楊 娟，吳海濱，譚 珊，宋欣媛，王 肖，吳培福

(西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明 650224)

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昆明市雞源大腸埃希菌耐藥基因的流行特征研究

楊 娟△，吳海濱△，譚 珊，宋欣媛，王 肖，吳培福*

(西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明 650224)

為了解昆明市區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)雞源大腸埃希菌耐藥基因的攜帶情況，采用PCR技術(shù)對(duì)140株雞肝中大腸埃希菌的22個(gè)耐藥基因進(jìn)行了檢測(cè)。研究表明，140株大腸埃希菌中TEM和Gyra(QRDR)基因檢出率最高為100%；aph(3)-Ⅱa基因的檢出率最低為22.86%，且13個(gè)耐藥基因檢出率在50%以上。呈貢區(qū)、官渡區(qū)、盤龍區(qū)、五華區(qū)、西山區(qū)檢出率最低的耐藥基因分別為aph(3)-Ⅱa、OXA、tetB和OXA、SHV、aac(3)-Ⅱa基因。研究結(jié)果可為大腸埃希菌病的臨床用藥提供理論指導(dǎo)，為公共衛(wèi)生安全提供參考依據(jù)。

雞源大腸埃希菌；耐藥基因；流行特征

禽大腸埃希菌病是由致病性大腸埃希菌(Escherichiacoli)引起的細(xì)菌性傳染病[1]。現(xiàn)已成為養(yǎng)禽業(yè)中最常見的病原菌之一。本病在防治過(guò)程中，隨著抗生素的使用，大腸埃希菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性不斷的增加[2]。動(dòng)物大腸埃希菌攜帶的耐藥基因可能會(huì)隨著食物鏈傳播給人類[3]。為此，本研究檢測(cè)由昆明市區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)雞肝分離出的大腸埃希菌耐藥基因的攜帶情況，可為大腸埃希菌病的臨床用藥提供理論依據(jù)，為公共衛(wèi)生安全提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

140株大腸埃希菌由實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保存；伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基(EMB)、蛋白胨、酵母粉、氯化鈉均購(gòu)自昆明碩陽(yáng)科技有限公司。

1.2 大腸埃希菌DNA提取

通過(guò)煮沸法[4]提取大腸埃希菌基因組DNA。將復(fù)壯好的大腸埃希菌以1∶100接種量接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)8 h。取6 mL培養(yǎng)物10 000 r/min 4℃離心5 min，棄上清液，加入200 μL ddH2O使菌體懸浮，100℃水浴10 min后立即冰浴10 min，然后10 000 r/min 4℃離心5 min，上清即為DNA模板，并于-20℃保存。

1.3 耐藥基因的擴(kuò)增

本研究對(duì)22個(gè)耐藥基因攜帶情況進(jìn)行了檢測(cè)。包括磺胺類耐藥基因(sul1、sul2、sul3)；四環(huán)素類耐藥基因(tetA、tetB)，氨基糖苷類耐藥基因(aacC2、aacC4、aadAl、aadA2、aac(3)-Ⅰa、aac(3)-Ⅱa、aph(3)-Ⅱa)，氯霉素類耐藥基因(Catl、CmlA、Flor)，β-內(nèi)酰胺類耐藥基因包括(CTX-M、SHV、OXA、TEM)，喹諾酮類基因包括Gyra(QRDR)、QnrS，其他基因Aac(6′)-Ib-cr。擴(kuò)增引物及參數(shù)參考文獻(xiàn)5。引物由鉑尚生物技術(shù)有限公司合成。

2 結(jié)果

2.1 大腸埃希菌耐藥基因PCR檢測(cè)情況

采用PCR技術(shù)，對(duì)140株大腸埃希菌的22個(gè)耐藥基因進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果見表1。TEM和Gyra(QRDR)基因檢出率最高為100%；aph(3)-Ⅱa基因的檢出率最低為22.86%。13個(gè)耐藥基因檢出率在50%以上。磺胺類、四環(huán)素類、氨基糖苷類、氯霉素類、β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類檢出率最高的基因分別為sul2、tetA、aadA2、Flor、TEM、Gyra(QRDR)基因。

昆明市不同區(qū)的耐藥基因的檢出率不同。呈貢區(qū)、官渡區(qū)、盤龍區(qū)、五華區(qū)、西山區(qū)檢出率最低的耐藥基因分別為aph(3)-Ⅱa、OXA、tetB和OXA、SHV、aac(3)-Ⅱa基因。sul2基因在西山區(qū)的檢出率最低，其他區(qū)的檢出率均為100%。

2.2 大腸埃希菌同時(shí)攜帶耐藥基因的數(shù)量

分離株同時(shí)攜帶了6個(gè)以上耐藥基因，同時(shí)攜帶10個(gè)以上耐藥基因的大腸埃希菌占分離株的90.71%；同時(shí)攜帶15個(gè)以上耐藥基因的大腸埃希菌占分離株的38.57%；同時(shí)攜帶14個(gè)耐藥基因的大腸埃希菌數(shù)最多(26株)。

表1 昆明市大腸埃希菌耐藥基因陽(yáng)性率

注：A.呈貢區(qū);B.官渡區(qū);C.盤龍區(qū);D.五華區(qū);E.西山區(qū)。

Note:A.Chenggong region;B.Guandu region;C.Panlong region;D.Wuhua region;E.Xishan region.

3 討論

由于禽致病性大腸埃希菌的血清型比較多，抗生素仍是防治大腸埃希菌病最重要的方法之一，但由于抗生素的使用不當(dāng)，使得許多細(xì)菌對(duì)藥物都產(chǎn)生了耐藥性，并且耐藥譜不斷增寬[6]。在不久的將來(lái)，抗生素可能很難治療禽大腸埃希菌病[7]。禽致病性大腸埃希菌耐藥性與其耐藥基因的攜帶率有明顯的相關(guān)性，為此，耐藥基因的檢測(cè)對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐有重要的指導(dǎo)意義。

在本研究中，22個(gè)耐藥基因全部檢出，除β-內(nèi)酰胺類的TEM基因和喹諾酮類的Gyra(QRDR)基因的檢出率為100%外，其余都有不同比例的檢出。牛建寧[8]對(duì)陜西雞大腸埃希菌四環(huán)素的tetA和tetB耐藥基因檢出率分別為81.4%、21.7%，比本研究結(jié)果高；除aac(3)-Ⅱa和tetB基因外其余磺胺類、四環(huán)素類、氨基糖苷類、氯霉素類、β-內(nèi)酰胺類耐藥基因的檢出率均比張忠[5]的檢出率高；喹諾酮類和其他耐藥基因均比張飛燕[9]對(duì)河北省雞病樣中檢出率高。

昆明市不同區(qū)對(duì)22個(gè)耐藥基因的檢出率存在著差異。這與農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)進(jìn)貨渠道不同有很大的關(guān)系，昆明市周邊養(yǎng)雞場(chǎng)使用抗生素的偏向性不同，從而導(dǎo)致不同的養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)抗生素的耐藥性不同。這樣不同區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)雞肝中大腸埃希菌的耐藥基因的檢出率存在著差異。

綜上所述，本研究中的大腸埃希菌分離于昆明市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)雞肝中，大多數(shù)耐藥基因的檢出率均比之前的研究結(jié)果偏高。說(shuō)明昆明市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)雞肝中大腸埃希菌耐藥基因攜帶率高，同時(shí)也反映出昆明市周邊雞場(chǎng)不恰當(dāng)?shù)氖褂每股?。而農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的食品有關(guān)公共衛(wèi)生安全，雞肝中大腸埃希菌的耐藥基因很可能傳播給人類，應(yīng)該減少抗生素在臨床上的使用，或者找抗生素的替代藥。本研究可為治療禽致病性大腸埃希菌病的臨床用藥提供理論依據(jù)。

[1] 嚴(yán)杜建.禽源性大腸埃希菌研究進(jìn)展[J].畜牧與飼料科學(xué),2016,04:87-89,107.

[2] 李 棟.禽源大腸埃希菌質(zhì)粒介導(dǎo)氟喹諾酮類耐藥基因的檢測(cè)及中藥消除耐藥性研究[D].江蘇揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué),2015.

[3] Yan X M,Wang B,Tao X X,et al.Characterization ofStaphy-lococcusaureusstrains associated with food poisoning in Shenzhen,China[J].Appl Environ Microbiol,2012,78(18):6637-6642.

[4] 許一平.多重PCR檢測(cè)沙門菌、大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的研究[D].湖北武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

[5] 張 忠.寧夏地區(qū)大腸埃希菌臨床分離株的耐藥性研究[D].寧夏銀川:寧夏大學(xué),2013.

[6] 曹春光.蘇魯部分地區(qū)禽致病性大腸埃希菌的分離及2個(gè)O78分離株致病性的研究[D].江蘇揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué),2015.

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[8] 牛建寧,崔恩慧,唐 攀,等.雞源致病性大腸埃希菌對(duì)四環(huán)素類抗生素耐藥性及耐藥基因檢測(cè)[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2014,11:35-39.

[9] 張飛燕.雞源性大腸埃希菌耐藥性檢測(cè)及相關(guān)耐藥基因的研究[D].河北保定:河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

Study on Epidemiologic Characteristics of Drug Resistance Genes of AvianEscherichiacoliin Kunming

YANG Juan,WU Hai-bin,TAN Shan,SONG Xin-yuan,WANG Xiao,WU Pei-fu
(CollegeofLifeScience,SouthwestForestryUniversity,Kunming,Yunnan,650224,China)

To study the carrying situation of drug resistance genes of avianEscherichiacoliin the markets of Kunming city,a total of 22 resistance genes were checked in 140 avianEscherichiacoliisolates of chicken livers by PCR.The results showed that the carrying rates ofTEMandGyra(QRDR) genes were the highest in 140 strains ofEscherichiacoli,which was 100%.Theaph(3)-Ⅱagene carrying rate was the lowest,which was 22.86%,and the detection rate of 13 resistant genes was more than 50%.In Chenggong district,Guandu district,Panlong district,Wuhua district,Xishan district,the lowest detection rates of resistant gene wereaph(3)-Ⅱa,OXA,tetBandOXA,SHV,aac(3)-Ⅱa.The results provided a theoretical support for the clinical rational drug uses,and provided the reference for public health security.

avianEscherichiacoli; drug resistance gene; epidemiological characteristics

2016-10-19

云南省優(yōu)勢(shì)特色重點(diǎn)學(xué)科生物學(xué)一級(jí)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(50097505)；云南省高校林下生物資源保護(hù)及利用科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(51400605)

楊 娟(1992-)，女，云南人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物疫源疫病研究?！魍蓉暙I(xiàn)作者。*通訊作者

S852.612

A

1007-5038(2017)06-0017-03