徐麗美，付明哲，何亞鵬，許信剛，于三科，張 琪

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

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陜西省部分地區(qū)PRRSV流行毒株ORF3和ORF5基因的遺傳變異分析

徐麗美，付明哲，何亞鵬，許信剛，于三科*，張 琪*

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

為了解陜西省豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)流行毒株的遺傳和變異情況,對(duì)9份疑似感染PRRSV的病料用RT-PCR方法分別擴(kuò)增ORF3和ORF5基因，并進(jìn)行測(cè)序和序列分析。測(cè)序結(jié)果表明,ORF3基因在254-490和646-737位置之間發(fā)生不連續(xù)堿基突變；與GenBank已發(fā)表的國(guó)外毒株ORF3基因組比較，同源性為89.2%～94.8%，與國(guó)內(nèi)發(fā)表的ORF3基因比較，同源性為88.8%～99.0%，其中與2009年陜西分離株(HQ843181.1)同源性為94.9%～98.7%，與2010年陜西株(KJ855518.1)同源性為94.9%～98.6%。ORF5基因突變主要在508-600堿基位置之間，與GenBank上已發(fā)表的國(guó)外毒株ORF5基因組比較，同源性為90.1%～92.1%，與國(guó)內(nèi)發(fā)表的ORF5基因比較，同源性為89.6%～99.2%，其中與2009年陜西分離株(HQ843181.1)同源性為95.2%～98.4%，與2010年陜西株(KJ855518.1)同源性為95.2%～98.7%。ORF3和ORF5基因進(jìn)化樹(shù)中Wn-2、Ak-3和Tc-4毒株在同一個(gè)進(jìn)化支上，之間親緣關(guān)系近，Xy-1和Hz-5毒株分別在不同的進(jìn)化分支上，與其他毒株遺傳距離較遠(yuǎn)。陜西省PRRSV流行毒株的ORF5和ORF3基因組與國(guó)內(nèi)PRRSV分離株相比較均有一定變異，且親緣進(jìn)化不完全相同。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；ORF3基因；ORF5基因；序列分析

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的感染母豬主要表現(xiàn)為繁殖障礙、仔豬呼吸系統(tǒng)衰竭以及高病死率為特征的一種高度傳染性疾病[1]。自1987年美國(guó)報(bào)道了首例PRRS之后[2]，其他國(guó)家也相繼報(bào)道，2006年我國(guó)南方大面積暴發(fā)了由PRRS變異株引起的“豬高熱病”疫情，當(dāng)時(shí)對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成的影響極大。PRRSV至今與多種病原混合感染，難以判斷和檢測(cè)，隨著它給全球養(yǎng)豬業(yè)造成的巨大經(jīng)濟(jì)損失，迅速上升為全球關(guān)注的焦點(diǎn)。PRRSV是不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，有囊膜，基因組全長(zhǎng)約15 kb，有9個(gè)開(kāi)放閱讀框，發(fā)揮著不同作用[3]。其中ORF3和ORF5分別編碼該病毒的囊膜相關(guān)糖蛋白GP3和GP5，GP5是PRRSV的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，有較高的免疫原性與中和活性，參與體液、細(xì)胞免疫[4]。研究表明，PRRSV分離株間的核苷酸序列存有明顯差異，以Nsp2、ORF3和ORF5基因片段變異較大為主[5-7]。很多學(xué)著針對(duì)ORF5基因進(jìn)行研究，并探索PRRSV的新型疫苗和分子診斷試劑。由于PRRS是一種急性、熱性、高致死性的豬傳染病，目前雖已有弱毒疫苗和滅活苗上市可用于PRRS的預(yù)防，但免疫效果不佳，因而有必要了解各個(gè)省份PRRSV流行株的遺傳變異情況。本文就陜西省部分地區(qū)檢測(cè)到的PRRSV的5個(gè)流行毒株進(jìn)行測(cè)序并進(jìn)行遺傳變異分析，旨在了解陜西省PRRSV流行毒株之間以及與GenBank已有PRRSV毒株間的遺傳變異關(guān)系，為陜西省PRRS流行病學(xué)調(diào)查以及防控提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 采集陜西省楊陵、渭南、安康、銅川、漢中、戶(hù)縣等地區(qū)規(guī)模化豬場(chǎng)表現(xiàn)為體溫高熱、耳朵藍(lán)紫、呼吸困難病豬的肺臟、脾臟病料。

1.1.2 主要試劑 Trizol總RNA提取試劑盒(Trizol Reagent)購(gòu)于天根生化科技有限公司；病毒RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(HiScript?1st Strand cDNA Synthesis)購(gòu)于諾唯贊生物技術(shù)有限公司；2×TaqMasterMix和DNA Marker DL 2 000購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank已公布的PRRSV序列(KU950375.1、KP771739.1)，針對(duì)ORF3和ORF5基因用Primer 5.0各設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物。ORF3上游引物F1 5′-GACAGGGTCAAATGTAACCATAGTGTA-3′，下游引物R1 5′-GTGACATTGGCAGTGATGGTGAT-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為904 bp，包括ORF3全長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框基因765 bp。ORF5上游引物F2 5′-TGTGCGACTGCTTCATTT-3′，下游引物R2 5′-CATCACTGGCGTGTAGGT-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度分別為775 bp，包括ORF5全長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框基因603 bp。引物由Invitrogen上海貿(mào)易有限公司合成，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病毒RNA提取 取病豬肺臟和脾臟，于研磨器中研磨成勻漿，在-20℃/37℃反復(fù)凍融3次，8 000 r/min離5 min，取200 μL上清液，按照Trizol Reagent提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病毒RNA，部分立即用于反轉(zhuǎn)錄，剩余的置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RT-PCR擴(kuò)增 提取的病毒RNA按照(HiScript?1st Strand cDNA Synthesis)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模版，總體積50 μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 40 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸8 min。

1.2.4 序列測(cè)定 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂凝膠電泳，檢測(cè)呈陽(yáng)性樣品5份，分別命名為Xy-1、Wn-2、Ak-3、Tc-4、Hz-5，將PCR產(chǎn)物送于上海英俊生物科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.5 序列比對(duì)分析 利用DNAStar-MegAlign軟件和Blast比對(duì)5個(gè)毒株的ORF3和ORF5基因組序列并與GenBank已收錄的國(guó)內(nèi)外PRRSV毒株進(jìn)行比對(duì)分析，構(gòu)建核苷酸序列同源性分析表和遺傳進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 ORF3和ORF5基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

分別以PRRSV的RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，經(jīng)ORF3和ORF5引物PCR擴(kuò)增得到5個(gè)與預(yù)期大小一致的目的片段，ORF3基因?qū)?yīng)的條帶為904 bp(圖1)、ORF5基因?qū)?yīng)的條帶為775 bp(圖2)。

2.2 ORF3基因序列同源性分析

應(yīng)用DNAStar-Meg Align分析軟件對(duì)5個(gè)PRRSV毒株的ORF3基因的核苷酸同源性進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)(圖3)。全長(zhǎng)ORF3基因開(kāi)放閱讀框由765個(gè)核苷酸組成，有255個(gè)氨基酸。發(fā)現(xiàn)5個(gè)分離毒株與GenBank上已發(fā)表的國(guó)外分離株(AB811787.1、AF176348.2、AF325691.1)比較，同源性為89.2%～94.8.0%；與中國(guó)其他地區(qū)分離株(EU860249.1、HM016159.1、HQ233605.1、KP998431.1、KP998475.1)同源性為88.8%～99.0%，其中與陜西分離株(HQ843181.1、KJ855518.1)同源性為94.9%～98.7%。可以看出ORF3基因具有地緣性差異，一般距離越近同源性越高。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000；1～5.ORF3擴(kuò)增產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000；1-5.PCR products of ORF3

圖1 ORF3基因PCR擴(kuò)增

Fig.1 Amplification of ORF3 gene by PCR

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～5.ORF5擴(kuò)增產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000；1-5.PCR products of ORF5

圖2 ORF5基因PCR擴(kuò)增

Fig.2 Amplification of ORF5 gene by PCR

2.3 ORF3基因遺傳進(jìn)化樹(shù)分析

應(yīng)用DNAStar-MegAlign生物分析軟件完成ORF3基因遺傳進(jìn)化樹(shù)(圖4)，由進(jìn)化樹(shù)可以看出，5株中的Wn-2、Ak-3、Tc-4在一個(gè)進(jìn)化小分支上，與陜西株(HQ843181.1)遺傳距離較近，Hz-5與陜西株(KJ855518.1)遺傳距離較近，Xy-1與北京株(HQ233605.1)遺傳關(guān)系最近，5個(gè)毒株與臺(tái)灣分離株(KP998431.1)的進(jìn)化分支最遠(yuǎn)。

2.4 ORF5基因序列同源性分析

利用DNA Star-Meg Align分析軟件對(duì)5個(gè)PRRSV毒株的ORF5的基因核苷酸進(jìn)行同源性分析(圖5)。ORF5基因由603個(gè)核苷酸組成，有201個(gè)氨基酸。發(fā)現(xiàn)5個(gè)毒株的ORF5基因與GenBank上已發(fā)表的國(guó)外分離株比較，同源性為90.1%～92.1%；與中國(guó)分離株(EU860249.1、HM016159.1、KP771760.1、KP998431.1、KP998475.1)同源性為89.6%～99.2%，其中與陜西分離株(HQ843181.1、KJ855518.1)同源性為95.2.8%～98.7%；可以看出ORF5基因也具有地緣性差異，可以看出ORF5基因也具有地緣性差異，一般距離越近同源性越高。

圖3 ORF3基因核苷酸同源性分析

2.5 ORF5基因遺傳進(jìn)化樹(shù)分析

應(yīng)用DNAStar-MegAlign生物軟件完成ORF5基因遺傳進(jìn)化樹(shù)(圖6)，從ORF5基因遺傳進(jìn)化樹(shù)可看出，5株里面的Wn-2、Ak-3、Tc-4分離株在一個(gè)進(jìn)化分支上，親緣遺傳關(guān)系較近，Hz-5與陜西株(KJ855518.1)遺傳進(jìn)化關(guān)系近，Xy-1從進(jìn)化樹(shù)來(lái)看與本地株親緣進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，5個(gè)毒株與中國(guó)臺(tái)灣分離株(KP998431.1)在進(jìn)化分支上最遠(yuǎn)。

圖4 ORF3基因核苷酸序列進(jìn)化樹(shù)

圖5 ORF5基因核苷酸同源性分析

圖6 ORF5核苷酸序列進(jìn)化樹(shù)

3 討論

從1987年美國(guó)首次報(bào)道，隨之歐洲多個(gè)國(guó)家地區(qū)PRRS的暴發(fā)，1996年郭寶清等[8]在我國(guó)首次分離出PRRSV，再到2006年我國(guó)南方地區(qū)發(fā)生的由豬藍(lán)耳病變異病毒引起的大規(guī)模的高熱病，PRRSV是全球性趨勢(shì)。目前針對(duì)PRRSV的弱毒疫苗和滅活苗已經(jīng)在豬養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)用，但由于疫苗自身問(wèn)題免疫效果不佳，若發(fā)病目前尚無(wú)特效藥物可以進(jìn)行治療且呈大規(guī)模的暴發(fā)，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。加大對(duì)PRRSV的研究迫在眉睫，有必要進(jìn)行不同地區(qū)PRRSV毒株的序列分析、比對(duì)，以了解該病毒的遺傳、進(jìn)化及流行情況。

本研究擴(kuò)增到陜西省部分地區(qū)5個(gè)毒株的ORF3與ORF5基因。核苷酸同源性分析，5個(gè)毒株的ORF3基因之間的同源性為94.9%～98.0%，與GenBank上已發(fā)表的國(guó)外毒株ORF3基因組比較，同源性為89.2%～94.8.0%，與國(guó)內(nèi)發(fā)表的ORF3基因比較，同源性為88.8%～99.0%，與GenBank上已收錄的國(guó)內(nèi)外毒株進(jìn)行核苷酸比對(duì)，發(fā)現(xiàn)ORF3基因組在254-490和646-737位置之間發(fā)生不連續(xù)堿基突變。ORF5基因之間的同源性為95.2%～98.4%，與GenBank上已發(fā)表的國(guó)外毒株ORF5基因組比較，同源性為90.1%～92.1%，與國(guó)內(nèi)發(fā)表的ORF5基因比較，同源性為89.6%～99.2%，與GenBank上已收錄的國(guó)內(nèi)外毒株進(jìn)行核苷酸比對(duì)，發(fā)現(xiàn)突變主要在508-600堿基位置之間。據(jù)相關(guān)資料已知ORF5是PRRSV基因組中的高突變區(qū)之一，這也與本研究得到的結(jié)果一致，其編碼蛋白GP5又是PRRSV主要的宿主保護(hù)性抗原，ORF5基因序列，特別是GP5氨基酸序列的變異將直接降低PRRSV疫苗株的交叉保護(hù)率[9]，所以加深ORF5基因的研究勢(shì)在必行，對(duì)本病防控和病毒研究及更有效疫苗研究都很重要。ORF3和ORF5基因進(jìn)化樹(shù)中，均呈現(xiàn)出一個(gè)規(guī)律，Wn-2、Ak-3、Tc-4在一個(gè)進(jìn)化小分支上，親緣關(guān)系較近，Hz-5和Xy-1毒株有別與其他毒株，與本地分離株遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，可能這兩個(gè)地方的流行株與帶毒豬的跨地域流動(dòng)有關(guān)。

目前雖投入大量資源進(jìn)行研究，也已有弱毒疫苗和滅活苗應(yīng)用于實(shí)踐，但效果并不是很理想，反而PRRSV一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，本研究發(fā)現(xiàn)陜西省部分地區(qū)PRRSV存在一定的變異，這種變異是否影響疫苗的免疫效果還需要進(jìn)一步研究。本文針對(duì)陜西省部分地區(qū)疑似為PRRSV的病豬采取病料，對(duì)ORF3和ORF5基因組進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)陜西省部分地區(qū)PRRSV存在一定變異，以補(bǔ)充陜西省地區(qū)PRRSV流行株的流行情況，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

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Genetic Variation Analysis of ORF3 and ORF5 genes of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus in Partial Regions of Shaanxi Province

XU Li-mei,FU Ming-zhe,HE Ya-peng,XU Xin-gang,YU San-ke,ZHANG Qi
(CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100，China)

In order to understand the genetics and variation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in Shaanxi province,9 suspected samples of PRRSV infection were collected from pig farms in partial regions,and ORF3 and ORF5 genes were amplified using RT-PCR.Sequencing results showed that the ORF3 gene had discontinuous base mutations between 254-490 and 646-490 positions.Compared with published abroad ORF3 genome in GenBank,the similarity is 89.2%-94.8%,and compared with domestic published ORF3 gene,the similarity is 88.8%-99.0%,compared with 2009 Shaanxi isolate (HQ843181.1),the similarity is 94.9%-98.7%,and with 2010 Shaanxi strain (KJ855518.1), the similarity is 94.9%-98.6%.Sequencing results showed that the ORF5 gene has discontinuous base mutations between 508-600 positions.Compared with published abroad ORF5 genome in GenBank,the similarity is 90.1%-92.1%,and compared with domestic published ORF5 gene,the similarity is 89.6%-99.2%,with 2009 Shaanxi isolate (HQ843181.1), the similarity is 95.2%-98.4%,and with 2010 Shaanxi strain (KJ855518.1),the similarity is 95.2%-98.7%.In ORF3 and ORF5 gene phylogenetic trees,Wn-2,Ak-3 and Tc-4 three strains are in the same evolutionary branch and the genetic distance is farther with Xy-1 and Hz-5 strains.ORF5 and ORF3 genomes all have certain variation of pandemic strains in Shaanxi compared with domestic PRRSV isolates,and biological evolution is not exactly the same.

Porcine reproductive and respiratory syndrome; ORF3 gene; ORF5 gene; sequence analysis

2016-09-21

陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)項(xiàng)目(2016NY-095)；西北農(nóng)林科技大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(Z109021427)

徐麗美(1994-)，女，甘肅會(huì)寧人，碩士，主要從事分子病原學(xué)與免疫學(xué)研究。*通訊作者

S855.1

A

1007-5038(2017)06-0013-05