進(jìn)行序列同源性分析，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹[13]。利用DNA Star MegAlign(Clustal V method)進(jìn)行比對(duì)分析，將測(cè)序獲得的Nsp2序列與參考毒株進(jìn)行多序列比對(duì)分析，確定Nsp2編碼區(qū)的序列缺失模式。

1.2.6 特異性和敏感性分析 分別選擇豬瘟病毒(CSFV)、日本腦炎病毒(JEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬圓環(huán)病毒(PCV)、豬細(xì)小病毒(PPV)的臨床陽(yáng)性病料，用獲得的cDNA或者DNA作為模板，進(jìn)行ORF5和Nsp2引物的特異性檢驗(yàn)。用純化的含有目的基因片段的pMD20-T質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)定量質(zhì)粒，用于ORF5和Nsp2引物的敏感性檢測(cè)，基因片段拷貝數(shù)計(jì)算公式如下：

Y(拷貝數(shù)/μL)=[質(zhì)粒DNA的濃度(g/μL)/(質(zhì)粒DNA長(zhǎng)度bp×660)]×60.2×1023

2 結(jié)果

2.1 引物設(shè)計(jì)

利用DNA Man和DNA Star MegAlign(Clustal V method)生物學(xué)軟件，針對(duì)CH-1a、BJ-4、HuN4、JXA1、NADC30、JL580等代表性毒株，進(jìn)行序列比對(duì)分析，分別設(shè)計(jì)了針對(duì)ORF5基因的通用引物和針對(duì)Nsp2基因的鑒別引物，詳細(xì)序列信息見(jiàn)表1。

2.2 ORF5基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用設(shè)計(jì)的ORF5通用引物，檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)室保存的標(biāo)準(zhǔn)毒株BJ-4、HN07以及臨床送檢代表性樣本，均可以獲得特異性的擴(kuò)增條帶，目的條帶大小約851 bp(圖1)，提示該引物可以用于田間流行PRRSV毒株的檢測(cè)。

2.3 基于ORF5基因的分子進(jìn)化樹分析

將獲得的陽(yáng)性樣品進(jìn)行序列測(cè)定，進(jìn)一步通過(guò)分子進(jìn)化樹分析，顯示HN07、HNzm1和HNzm2屬于高致病性毒株，HNhx屬于類NADC30毒株(圖2)，同時(shí)也進(jìn)一步提示針對(duì)ORF5基因的引物對(duì)當(dāng)前流行毒株具有很好的通用性。

2.4 Nsp2部分片段擴(kuò)增結(jié)果

利用上述cDNA模板和擴(kuò)增Nsp2特定區(qū)域的特異性引物，獲得了不同大小的擴(kuò)增產(chǎn)物其中以經(jīng)典毒株BJ-4為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物大小約1 040 bp，以高致病性毒株HN07、HNzm1、HNzm2為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物大小約950 bp，以NADC30-like毒株HNhx為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物大小約647 bp(圖3)。

表1 引物序列及信息

1～5.樣品BJ-4、HN07、HNzm1、HNzm2、HNhx 1-5.Samples BJ-4,HN07,HNzm1,HNzm2,HNhx

圖2 基于ORF5基因的分子進(jìn)化樹分析

2.5 Nsp2部分片段序列分析

將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定分析顯示，與經(jīng)典毒株CH-1a相比，HNzm1和HNzm2具有高致病性毒株(JXA1)特征性的氨基酸缺失模式-481為和533-561位不連續(xù)30個(gè)氨基酸的缺失；HNhx具有NADC30毒株特征性的缺失模式-323-433位、482位和504-522位不連續(xù)的131個(gè)氨基酸的缺失(圖4)。證明本研究所設(shè)計(jì)的引物可以特異性擴(kuò)增不同毒株的Nsp2序列，且可以用于區(qū)分3種主要田間流行毒株。

1.BJ-4毒株；2～4.分別為HN07、HNzm1、HNzm2毒株；5.HNhx毒株

1. BJ-4 strain;2-4. HN07、HNzm1、HNzm2 strains;5. HNhx strain

圖3 不同毒株Nsp2基因序列檢測(cè)結(jié)果

Fig.3 RT-PCR results of Nsp2 gene for different PRRSV strains

2.6 特異性分析

選取了臨床常見(jiàn)的病原來(lái)檢驗(yàn)所設(shè)計(jì)的引物是否存在非特異擴(kuò)增。針對(duì)豬瘟病毒(CSFV)、日本腦炎病毒(JEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬圓環(huán)病毒(PCV)、豬細(xì)小病毒(PPV)臨床陽(yáng)性病料的RT-PCR/PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，用作陽(yáng)性對(duì)照的引物均擴(kuò)增出特定大小的產(chǎn)物，而針對(duì)ORF5和Nsp2的引物均未出現(xiàn)非特異的擴(kuò)增(圖5)。

2.7 敏感性分析

將含有病毒目的基因的pMD20-T載體提取純化，定量后做10倍系列稀釋。PCR結(jié)果顯示，針對(duì)ORF5基因的擴(kuò)增在稀釋至10-7時(shí)依然可以看到特異性條帶，對(duì)應(yīng)目的基因拷貝數(shù)為2.34×102(圖6 A)；針對(duì)Nsp2的擴(kuò)增在稀釋至10-6時(shí)可以獲得清晰的特異性條帶，對(duì)應(yīng)的基因拷貝數(shù)為1.52×103(圖6 B)。提示所建立的檢測(cè)方法具有很高的敏感性，適于用于臨床樣本的檢測(cè)。

HNzm1、HNzm2具有和JXA1一致的氨基酸缺失模式；HNhx和NADC30具有一致的氨基酸缺失模式 The amino acid deletion pattern of HNzm1 and HNzm2 is consistent with that of JXA1.The HNhx and NADC30 are consistent

1、4、7、10、13、16、19.分別為陽(yáng)性對(duì)照；2、5、8、11、14、17、20.為針對(duì)ORF5的引物擴(kuò)增結(jié)果；3、6、9、12、15、18、21.為針對(duì)Nsp2引物擴(kuò)增結(jié)果

1，4，7，10，13，16 and 19. Positive control，respectively；2，5，8，11，14，17，20.The ORF5 primer；3，6，9，12，15，18，21. Nsp2 primer

圖5 針對(duì)ORF5和Nsp2基因擴(kuò)增引物的特異性分析

Fig.5 The specificity assay of ORF5 primer and Nsp2 primer

圖6 針對(duì)ORF5(A)和×(B)基因擴(kuò)增引物的敏感性分析

3 討論

豬繁殖與呼吸綜合征是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病，病毒基因組的高變異性、不同毒株間血清學(xué)交叉保護(hù)反應(yīng)差是PRRSV的顯著特點(diǎn)。我國(guó)自1996年首次分離到PRRSV以來(lái)，至今PRRSV在全國(guó)范圍內(nèi)流行已有20年，期間PRRSV病毒基因組發(fā)生了較大的變異，毒力和增殖特性也發(fā)生了相應(yīng)的變化[6,7,9]。如2006年HP-PRRSV在豬群中暴發(fā)給養(yǎng)豬業(yè)造成了沉重打擊。之后雖然開(kāi)發(fā)出了一系列疫苗，但在實(shí)際生產(chǎn)中防控效果不太理想，HP-PRRSV在我國(guó)豬場(chǎng)還在流行[1,16-18]。2013年-2014年，一種類NADC30毒株在我國(guó)多個(gè)地區(qū)(黑龍江、吉林、天津、北京、河南、浙江、福建)流行[10]。NADC30-like毒株是從北美輸入的毒株，且和HP-PRRSV發(fā)生了基因重組，現(xiàn)有PRRS的防控措施對(duì)該毒株控制效果較差。

PRRSV在我國(guó)經(jīng)過(guò)20年的流行變異，對(duì)本病的防控構(gòu)成了嚴(yán)重的挑戰(zhàn)。雖然現(xiàn)有的商品疫苗在特定的歷史階段發(fā)揮了重要的作用，但也正是在疫苗大范圍、高強(qiáng)度使用之后，我國(guó)的PRRSV毒株變異速率進(jìn)一步加快、多樣性進(jìn)一步加大。免疫壓力下對(duì)病毒變異的影響、弱毒疫苗潛在的毒力返強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)、疫苗毒株和田間流行毒株發(fā)生重組的風(fēng)險(xiǎn)等，都是當(dāng)前需要進(jìn)一步反思的問(wèn)題。

鑒于當(dāng)前我國(guó)田間主要流行3類PRRSSV毒株，我們通過(guò)不同毒株的多序列比對(duì)分析，設(shè)計(jì)了針對(duì)ORF5基因的特異性通用引物，該引物可以用于檢測(cè)不同PRRSV毒株；根據(jù)目前主要流行毒株Nsp2基因特征性的序列缺失模式，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性的鑒別引物，根據(jù)擴(kuò)增片段大小的差異，該引物可以用于區(qū)分經(jīng)典的PRRSV毒株、HP-PRRSV毒株和NADC30-like毒株。本研究建立的檢測(cè)分析與臨床常見(jiàn)病毒無(wú)非特異性反應(yīng)，利用含有目的基因的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，本方法在目的基因片段低至2.34×102(ORF5)拷貝數(shù)和1.52×103(Nsp2)拷貝數(shù)時(shí)依然可以檢出目的片段，說(shuō)明該方法具有很好的特異性和敏感性，可以用于臨床PRRSV的快速診斷和毒株的初步確定，同時(shí)也便于進(jìn)行進(jìn)一步的序列測(cè)定和分子進(jìn)化樹分析。本研究對(duì)于PRRSV的防控和分子流行病學(xué)監(jiān)控具有重要的參考價(jià)值。

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Development of a RT-PCR Assay for Detection of Primarily Epidemic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

GUO Zhen-hua1,CHEN Xin-xin1,GUO Jun-qing1,QIAO Song-lin1
(1.HenanKeyLaboratoryofAnimalImmunology,HenanAcademyofAgriculturalSciences,Zhengzhou,Henan,450002,China)

To detect and distinguish the primarily epidemic porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV) strains,we developed a RT-PCR assay method.According to the multiple sequence alignment,we designed two pairs of primers based on ORF5 gene and partial Nsp2 gene sequences respectively.The result of RT-PCR suggested that both of the primers could produce specific objective fragments by cDNA templates from different PRRSV strains.Further，the specificity and sensitivity of this RT-PCR assay were good.It’s very useful and convenient for the quick diagnosis and epidemiological surveillance.

PRRSV; ORF5 gene; Nsp2 gene; RT-PCR

2016-09-29

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFD0500709)；河南省生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(S2012-06)

郭振華(1984-)，男，執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師，農(nóng)學(xué)博士，主要從事豬疫病診斷與防控工作。*通訊作者

S852.65

A

1007-5038(2017)06-0001-05