吳彩艷，程淑琴，張建峰，李娟，林栩慧，董嘉文，呂敏娜，廖申權(quán)，戚南山，孫銘飛*，劉雅紅

( 1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所， 廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實驗室， 廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，廣東廣州 510640； 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642；3. 河北旅游職業(yè)學(xué)院，河北承德 067000)

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專論與講座

我國鴨疫里氏桿菌病流行概述

吳彩艷1,2△，程淑琴3△，張建峰1，李娟1，林栩慧1，董嘉文1，呂敏娜1，廖申權(quán)1，戚南山1，孫銘飛1*，劉雅紅2*

( 1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所， 廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實驗室， 廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，廣東廣州 510640； 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642；3. 河北旅游職業(yè)學(xué)院，河北承德 067000)

鴨疫里氏桿菌因其血清型多且復(fù)雜，抗藥性嚴重，其已成為危害我國養(yǎng)鴨業(yè)的一種主要疾病。為進一步提高對鴨疫里氏桿菌病的防控水平，論文就該病的流行病學(xué)、診斷方法及疫苗研制等方面的研究進展進行綜述，以期為指導(dǎo)臨床安全合理用藥及制定綜合防控措施提供參考。

鴨疫里氏桿菌病；流行病學(xué)；診斷方法；疫苗研制

鴨疫里氏桿菌病又稱鴨傳染性漿膜炎、新鴨病、鴨疫綜合征，是由鴨疫里氏桿菌(Riemerellaanatipestifer，RA)引起的一種接觸性傳染病，目前已成為嚴重危害養(yǎng)鴨生產(chǎn)的主要疾病[1]。該病以纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為主要病變特征，病死率高達90%，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。目前國際上公認RA有21個血清型，主要有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10型等，國內(nèi)流行較多的是1型和2型，其他血清型伴隨發(fā)生，但各型之間幾乎無交叉保護性[2]，因此給免疫預(yù)防造成極大困難。該病流行之廣泛，危害之嚴重，血清型變化之迅速為當前畜禽疾病所罕見。目前主要采用藥物治療鴨疫里氏桿菌病，但是由于藥物的長期使用，臨床上已經(jīng)出現(xiàn)非常嚴重的抗藥性問題以及藥物殘留問題。本文就鴨疫里氏桿菌病在我國的流行情況、診斷方法及疫苗研制等方面的研究進展進行闡述，以期為安全、有效、科學(xué)的防控該病提供參考。

1 我國鴨疫里氏桿菌病流行情況

自北京地區(qū)首次發(fā)生鴨疫里氏桿菌病以來，除西藏等少數(shù)省區(qū)外，該病幾乎在全國各地均有發(fā)生。山東、江蘇、安徽、浙江、湖北、四川、貴州、廣西、廣東省等地區(qū)均有鴨疫里氏桿菌病的報道，且各地發(fā)生的血清型也不盡相同(表1)。隨著養(yǎng)鴨量的逐年攀升，鴨疫里氏桿菌病的發(fā)生率也逐漸增加，并且呈愈演愈烈的趨勢。對于該病的防控，主要采用滅活疫苗免疫與藥物預(yù)防相結(jié)合的方式。但是由于當前的滅活疫苗尚不能涵蓋所有流行的血清型，因此，滅活疫苗的免疫效果并不理想，應(yīng)用受到限制，藥物仍是防控的主要手段，雖然在一定程度上降低了該病的發(fā)生，但是由于抗生素的不合理使用，致使RA產(chǎn)生嚴重的抗藥性。從總體情況來看，我國流行的RA以1型和2型為主，但多血清型流行已成為基本態(tài)勢。由于各單位擁有的RA標準陽性血清型不足，導(dǎo)致部分RA分離株的血清型未能進行鑒定，因此，尚有部分地區(qū)RA流行的血清型不明確。

2 鴨疫里氏桿菌病診斷方法研究進展

2.1 RA病原檢測方法

對于鴨疫里氏桿菌病的診斷方法，除傳統(tǒng)實驗室診斷方法外，近年發(fā)展了以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的PCR快速檢測方法，其建立的依據(jù)是擴增RA基因組中保守區(qū)域的目標基因，即16S rRNA 基因或外膜蛋白 A (OmpA )基因。根據(jù)RA 16S rRNA基因的保守序列設(shè)計特異性引物，分別以RA全菌體、基因組DNA、菌液等為模板建立PCR快速檢測方法[19-21]。臨床上，大腸桿菌病和鴨疫里氏桿菌病病變類似，肉眼不易鑒別診斷，覃宗華等[22]針對 RA和E.coli的16S rRNA 基因序列設(shè)計了種特異性引物，以鴨肝臟組織懸液煮沸后的上清、細菌培養(yǎng)物或基因組 DNA為模板，分別擴增出長度為342 bp和718 bp的DNA片段，建立了一種能夠快速鑒別診斷兩種疾病的雙重PCR 檢測方法。為進一步提高PCR檢測方法的靈敏性，劉拂曉等[23]利用基于RA 16S rRNA的熒光定量PCR 檢測方法，分別對自然和人工感染病例不同臟器的RA進行定量檢測，結(jié)果以腦組織和心臟中的RA含量最高。謝永福等[24]根據(jù)RA 16S rRNA基因建立了套式PCR檢測方法，其最小檢測量是常規(guī)PCR的1 000倍，大大提高了檢測方法的靈敏性。

OmpA是一種重要的免疫原性蛋白，為各血清型RA所共有，由于其基因序列具有高度保守性，因此可以作為鑒別診斷RA的靶基因。利用針對OmpA基因建立的PCR快速檢測方法，對RA純培養(yǎng)菌及病死鴨病料組織進行檢測，均可擴增出 592 bp 的目的條帶，并且該方法特異性較好[25]。也可以將OmpA基因也可以作為目標基因用于大腸桿菌病和鴨疫里氏桿菌病的鑒別診斷[26]。以O(shè)mpA基因為靶基因建立的real-time PCR快速檢測方法，最低能檢測的DNA模板濃度為8.0 拷貝/μL，菌液濃度為8.0× 103CFU/mL，極大地提高了檢測方法的靈敏性，該方法適用于RA的快速診斷、流行病學(xué)調(diào)查、種鴨引進隔離檢疫以及活鴨及其產(chǎn)品的進出口檢驗檢疫等[27]。季權(quán)安等[28]建立的基于OmpA基因的菌落PCR方法，最低檢出量為80個RA，該方法更加快速簡捷，在臨床應(yīng)用上具有較好的實用價值。隨著科學(xué)研究的深入，將會有更多的靶基因被發(fā)現(xiàn)，相應(yīng)的檢測方法也會更迅速、更簡便、更準確。

表1 中國各地區(qū)RA流行情況調(diào)查

2.2 RA抗體檢測方法

酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)是目前發(fā)展最快、應(yīng)用最廣的免疫學(xué)檢測技術(shù)之一。具有快速、敏感、簡便等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于感染性疾病的檢測。目前國內(nèi)外報道的檢測鴨疫里氏桿菌抗體的各種ELISA方法，主要用于RA的感染以及免疫后抗體水平的監(jiān)測，在試驗研究和臨床應(yīng)用中都具有良好的應(yīng)用價值。劉學(xué)賢等[29]以RA1細菌懸液為包被抗原建立的間接ELISA方法，可以用于RA的早期診斷及疫苗免疫效力的評價，利用該方法對江蘇省部分地區(qū)送檢的235份鴨血清進行檢測，陽性率為48.1%。吳彩艷等[30]建立了以甲醛滅活的RA1全菌體為包被抗原的間接ELISA方法，該方法與全菌體裂解抗原[31]及重組p25蛋白[32]為包被抗原的間接ELISA方法相比較，三者均可以檢測不同血清型RA陽性血清，結(jié)果符合性良好。三種方法中以滅活的全菌體抗原制備最為簡單，經(jīng)濟快速，不受條件限制且易于保存，因此該方法適于在臨床檢測中推廣應(yīng)用。此外，么乃全等[33]以重組的Camp蛋白及季慕寅等[34]以重組的OmpA 蛋白為包被抗原，分別建立了可以檢測RA多種血清型抗體的間接ELISA方法，二者均可用于雛鴨免疫后抗體水平的監(jiān)測。

3 鴨疫里氏桿菌病疫苗的研制

由于RA廣泛而嚴重的抗藥性，以及公眾對食品中抗生素殘留問題的重視和公共衛(wèi)生安全的要求，藥物的使用將會受到越來越嚴格的限制，而疫苗免疫是解決傳染病的最佳選擇。然而RA各血清型間缺乏交叉保護，加之各地流行的RA血清型又不盡相同，因此制備通用疫苗是最理想的解決途徑。但在實際生產(chǎn)中由于疫苗生產(chǎn)工藝的限制，針對鴨疫里氏桿菌病的通用疫苗目前尚未問世?，F(xiàn)階段我國預(yù)防鴨疫里氏桿菌病仍以免疫滅活疫苗為主，弱毒活疫苗及含菌體成分疫苗尚處于研究階段。

3.1 滅活疫苗的研制

由于制作工藝的限制，目前的鴨疫里氏桿菌病滅活疫苗尚未涵蓋當前流行的所有血清型，因此實際生產(chǎn)中以當?shù)亓餍械难逍脱兄茰缁钜呙鐚刂票镜匕l(fā)生的鴨疫里氏桿菌病具有普遍意義?，F(xiàn)階段滅活疫苗的種類主要有單價苗、二價苗、三價苗、四價苗和二聯(lián)苗等。王小蘭等[35]和楊靈芝等[36]分別研制的2型和10型單價油乳劑滅活疫苗，可有效抵抗同型強毒RA的攻擊。傅元華等[37]和孟超等[38]分別采用1型和2型RA制備了二價油乳劑滅活疫苗，可有效保護鴨和鵝不被同型RA的感染。謝永平等[39]和田令等[40]研制的RA1、2、3型三價油乳劑滅活疫苗，免疫保護期達50 d，可滿足肉鴨養(yǎng)殖生產(chǎn)的需要。程安春等[41]將1、2、4、5型RA滅活后制成的四價鋁膠復(fù)合佐劑疫苗，免疫雛鴨后可有效抵抗1、2、4、5型RA強毒的感染。Sandhu等[42]研制的RA與E.coli二聯(lián)滅活疫苗均可有效保護雛鴨不感染大腸桿菌病和鴨疫里氏桿菌病。

在疫苗生產(chǎn)中，通常添加各種佐劑作為非特異性免疫增強劑來增強疫苗的免疫保護效果，常用的佐劑主要有鋁膠、油乳劑、蜂膠、黃芪多糖等，佐劑不同，疫苗的保護效果也不盡相同。陳潔等[43]從安全性和保護效果兩方面對RA1油乳劑、蜂膠及黃芪多糖滅活疫苗的保護效果進行比較，發(fā)現(xiàn)3種佐劑疫苗的保護率分別為92%、84%、96%，結(jié)果說明黃芪多糖滅活疫苗的保護效果最佳。吉鳳濤等[44]對RA1、2、7型三價蜂膠滅活苗和油乳劑滅活苗的免疫保護效果進行評價，發(fā)現(xiàn)雛鴨免疫蜂膠滅活苗第3天即可產(chǎn)生部分抵抗力，疫苗的完全保護作用可持續(xù)至第120天；而接種油乳劑滅活苗的雛鴨于免疫后第10天才開始表現(xiàn)出部分抵抗力，但疫苗的完全保護作用也可持續(xù)至免疫后第120天。比較2種佐劑疫苗的效果可以看出，蜂膠滅活苗具有產(chǎn)生誘導(dǎo)免疫保護作用速度快，免疫持續(xù)時間長等優(yōu)點，而油乳劑滅活苗雖然免疫持續(xù)期較長，但誘導(dǎo)產(chǎn)生保護力的速度較慢。

3.2 活疫苗的研制

國外有報道使用RA弱毒活疫苗，Sandhu等[45]將RA1、2、5型自然弱毒株制成三價活疫苗，免疫雛鴨后無明顯的副作用，對同型強毒的攻擊保護期長達42 d。國內(nèi)目前尚未見該方面的報道。

3.3 菌體成分疫苗的研究

菌體成分疫苗包括亞單位疫苗和基因工程疫苗。RA此類疫苗目前尚處于研發(fā)階段，亞單位疫苗重點集中在外膜蛋白和莢膜相關(guān)成分上。Omp 是革蘭氏陰性菌外膜的主要結(jié)構(gòu)成分，具有免疫原性，不僅能激發(fā)機體的體液免疫，還可以激發(fā)引起細胞免疫，被用于試制疫苗的研究，展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。李清竹[46]以重組的RA1 Omp蛋白與弗氏完全佐劑乳化后免疫雛鴨，可保護雛鴨免受同型強毒的攻擊，結(jié)果表明該蛋白具有良好的免疫原性，能同時刺激機體產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫。

RA的其他免疫原性蛋白也在不斷被發(fā)現(xiàn)，么乃全等[33]研究證明 Camp 蛋白具有良好的免疫原性，并且為多種血清型RA的共同抗原，在 RA 亞單位疫苗開發(fā)中具有良好的應(yīng)用價值。除外膜蛋白外，莢膜作為菌體成分之一，也是一種非常重要的保護性抗原。齊冬梅等[47]用制成的RA1莢膜油乳佐劑疫苗免疫雛鴨后，對同源菌株的攻擊保護率可達90%，通過與其他RA1不同佐劑滅活疫苗免疫效力的比較發(fā)現(xiàn)，莢膜油乳劑苗的保護效果最佳，其次為油乳劑滅活苗、蜂膠滅活苗、鋁膠滅活苗、無佐劑滅活苗。上述研究工作的開展為亞單位疫苗的研究提供了候選抗原，也為該類疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

4 展望

從我國的地里位置看，由北向南，自西向東鴨疫里氏桿菌病的發(fā)病趨勢明顯加重。該病在南方地區(qū)較北方地區(qū)多發(fā)，原因可能是南方地區(qū)氣候溫暖濕潤造成了該病易發(fā)、頻發(fā)。從流行情況看，我國RA流行的血清型復(fù)雜多變，提示當前鴨疫里氏桿菌病的防控形勢異常嚴峻。從檢測方法來看，隨著科技的發(fā)展，RA的檢測技術(shù)將會更加快速、簡便、易行。從疫苗研發(fā)角度來看，因滅活疫苗的局限性，使其應(yīng)用受限，而亞單位疫苗和基因工程疫苗因其自身優(yōu)點，必將是未來科研工作的熱點和重點，預(yù)計未來我國防控鴨疫里氏桿菌病的水平將得到進一步提高。參考文獻:

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Introduction to Epidemiology of Riemerellosis Anatipestifer Disease in China

WU Cai-yan1,2, CHENG Shu-qin3, ZHANG Jian-feng1，LI Juan1, LIN Xu-hui1, DONG Jia-wen1, LV Min-na1, LIAO Shen-quan1, QI Nan-shan1, SUN Ming-fei1, LIU Ya-hong1
(1.InstituteofAnimalHealth,GuangdongAcademyofAgriculturalSciences,GuangdongProvincialKeyLaboratoryofLivestockDiseasePrevention,GuangdongOpenlaboratoryofVeterinaryPublicHealth,Guangzhou,Guangdong,510640,China;2.CollegeofVeterinaryMedicine,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou,Guangdong,510642,China；3.HebeiTourismVocationalCollege,Chengde,Hebei,067000,China)

In recent years, the duck septicaemia caused byRiemerellaanatipestiferin young ducks has been a main disease which harming to the duck breeding industry because of diversity serotype and serious resistance. In this paper, we reviewed the latest epidemiology, diagnosis technique and vaccine development forRiemerellaanatipestiferinfection combining with our research results in order to guide using of drugs rationally and provide some suggests to control this disease.

Riemerellaanatipestiferinfection; epidemiological investigation; diagnosis; vaccine development

2016-11-07

廣東省科技計劃項目(2015A020210086，2013B031500005，2014A020208052，2015B020230004)；國家星火計劃項目(2015GA780050)；廣州市科技計劃項目(201510010250)

吳彩艷(1978-)，女(蒙古族)，內(nèi)蒙古赤峰人，副研究員，主要從事禽傳染病研究。 △同等貢獻作者，*通訊作者

S852.617

A

1007-5038(2017)06-0086-05