姚懷兵，趙 毅，李金娜，劉 宏，任 方，黃 炯

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.天康生物股份有限公司,新疆烏魯木齊 830000；3.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊 830000)

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文獻(xiàn)綜述

口蹄疫病毒P1結(jié)構(gòu)蛋白和3A非結(jié)構(gòu)蛋白研究進(jìn)展

姚懷兵1，趙 毅2，李金娜1，劉 宏2，任 方2，黃 炯3*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.天康生物股份有限公司,新疆烏魯木齊 830000；3.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊 830000)

口蹄疫病毒(FMDV) P1 基因所編碼的結(jié)構(gòu)蛋白是FMDV衣殼的主要蛋白，是其主要抗原位點(diǎn)所在的區(qū)域，決定著FMDV的抗原性，3A非結(jié)構(gòu)蛋白能與宿主細(xì)胞結(jié)合，其特征性變化與病毒的表型變化密切相關(guān)，影響著宿主嗜性和致病力，P1和3A基因都是FMDV研究的熱點(diǎn)。論文綜述了FMDV P1和3A基因及其所編碼蛋白的結(jié)構(gòu)、抗原特性及其生物學(xué)功能的研究現(xiàn)狀，為后續(xù)FMDV研究提供參考。

口蹄疫病毒；P1結(jié)構(gòu)蛋白；3A非結(jié)構(gòu)蛋白；抗原特性

口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)屬小RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)，是無囊膜病毒，其基因組為一條單股線狀的正鏈RNA，約由8 500 bp組成，是FMDV感染宿主和遺傳的基礎(chǔ)[1-2]。FMDV的病毒粒子由外層的衣殼和里面的RNA兩部分所構(gòu)成，其基因組的中部有一個大的開放閱讀框(ORF)，它能編碼病毒的多聚蛋白，多聚蛋白經(jīng)一級裂解成為P1結(jié)構(gòu)蛋白和P2、P3非結(jié)構(gòu)蛋白；經(jīng)二級裂解為1A、1B、1C、1D、2A、2B、2C和3A、3B、3C、3D，再經(jīng)三級裂解為VP0或VP4、VP2、VP3、VP1(P1基因編碼區(qū))，3～4 種結(jié)構(gòu)蛋白Lab、Lb、2A、2B、2C(P2基因編碼區(qū))和3A、3B、3C、3D(P3基因編碼區(qū))8～9 種非結(jié)構(gòu)蛋白；三級裂解完成后， P1結(jié)構(gòu)蛋白最終裂解為VP1 、VP2 、VP3 和VP4 ，這4種結(jié)構(gòu)蛋白是構(gòu)成FMDV衣殼的主要結(jié)構(gòu)[3]。其中，結(jié)構(gòu)蛋白VP1 、VP2 、VP3是構(gòu)成病毒衣殼的主要蛋白，也是最主要的抗原蛋白[4-5]，其大多數(shù)的抗原表位(antigenic epitope)都位于FMDV衣殼蛋白上，決定著FMDV對宿主的抗原性及免疫原性。

3A基因位于FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白P3區(qū)，是一個比較保守的基因區(qū)域，參與病毒RNA整個復(fù)制過程。已有研究表明，3A基因可能決定著宿主特異性和FMDV的毒力，它在進(jìn)化過程中所發(fā)生的變異與宿主動物對病毒的選擇優(yōu)勢相關(guān)[6]。為此，本文對P1結(jié)構(gòu)蛋白和3A非結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及其在研制新型疫苗中的作用進(jìn)行綜述，旨在為FMDV基因組的研究提供參考。

1 FMDV P1和3A基因的結(jié)構(gòu)

1.1 FMDV P1結(jié)構(gòu)蛋白

FMDV P1基因區(qū)全長約2 200 bp，依次編碼85、218、220、213個氨基酸數(shù)量的結(jié)構(gòu)多肽，依次形成1A(VP4)、1B(VP2)、1C(VP3)和1D(VP1) 4 種結(jié)構(gòu)蛋白[7]。研究者已經(jīng)對不同毒株FMDV的核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行了同源性分析，表明VP1具有血清型的特異性，是所有基因中最容易發(fā)生變異的一段區(qū)域。目前，對FMDV的分型主要是由VP1基因的遺傳衍化關(guān)系所決定[8]。VP1基因編碼的1D蛋白與1A、1B、1C 其他3 種結(jié)構(gòu)蛋白各60拷貝數(shù)，呈對稱的20面體結(jié)構(gòu)，共同組成FMDV的衣殼，其中1D蛋白大部分暴露于FMDV衣殼粒子外面，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要抗原，也是決定FMDV抗原的主要成分。VP1 、VP2 、VP3 位于FMDV衣殼粒子的表面，大部分VP4則埋在衣殼的內(nèi)部，位于VP2和VP3之間，在其N端含有1個十四碳酸。VP1、VP2 和VP3 有著極其相似的結(jié)構(gòu)，均呈楔形，由8股β折疊片和2個α螺旋組成的圓筒狀所組成，每股β折疊片是由2個4條鏈組成的β片層結(jié)構(gòu)組成，可依次被劃分為A、B和C 3個功能區(qū)。β片層結(jié)構(gòu)相連的環(huán)和C端位于衣殼的表面，N端位于衣殼的內(nèi)側(cè)，這些環(huán)形結(jié)構(gòu)和C末端在一定程度上與FMDV的抗原結(jié)構(gòu)有很大的聯(lián)系。這4種結(jié)構(gòu)蛋白參與、決定著FMDV的免疫原性，是研究FMDV免疫原性及研發(fā)新型疫苗的基礎(chǔ)。

1.2 FMDV 3A非結(jié)構(gòu)蛋白

FMDV 非結(jié)構(gòu)蛋白3A位于高度保守的P3非結(jié)構(gòu)蛋白的編碼區(qū)，有459 個核苷酸，編碼153 個氨基酸，具有疏水基，能與宿主細(xì)胞相結(jié)合，在正鏈RNA合成起始時能把VPg錨定在細(xì)胞膜上，并能誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)的膜繼續(xù)增生。3A蛋白前半部分的保守序列形成了以α螺旋為主的二級結(jié)構(gòu)，后半部則為無規(guī)則卷曲。它的C段易突變，其它區(qū)變異呈零星散在。張顯升等[9]認(rèn)為3A蛋白的特征性變化可能與FMDV的表型變化具有一定的相關(guān)性。由此可以推論，F(xiàn)MDV的宿主嗜性和致病力與其3A蛋白的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。

圖1 口蹄疫病毒基因組編碼蛋白結(jié)構(gòu)圖

Fig.1 Structure of genome protein of foot-and-mouth disease virus

1.3 FMDV P1和3A基因的抗原位點(diǎn)

O型FMDV 主要有5 個抗原位點(diǎn)，其中有3 個抗原位點(diǎn)分布在VP1上，VP1上的第140-160和200-213 位氨基酸殘基是FMDV的主要抗原位點(diǎn)，為B細(xì)胞的表位，能引發(fā)機(jī)體的產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)；抗原位點(diǎn)1是FMDV最主要的抗原位點(diǎn)之一，由G-H環(huán)(122-157 aa)和C端(200-213 aa)氨基酸殘基線型表位組成，可以誘導(dǎo)動物產(chǎn)生中和抗體，缺失了會損失疫苗的免疫原性。在決定FMDV的免疫原性和抗原性方面具有重要作用；抗原位點(diǎn)2和4分別由VP2結(jié)構(gòu)蛋白BC環(huán)、EF環(huán)和VP3蛋白β-B“球形結(jié)節(jié)”中的一些氨基酸殘基所構(gòu)成，它們多以VP1-VP3交匯點(diǎn)為中心，散在地分布于20面體的三重軸附近[10]；抗原位點(diǎn)3位于病毒粒子表面五重軸的βB-C上；抗原位點(diǎn)5位于G-H環(huán)內(nèi)，與抗原位點(diǎn)1相互獨(dú)立[11]。從病毒的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上來說，抗原位點(diǎn)1、2和3都是獨(dú)立的，抗原位點(diǎn)2和4 是相關(guān)聯(lián)的，抗原位點(diǎn)2～5 均由不連續(xù)的抗原表位構(gòu)成，具有構(gòu)象依賴性，而抗原位點(diǎn)1中的抗原表位不具有這種構(gòu)象依賴性的特點(diǎn)。Grazioli等[12]研究比對分析，發(fā)現(xiàn)不同型FMDV的抗原位點(diǎn)均包含有VP1 蛋白G-H 環(huán)和C 端、VP2 蛋白B-C 環(huán)、VP3 蛋白部分環(huán)中的殘基，同時各型之間存在部分氨基酸殘基的替換、插入或缺失，肽鏈之間作用方式的也有所不同，造成了它們相對應(yīng)抗原位點(diǎn)構(gòu)象的差異性。Wu Q等[13]把FMDV的P1基因插入到載體腺病毒上并轉(zhuǎn)化到細(xì)胞中， FMDV P1結(jié)構(gòu)蛋白被加工成VP0、VP1和VP3蛋白，此重組載體注入動物，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了中和抗體，其滴度與商品疫苗和單價重組載體產(chǎn)生的中和抗體的滴度相比要低。FMDV在免疫系統(tǒng)選擇位點(diǎn)中有4 個發(fā)揮關(guān)鍵作用的抗原位點(diǎn)，位于VP1第83 位、VP2第79 位、VP3第59、70位。Borley等[14-15]利用FMDV 三維結(jié)構(gòu)學(xué)建立了一種抗原表位預(yù)測方法，能夠準(zhǔn)確預(yù)測出多個FMDV新的抗原表位。

P1 基因在免疫原性和遺傳性方面所具有重要的特點(diǎn)，對其更深入地研究，可以更清楚FMDV的抗原結(jié)構(gòu)特征，也能為FMD流行病學(xué)、毒株演化關(guān)系和基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)，所以倍受國內(nèi)外研究者的關(guān)注。 3A非結(jié)構(gòu)蛋白上也有很多抗原表位，主要集中在羧基端，這些抗原表位與相應(yīng)抗體的結(jié)合能力強(qiáng)[16-17]，通過對抗原分子表位的研究，能夠深入了解FMDV抗原的結(jié)構(gòu)和功能、免疫機(jī)理，為制備新型FMD疫苗以及建立可靠的診斷方法奠定基礎(chǔ)。

2 FMDV P1基因極其編碼蛋白功能研究

2.1 1D 基因編碼產(chǎn)物VP1 的功能

在FMDV結(jié)構(gòu)基因中，VP1基因因其具有血清型特異性，是FMD病毒株遺傳特性及其比較分析的首選基因。目前許多國家在FMD分子流行病學(xué)調(diào)查研究中，利用VP1基因的核苷酸序列測定和分析比較毒株間的同源性。因此，研究VP1基因為FMD流行病學(xué)調(diào)查研究、疫源的追蹤、毒株的進(jìn)化分析提供理論基礎(chǔ)。同時，VP1也是決定FMDV抗原性的主要成分，其氨基酸的第21-40 位是重要的T細(xì)胞抗原表位；第141-160 位和第200-213 位氨基酸殘基是主要的B細(xì)胞抗原表位，能誘導(dǎo)動物產(chǎn)生中和抗體，保護(hù)動物抵抗FMDV的感染，也是抗原性的高變區(qū)[18]。VP1已被確定為是誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的主要免疫原性位點(diǎn)，是研制口蹄疫表位疫苗的首選基因，包含有VP1段多肽的口蹄疫合成肽疫苗能產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答，并且已獲得國家批準(zhǔn)[19]。石慶偉等[20]通過對FMDV樣品VP1基因進(jìn)行實驗室檢測與分析研究，推導(dǎo)出樣品中的FMDV所屬的譜系；對其核苷酸進(jìn)行同源性分析，推導(dǎo)出了與已知同源性最高的毒株；又對其氨基酸變異位點(diǎn)進(jìn)行比對分析，找出了 FMDV樣品VP1的氨基酸序列差異位置，確定了其樣品中VP1基因的高突變區(qū)，可以為了解FMDV流行地區(qū)的遺傳變異情況，為疫苗的合理選擇、疫情預(yù)測和防治措施的制定提供數(shù)據(jù)支持。劉亞麗等[21]對南非型口蹄疫病毒的VP1基因序列及其編碼的氨基酸序列進(jìn)行了比對分析，確定了VP1上含有高保守性的能與宿主細(xì)胞受體結(jié)合的位點(diǎn)RGD基序，在病毒入侵和免疫保護(hù)的過程中起著重要作用。其研究還證明了145(N)、152(D)、158(Q)、218(A)位是O型FMDV抗原位點(diǎn)1的關(guān)鍵氨基酸。FMDV上VP1主要抗原位點(diǎn)所處位置雖然相似，但如果關(guān)鍵性氨基酸發(fā)生變化會對病毒的抗原性及免疫原性均造成了重要影響。分析VP1的高變異區(qū)對FMDV 遺傳變異、流行病學(xué)的研究及新型疫苗的研發(fā)具有重要意義。

2.2 1C 基因編碼產(chǎn)物VP3 的功能

VP3蛋白位于FMDV粒子的衣殼表面，因具有無規(guī)則卷曲的柔性特點(diǎn)，從空間形態(tài)上調(diào)整為不同的構(gòu)象，在物理形態(tài)上、生化性質(zhì)上表現(xiàn)出可動性和多功能性，很大程度上增加了FMDV的抗原性[22]。研究表明VP3蛋白上的第56 位殘基的精氨酸(Arg)對病毒識別硫酸乙酰肝素受體具有決定性的作用。VP3蛋白A功能區(qū)上的游離多肽鏈和B功能區(qū)的β-折疊桶均能成為機(jī)體產(chǎn)生的多克隆抗體所攻擊的靶標(biāo)[23]?？傮w上說，VP3蛋白具有數(shù)量較多的、分段的抗原決定簇，是構(gòu)成FMDV衣殼表面的重要組成抗原，也是主要引起機(jī)體產(chǎn)生免疫攻擊的對象，在FMDV侵襲、復(fù)制的過程中影響著病毒衣殼組裝和分解。

2.3 1B基因編碼產(chǎn)物VP2 的功能

FMDV VP2可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的抗體，具有良好的抗原性和保守型，可以作為抗原檢測FMDV的抗體具有一定的優(yōu)勢[24]。張潤祥等[25]利用表達(dá)出的VP2重組蛋白，建立了一種間接ELISA方法，具有良好的特異性和敏感性，為檢測牛FMD免疫抗體和感染抗體提供了一種簡便有效的新方法。

2.4 1A基因編碼產(chǎn)物VP4的功能

FMDV VP4蛋白具有高度主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的復(fù)雜性，在不同血清型中不發(fā)生變異，具有高度保守性。VP4有主要的T細(xì)胞表位，在T細(xì)胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮決定性作用[26]。VP4蛋白還能誘導(dǎo)動物機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，完整的FMDV粒子和空殼體都具有免疫原性，而衣殼微體沒有免疫原性是因為缺少VP4。所以，認(rèn)為VP1 與VP4 蛋白共存構(gòu)成特定立體構(gòu)型時，才能刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，發(fā)揮其免疫原性[27]。 VP4的碳脂酸纏繞在VP3的N端，對FMDV結(jié)構(gòu)的裝配和穩(wěn)定也具有重要作用。

雖然目前對FMDV抗原結(jié)構(gòu)、功能的研究還不充分，但仍取得了一些結(jié)果，找出了FMDV本身所具備的一些的特征。在FMDV P1基因的4種結(jié)構(gòu)蛋白，VP1變異性最大，VP2較為保守，VP4是最為保守的蛋白[28]；VP1蛋白自身單獨(dú)不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生像完整的病毒衣殼蛋白一樣誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的健全的、較強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，它必須與VP2、VP3和VP4蛋白結(jié)合成相對完整的病毒衣殼結(jié)構(gòu)才能達(dá)到理想的免疫效果[29]。大多數(shù)病毒的侵襲都依賴于易感細(xì)胞膜上的特異性受體，而FMDV的入侵主要是由具有內(nèi)吞作用的依賴整聯(lián)衣殼蛋白和依賴硫酸乙酰肝素[30]。將FMDV的保護(hù)性P1基因，插入到其他病毒、細(xì)菌、植物等載體的基因組中的特定位置，可以高效表達(dá)出重組蛋白的量，進(jìn)而研制活載體疫苗。因此，F(xiàn)MDV所有抗原位點(diǎn)都在P1基因中，與自然感染很接近，能誘導(dǎo)類似于全病毒的抗病毒免疫反應(yīng)，研發(fā)含P1全長基因的基因工程疫苗，對預(yù)防FMDV有廣闊前景。

3 FMDV 3A蛋白功能研究

3A基因是一種非結(jié)構(gòu)蛋白，它參與RNA的整個復(fù)制過程，是一段高度保守的區(qū)域。已有研究表明，3A基因在對適應(yīng)宿主的特異性和毒力方面具有關(guān)鍵的作用，3A上一些關(guān)鍵性氨基酸的變異或缺失，能導(dǎo)致宿主范圍的改變。因此，3A基因氨基酸的變異與病毒對宿主的選擇具有優(yōu)勢相關(guān)性[31]。不同宿主適應(yīng)性FMDV的非結(jié)構(gòu)蛋白在3A基因水平上表現(xiàn)出了極大的差異。FMDV對宿主的嗜性、致病力與3A基因的變異具有密切的聯(lián)系[32]。Jackson對不同毒株的FMDV的3A基因群序列比對發(fā)現(xiàn)，3A基因的發(fā)生核苷酸變異的位點(diǎn)很少，而且是零星地散在3A的基因片段上，引起的氨基酸變異位點(diǎn)集中在3A基因的后半段[33]。 3A基因根據(jù)變異情況可以分為前后兩段，前半段為N端(1-75 位氨基酸)具有高度的保守性，是維持FMDV的基礎(chǔ)毒力；后半段C端(76-153 位氨基酸)，是相對容易發(fā)生缺失和變異，在一定程度上能夠影響FMDV對不同種宿主的嗜性[34]。除此之外，3A基因與其他基因有著協(xié)同作用，如3A、3AB都是重要的RNA復(fù)制因子，與細(xì)胞內(nèi)膜密切相關(guān)；2C或3A蛋白上的氨基酸置換與FMDV毒力的修飾、細(xì)胞嗜性和宿主范圍有關(guān)，并且非結(jié)構(gòu)蛋白2C、3A和3B是與細(xì)胞病理學(xué)相關(guān)的重要調(diào)控因子等。周強(qiáng)等[35]研究對來自不同宿主的Mya98譜系毒株進(jìn)行了病毒分子特征的分析和蝕斑顯型的比較，在非結(jié)構(gòu)蛋白3A、2C和3B上發(fā)現(xiàn)了具有重要意義的8 個氨基酸的變異位點(diǎn)，結(jié)果表明像3A這類非結(jié)構(gòu)蛋白的特定的關(guān)鍵性氨基酸變異會對其編碼蛋白的功能產(chǎn)生相應(yīng)的影響，從而改變了對蝕斑的顯型。Pacheco等[36]研究表明3A蛋白的87-106 位氨基酸缺失后對宿主的嗜性造成了影響，證明了3A蛋白部分基因的缺失能夠降低病毒對牛的致病力。隨后有研究進(jìn)一步證實3A 蛋白93-102 位缺失是一種對牛致弱性的變異，并且首次提出了3A蛋白93-102 位的氨基酸缺失并非完全決定FMDV的宿主嗜性，3A蛋白上其他區(qū)域也對宿主的嗜性起到一定的影響作用[37]。最近，美國梅島中心的研究發(fā)現(xiàn)，3A蛋白能與宿主蛋白DCTN3相結(jié)合，并且能夠促進(jìn)FMDV的復(fù)制，而已經(jīng)發(fā)生變異的3A蛋白則不能與DCTN3相結(jié)合，3A蛋白能直接影響FMDV的復(fù)制能力[38-40]。因此，對3A蛋白的膜相關(guān)性、宿主嗜性、糖基化的底物和抑制宿主蛋白分泌等作用的進(jìn)一步研究具有重要意義。

4 結(jié)語

P1基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白，是不同血清型分類的標(biāo)準(zhǔn)，也是FMDV主要抗原位點(diǎn)所在的區(qū)域。P1基因的變異有利于研究者得到與流行病毒株的抗原匹配性，能夠及時更新疫苗毒株，在生產(chǎn)中這是保障FMD疫苗效力的一個最為重要的方式和技術(shù)指標(biāo)[41]。Zhang Z等[42]基于VP1抗原位點(diǎn)、3A的抗原表位和3D蛋白，設(shè)計了3種合成肽疫苗，結(jié)果表明3種合成肽疫苗均使乳鼠、牛產(chǎn)生了抗病毒的中和抗體。3A基因及其編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白，前半段具有高度保守性，后半段能夠影響FMDV毒株對其宿主的嗜性，對病毒適應(yīng)不同宿主具有重要意義。因此，研究FMDV基因組的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒裝配和分解過程中發(fā)揮的作用，能夠更清楚FMDV生物學(xué)特性和病毒的增殖機(jī)理，對開展免疫學(xué)、診斷技術(shù)以及新型疫苗的研究具有重要作用。

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Advance in Structural Protein P1 and Non-structural Protein 3A of Foot-and-mouth Disease Virus

YAO Huai-bing1，ZHAO Yi2，LI Jin-na1，LIU Hong2，REN Fang2，HUANG Jiong3
(1.VeterinaryMedicineCollegeofXinjiangAgriculturalUniversity，Urumqi，Xinjiang，830052，China；2.TeconBio-technologyCo，Urumqi，Xinjiang，830000，China；3.InstituteofVeterinaryMedicine，XinjiangAcademyofAnimalScience，Urumqi，Xinjiang，830000，China)

The structural protein P1 encoded by foot-and-mouth disease virus(FMDV) is the major capside protein, which is the classified criteria of different serotypes of FMDV,and mostly determines the FMDV antigenicity. Non-structural protein 3A can bind to host cells, and their characteristic changes are closely related to phenotypic changes of the virus, affecting the host tropism and virulence, both of which have

significant attention. Therefore, in this paper, the research progress on the structure, antigenic properties and biochemical properties of P1 and 3A of FMDV were reviewed.

Foot-and-mouth disease virus(FMDV); structural protein P1; non-structural protein 3A; antigenic properties

2016-11-25

新疆維吾爾自治區(qū)科研機(jī)構(gòu)創(chuàng)新發(fā)展專項資金項目(2016D04008)；新疆維吾爾自治區(qū)產(chǎn)學(xué)研聯(lián)合培養(yǎng)研究生示范基地項目(xjaucxy-yjs-20152008)

姚懷兵(1990-)，男，新疆五家渠人，碩士研究生，主要從事口蹄疫病毒的研究。*通訊作者

S852.659.6

A

1007-5038(2017)06-0066-05