郭偉娜，路振香，劉利曉，龔 爭(zhēng)

(1.安徽科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，安徽鳳陽(yáng) 233100；2.河南省駐馬店市畜牧局，河南駐馬店 463000)

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滁州活禽市場(chǎng)雞源沙門(mén)菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

郭偉娜1，路振香1，劉利曉2，龔 爭(zhēng)1

(1.安徽科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，安徽鳳陽(yáng) 233100；2.河南省駐馬店市畜牧局，河南駐馬店 463000)

從安徽滁州地區(qū)某活禽市場(chǎng)采集雞的肛拭子樣品110份，接種到麥康凱培養(yǎng)基分離純化，再選取典型菌落進(jìn)行三糖鐵、吲哚、甲基紅、VP等生化試驗(yàn)及16S rRNA的PCR鑒定，最后對(duì)沙門(mén)菌分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。110份樣品經(jīng)分離純化得到29株疑似沙門(mén)菌菌株，通過(guò)生化試驗(yàn)及16S rRNA的分子鑒定，共分離到23株沙門(mén)菌，檢出率為20.9%；藥敏試驗(yàn)表明，沙門(mén)菌分離株對(duì)鏈霉素和阿米卡星的耐藥率相對(duì)較低，而對(duì)慶大霉素、大觀霉素、哌拉西林的耐藥率均高達(dá)82.61%。對(duì)克林霉素的耐藥率為100%。

沙門(mén)菌；雞；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)

沙門(mén)菌是腸桿菌科的一種革蘭陰性菌，廣泛存在于人和多種動(dòng)物腸道中，例如牛、馬、豬等哺乳動(dòng)物，雞、鴨、鵝等家禽，以及其他爬行動(dòng)物和兩棲動(dòng)物[1]。大多數(shù)沙門(mén)菌對(duì)人和動(dòng)物具有致病性，其血清型有2500多個(gè)，并且不同血清型對(duì)各種動(dòng)物的致病性也不相同，能夠引起常見(jiàn)多發(fā)的人畜共患病[2]。其中致病性雞沙門(mén)菌為禽類(lèi)的重要病原菌，可引發(fā)雞白痢、雞傷寒和雞副傷寒等，雛雞感染后引起大批死亡，成年雞導(dǎo)致生產(chǎn)性能下降，病死率高達(dá)80%，并且能夠垂直傳播，已成為危害養(yǎng)禽業(yè)的首要傳染病之一[3]。目前對(duì)沙門(mén)菌病的防治主要依賴(lài)于抗生素，但由于大量使用或?yàn)E用抗生素，使得沙門(mén)菌的耐藥性更加嚴(yán)重，甚至出現(xiàn)多重耐藥，再加上耐藥性會(huì)通過(guò)質(zhì)粒傳遞給其他病原菌或動(dòng)物，這些耐藥菌株的產(chǎn)生及動(dòng)物產(chǎn)品中的藥物殘留，進(jìn)一步直接或間接地威脅到人類(lèi)健康。

沙門(mén)菌在我國(guó)的感染率較高，人會(huì)因誤食沙門(mén)菌污染的動(dòng)物源產(chǎn)品而引發(fā)沙門(mén)菌病，所以已成為世界范圍內(nèi)一種重要的食源性致病菌[4]。沙門(mén)菌的感染一般認(rèn)為是通過(guò)食物，但近年來(lái)沙門(mén)菌病的暴發(fā)情況表明，直接或間接接觸動(dòng)物是更常見(jiàn)的傳播途徑[5]。美國(guó)疾病控制中心報(bào)告指出，2007年開(kāi)始，人沙門(mén)菌感染的暴發(fā)與接觸動(dòng)物及其周?chē)h(huán)境的相關(guān)性研究越來(lái)越多，例如烏龜、松獅蜥、青蛙、刺猬和家禽等。每年美國(guó)所有的沙門(mén)菌感染中大約有11%歸因于與動(dòng)物接觸，尤其是兒童的發(fā)病和死亡的風(fēng)險(xiǎn)更高[1]。隨著活禽市場(chǎng)的不斷增多和普及，與活禽相關(guān)的沙門(mén)菌病的暴發(fā)也在逐步增加，有研究對(duì)1990至2014年間美國(guó)活禽相關(guān)沙門(mén)菌病的流行病學(xué)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)這些患者有雞和鴨接觸史的比例分別占85%和38%[6]。早在20世紀(jì)90年代美國(guó)和歐盟等西方國(guó)家就已經(jīng)開(kāi)展了對(duì)食品動(dòng)物中沙門(mén)菌病流行性的調(diào)查，而且每年都會(huì)發(fā)布監(jiān)測(cè)結(jié)果；歐盟還嚴(yán)格制定了肉雞腸炎沙門(mén)菌的控制措施和目標(biāo)，但目前國(guó)內(nèi)對(duì)活禽市場(chǎng)雞沙門(mén)菌病的流行情況研究資料較少。因此，本研究主要是對(duì)安徽滁州地區(qū)活禽市場(chǎng)雞源沙門(mén)菌進(jìn)行分離鑒定及藥敏試驗(yàn)，了解該地區(qū)雞沙門(mén)菌病的流行及耐藥情況，也為該病的綜合防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB營(yíng)養(yǎng)肉湯、麥康凱培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基、蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水按照相關(guān)文獻(xiàn)[7]配制；Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒和即用型PCR擴(kuò)增試劑盒，購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司。

1.1.2 藥敏紙片 鏈霉素(10 μg/片)、卡那霉素(30 μg/片)、阿米卡星(30 μg/片)、慶大霉素(10 μg/片)、環(huán)丙沙星(5 μg/片)、克林霉素(2 μg/片)、大觀霉素(100 μg/片)、哌拉西林(100 μg/片)，以上藥敏試紙片均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 于2014年3月至5月期間，在安徽滁州地區(qū)某活禽市場(chǎng)采集雞的肛拭子樣品110份，保存于含有LB營(yíng)養(yǎng)肉湯500 μL的1.5 mL離心管中。

1.2.2 分離培養(yǎng)及生化鑒定 首先在LB營(yíng)養(yǎng)肉湯中37℃增殖培養(yǎng)24 h，然后用接種環(huán)挑取增菌液接種于麥康凱培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h后，觀察菌落生長(zhǎng)情況，并挑取沙門(mén)菌典型菌落接種于麥康凱培養(yǎng)基上進(jìn)行純化。挑取適量純化后的菌落培養(yǎng)物分別進(jìn)行三糖鐵、吲哚、甲基紅和VP試驗(yàn)。

1.2.3 16S rRNA鑒定 按照DNA提取試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行疑似沙門(mén)菌的核酸提取。參考GenBank中沙門(mén)菌16S rRNA序列，設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增目的片段大小為766 bp。引物由上海生物工程股份有限公司合成，序列如下。

上游引物：5′-AAGAAGCACCGGCTAACTCC-3′

下游引物：5′-CGCTTCTCTTTGTATGCGCC-3′

PCR擴(kuò)增及測(cè)序分析。PCR反應(yīng)體系為50 μL，按照PCR擴(kuò)增試劑盒要求加樣。反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；94℃ 30 s，57℃ 45 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。取10 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將有目的條帶的PCR產(chǎn)物送至南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 將沙門(mén)菌分離菌株接種到LB營(yíng)

養(yǎng)肉湯，待生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后，用涂玻棒將其涂布到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，用無(wú)菌小鑷子夾取藥敏試紙片均勻貼到培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)18 h～24 h，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng)及生化鑒定結(jié)果

110份樣品經(jīng)麥康凱培養(yǎng)基分離純化后，有29份樣品符合沙門(mén)菌典型菌落特征，表現(xiàn)為圓形、半透明、邊緣整齊、表面光滑濕潤(rùn)、灰白色的小菌落。29份樣品的三糖鐵試驗(yàn)都表現(xiàn)為底部產(chǎn)酸呈黃色，且全部產(chǎn)氣，斜面除16號(hào)樣品外，均產(chǎn)堿呈紅色；除4、5、16、27、28、29號(hào)樣品外的23份樣品底部產(chǎn)H2S而呈黑色。吲哚試驗(yàn)結(jié)果表明，除16、27、28、29號(hào)樣品外，其它均呈黃色為陰性反應(yīng)，符合沙門(mén)菌的特性；甲基紅試驗(yàn)結(jié)果表明，除4、5、27和29號(hào)樣品外，其余均為紅色呈陽(yáng)性反應(yīng)，符合沙門(mén)菌的特征；VP試驗(yàn)結(jié)果均表現(xiàn)為黃色，即陰性反應(yīng)，符合沙門(mén)菌的特性。綜合以上結(jié)果，除4、5、16、27、28、29號(hào)樣品外，其余23份樣品的菌落均符合沙門(mén)菌特征。

2.2 16S rRNA鑒定

16S rRNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。除4、5、27、28、29號(hào)外，其余24個(gè)樣品均有766 bp的目的片段，其測(cè)序結(jié)果與沙門(mén)菌16S rRNA基因(登錄號(hào)：EU118094)同源性為100%。但由于16號(hào)菌株生化特征不符合，因此共分離得到23株沙門(mén)菌。

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

23株沙門(mén)菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，7、9、11、26號(hào)4個(gè)菌株對(duì)阿米卡星較為敏感，抑菌圈在20 mm以上；7號(hào)和22號(hào)菌株對(duì)鏈霉素的抑菌圈分別為28 mm和23 mm，高度敏感；23個(gè)菌株均對(duì)克林霉素均為耐藥，其中15個(gè)菌株抑菌圈為0，其余8個(gè)菌株的抑菌圈不明顯。

抑菌圈的大小可以反映待測(cè)菌對(duì)該測(cè)定藥物的敏感程度，對(duì)以上藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，23株沙門(mén)菌的具體耐藥情況見(jiàn)表2。由表2可知，阿米卡星和鏈霉素的耐藥率相對(duì)較低；但慶大霉素、大觀霉素和哌拉西林的耐藥率為82.61%，克林霉素耐藥率高達(dá)100%，多重耐藥較為嚴(yán)重。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

注:“-”無(wú)抑菌圈。

Note:“-”no inhibition zone.

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果分析

3 討論

沙門(mén)菌為一種無(wú)芽胞、無(wú)莢膜的革蘭陰性桿菌，是世界范圍最重要的人獸共患食源性病原菌，也是危害食品安全的重要風(fēng)險(xiǎn)因子，30%的食源性細(xì)菌污染由其引發(fā)[8]，其污染狀況直接關(guān)系著公共衛(wèi)生安全。本試驗(yàn)采集的110份雞肛拭子樣品均來(lái)自安徽滁州地區(qū)活禽市場(chǎng)，具有一定的公共衛(wèi)生學(xué)意義。鑒于沙門(mén)菌在麥康凱培養(yǎng)基上生長(zhǎng)特征較為典型，本試驗(yàn)選用該培養(yǎng)基進(jìn)行分離純化。細(xì)菌的生化試驗(yàn)種類(lèi)較多，但由于三糖鐵、吲哚、甲基紅、VP試驗(yàn)等是比較經(jīng)典的生化試驗(yàn)，所以選用這幾種生化鑒定方法，結(jié)合16S rRNA分子鑒定結(jié)果，從110份樣品中共分離到23株沙門(mén)菌，檢出率為20.9%。歐盟27個(gè)成員國(guó)在2009年和2010年對(duì)肉雞進(jìn)行的沙門(mén)菌監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，其平均帶菌率分別為5.0%和4.1%[9]。方翟研究報(bào)道[10]雞源沙門(mén)菌在湖北省各地區(qū)的分離率為9.52%，均低于本文的檢出率。但陸彥等研究表明山東省部分地區(qū)腸炎沙門(mén)菌的分離率為17.9%[11]；山東淄博地區(qū)在2011和2012年采集的雞肛拭子樣品中沙門(mén)菌的檢出率分別為33.3%和26.9%[12]；江蘇常州地區(qū)的肉雞肛拭子中沙門(mén)菌的陽(yáng)性率高達(dá)46.2%[13]，這些研究結(jié)果與本文一致，均具有較高的沙門(mén)菌檢出率。同樣，還有國(guó)外對(duì)禽類(lèi)及其產(chǎn)品中沙門(mén)菌的檢測(cè)，危地馬拉活禽市場(chǎng)中沙門(mén)菌的流行率為34.3%[14]；南斯拉夫科索沃地區(qū)39個(gè)蛋雞場(chǎng)的367份樣品中(糞便、灰塵、雞蛋、病死禽的內(nèi)臟等)，發(fā)現(xiàn)19個(gè)蛋雞場(chǎng)(49%)的38份樣品為沙門(mén)菌感染[15]；2010至2015年間捷克摩拉維亞地區(qū)52 735份肉類(lèi)及其產(chǎn)品中沙門(mén)菌的陽(yáng)性率為2.4%，但禽類(lèi)產(chǎn)品中的檢出率高達(dá)21.9%[16]。沙門(mén)菌在家禽及禽類(lèi)產(chǎn)品中的高檢出率，很可能是抗生素的不合理使用及濫用，導(dǎo)致多重耐藥的出現(xiàn)。另外，家禽感染沙門(mén)菌多數(shù)是一種亞臨床感染狀態(tài)，外表健康但能持續(xù)排出病菌，總體來(lái)說(shuō)沙門(mén)菌的排放在夏季較高，尤其在灰塵中含量最高[17]。如果不能及時(shí)對(duì)家禽進(jìn)行沙門(mén)菌的定期監(jiān)測(cè)，很難發(fā)現(xiàn)這種隱性感染，進(jìn)一步還會(huì)威脅到人類(lèi)健康。

本試驗(yàn)的藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，23株沙門(mén)菌對(duì)克林霉素的耐藥率高達(dá)100%，慶大霉素、大觀霉素和哌拉西林的耐藥率均為82.61%，環(huán)丙沙星為73.91%、卡那霉素為69.56%，最低的鏈霉素為47.83%，所以建議該地區(qū)防治沙門(mén)菌病時(shí)慎用這些藥物。本試驗(yàn)結(jié)果與吳白[18]、周榮云[19]、廖成水[20]等研究結(jié)果不太相符，他們分離的禽源沙門(mén)菌對(duì)鏈霉素耐藥率較高，甚至達(dá)100%，但對(duì)慶大霉素和卡那霉素較為敏感。國(guó)外也有類(lèi)似報(bào)道，伊朗分離的沙門(mén)菌對(duì)四環(huán)素的耐藥率為81%，鏈霉素為56.7%，卡那霉素為36.9%，但對(duì)環(huán)丙沙星和慶大霉素等較敏感[21]；南斯拉夫科索沃地區(qū)的30個(gè)沙門(mén)菌分離株對(duì)慶大霉素和土霉素均較敏感，其中29個(gè)分離株對(duì)環(huán)丙沙星敏感，27個(gè)分離株對(duì)鏈霉素耐藥[15]。這些結(jié)果與本文慶大霉素和環(huán)丙沙星的高耐藥率和鏈霉素的低耐藥率不一致，這些差異大多是與當(dāng)?shù)氐呐R床用藥情況有關(guān)。另外，沙門(mén)菌的多重耐藥也較為嚴(yán)重，比如危地馬拉活禽市場(chǎng)中分離的103個(gè)沙門(mén)菌分離株有59.2%對(duì)1～3種抗生素耐藥，13.6%對(duì)4種以上抗生素耐藥[14]；在土耳其檢出的沙門(mén)菌分離株有92.85%對(duì)4種以上抗生素耐藥[22]。黎宗強(qiáng)報(bào)道了29個(gè)沙門(mén)菌分離株有51.73%的菌株為6重或7重耐藥，3.45%的菌株甚至為14重耐藥[23]。綜合看來(lái)，各地沙門(mén)菌分離株對(duì)多種藥物都產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，所以臨床上應(yīng)通過(guò)藥敏試驗(yàn)篩選敏感藥物，合理正確的使用抗生素，從而減少治療成本和耐藥性的產(chǎn)生。

本研究從安徽滁州地區(qū)活禽市場(chǎng)采集的110份雞肛拭子樣品中檢出雞源沙門(mén)菌23個(gè)，檢出率為20.9%，并且這些分離株對(duì)克林霉素、慶大霉素、大觀霉素、哌拉西林的耐藥率較高。由于該地區(qū)活禽市場(chǎng)雞沙門(mén)菌的高檢出率及高耐藥率，預(yù)示著暴發(fā)沙門(mén)菌病的風(fēng)險(xiǎn)較大，這就要求相關(guān)部門(mén)務(wù)必做好家禽沙門(mén)菌感染的定期監(jiān)測(cè)和防治工作，指導(dǎo)臨床合理用藥進(jìn)行有效防治，同時(shí)，沙門(mén)菌病的防治也有一定的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

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Isolation,Identification and Drug Susceptibility Test ofSalmonellafrom Chickens in Live Poultry Market of Chuzhou

GUO Wei-na1,LU Zhen-xiang1,LIU Li-xiao2,GONG Zheng1
(1.AnimalScienceCollege,UniversityofScience&TechnologyofAnhui,Fengyang,Anhui,233100China; 2.AnimalHusbandryBureauofZhumadian,Zhumadian,Henan,463000,China)

110 Cloacal swabs were collected from chickens in live poultry markets of Chuzhou in Anhui, then isolated and purified with MacConkey culture medium, and typical colonies were selected for identification through triple sugar iron test, indole test, methyl red test, VP test and PCR identification of 16S rRNA, finally drug susceptibility tests were conducted forSalmonellaisolates. There were 29 suspectedSalmonellaisolates obtained from 110 cloacal swabs of chickens, and 23Salmonellaisolates were identified through biochemical test and molecular identification of 16S rRNA. The susceptibility tests ofSalmonellashowed that the resistance for streptomycin and amikacin were relatively lower, while the resistance to gentamicin, spectinomycin, piperacillin were as high as 82.61%, and the resistance to clindamycin was even reached 100%.

Salmonella; chicken; isolation and identification; susceptibility test

2016-09-15

安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2016A822)；安徽科技學(xué)院自然科學(xué)研究項(xiàng)目(ZRC2016497)；安徽省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(1301zc03088)

郭偉娜(1982-)，女，河南內(nèi)黃人，講師，博士，主要從事病原微生物致病性及防治研究。

S852.612

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1007-5038(2017)06-0107-05