庫爾班江·麥麥提敏，艾力·艾爾肯，蔣志惠，張小鶯,，米克熱木·沙衣布扎提*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

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刺糖對酒精性肝病TNF-α和TLR4表達(dá)及病理變化的影響

庫爾班江·麥麥提敏1，艾力·艾爾肯1，蔣志惠2，張小鶯1,2，米克熱木·沙衣布扎提1*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

探討刺糖對酒精性肝病(Alcoholic liver disease, ALD)小鼠肝組織TNF-α和TLR4表達(dá)及組織病理變化的影響。將42只小鼠隨機(jī)分成空白組、模型組、水飛薊賓陽性組、刺糖高、中、低劑量組。模型組以500 mL/L酒精造模，空白對照組(15 mL/kg 生理鹽水)、刺糖高、中、低(600、300、150 mg/kg)、水飛薊賓(300 mg/kg)灌胃，每日藥物處理后用500 mL/L酒精(10 mL/kg)灌胃2次(分別為藥物處理后2 h和藥物處理后10 h)，連續(xù)3 d，末次灌胃酒精12 h后，取肝臟提取mRNA，制備肝臟標(biāo)本進(jìn)行HE染色，實時熒光定量PCR檢測肝組織TNF-α和TLR4 mRNA表達(dá)。結(jié)果表明，與模型組相比，小鼠肝臟中TNF-α和TLR4 mRNA表達(dá)水平明顯降低。各刺糖給藥組均抑制酒精引起的TNF-α和TLR4基因 mRNA表達(dá)水平的增強(qiáng)。刺糖高、中、低劑量組均能夠改善酒精所引起的肝臟病理變化?？赏瞥龃烫菍凭鸬男∈蟾螕p傷有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抑制TNF-α和TLR4基因mRNA表達(dá)有關(guān)。

刺糖；腫瘤壞死因子-α；Toll樣受體4；病理變化；酒精性肝損傷

酒精性肝病(ALD)已經(jīng)成為世界上一個主要的健康問題，據(jù)世界衛(wèi)生組織的調(diào)查，全球所有死亡人數(shù)的5.9%由有害使用酒精而起[1]。過量飲酒一直被認(rèn)為是肝臟疾病發(fā)展的一個重要因素。目前，研究發(fā)現(xiàn)酒精性肝損傷的機(jī)制途徑很多，相關(guān)損傷途徑包括酒精代謝產(chǎn)物乙醛毒性、炎癥反應(yīng)損傷、氧化應(yīng)激損傷、細(xì)胞線粒體功能障礙、內(nèi)毒素(LPS)損傷及營養(yǎng)不良等，其中炎癥反應(yīng)性損傷在ALD的發(fā)生發(fā)展過程中起到了至關(guān)重要的作用[2]。酒精進(jìn)入體內(nèi)后使LPS入血而激活Kupffer細(xì)胞，并產(chǎn)生大量的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎癥因子，導(dǎo)致肝損傷[3]。Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)是一類模式識別受體, 在細(xì)胞活化信號的傳導(dǎo)信號中起重要作用,可直接識別某些病原微生物或其產(chǎn)物特定的分子結(jié)構(gòu)，在急慢性肝炎、酒精性肝病和非酒精性肝病等各種肝臟疾病的發(fā)生中起重要作用[4]?，F(xiàn)今為止，在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)13種TLR超基因家族成員，Toll樣受體4(TLR4)為其中重要的一個[5]。近年來的研究顯示，TLR4是各種肝臟疾病發(fā)生肝臟炎癥的關(guān)鍵介質(zhì)[6]，它可以誘導(dǎo)各種不同細(xì)胞因子的合成與釋放繼而引發(fā)炎癥反應(yīng)造成肝臟損傷，導(dǎo)致氧化應(yīng)激并產(chǎn)生和促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生,如TNF-α、IL-6等，這些炎癥因子在急性酒精性肝損傷的病理發(fā)展過程中具有重要作用[3,7]。盡管有許多藥物可以治療ALD，但均有療效不確定及存在不同程度毒副作用，因此研制開發(fā)高效低毒防治ALD的天然藥物已成為科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。刺糖(terenjiwil)是維吾爾民間藥用植物駱駝刺葉分泌的甜蜜，黃棕色粉末狀物質(zhì)。本草綱目記載刺糖為上品無毒、解熱藥、解毒中藥。它是一種重要的民間藥用植物，已被用于發(fā)汗、利尿、祛痰、潰瘍[8]和肝臟損害[9]的治療。刺糖的主要成分為多糖，目前已表明多糖具有促進(jìn)肝臟解毒作用，提高肝細(xì)胞內(nèi)肝糖原的含量，同時還可以抑制肝糖原的合成，有利于肝細(xì)胞的恢復(fù)。試驗研究表明，刺糖具有較強(qiáng)的還原能力，以及良好的自由基清除能力[10]。根據(jù)這些結(jié)果和民族藥學(xué)記載，我們推測刺糖可能對ALD有保護(hù)作用。本研究旨在探討刺糖對酒精過量引起的肝損傷的影響并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 蘇木精和伊紅，北京索萊寶科技有限公司；多聚甲醛，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；中性樹膠，中國上海標(biāo)本模型廠；無水乙醇、二甲苯，成都市科龍化工試劑廠；總RNA 提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；2×TaqMaster Mix，HiScript QSelect RT SuperMix for qPCR，AceQ qPCR SYBR Green Master Mix，諾唯贊生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要儀器 LGJ-12 型冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司; RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠; SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司; iQ5 實時熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad；Leica RM 2235 輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，德國Leica公司；顯微鏡，尼康儀器有限公司；FRESCO17 高速冷凍離心機(jī)，美國Thermo公司。

1.1.3 實驗動物 清潔級昆明種小鼠，雌性，體重28 g±2 g，購買于第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。飼養(yǎng)于西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，自由進(jìn)食和飲水。試驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 方法

1.2.1 植物材料及制備 刺糖(采摘自吐魯番盆地)購買于新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院。將10 g刺糖放入加有200 mL蒸餾水的圓底燒瓶中，煮沸2 h，過濾，殘渣加100 mL蒸餾水再提取，最后兩次濾液混合，隨后集中在旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器中濃縮，濃縮液冷凍后放入冷凍干燥機(jī)(-65 ℃)中進(jìn)行冷凍干燥，干燥提取物存儲在4 ℃冰箱備用。

1.2.2 分組及給藥 取42只健康昆明雌性小鼠，隨機(jī)分為6個組，每組7只小鼠。分別為：①正常對照組(NC組)，②用500 mL/L酒精處理的模型組(ALC組)，③酒精和低劑量刺糖組(AHL+ALC組)，④酒精和中劑量刺糖組(AHM+ALC組)，⑤酒精和高劑量刺糖組(AHH+ALC組)，⑥酒精處理水飛薊賓組(SL+ALC組)。注：上述各組酒精劑量為10 mL/kg，低劑量刺糖為150 mg/kg，中劑量刺糖為300 mg/kg，高劑量刺糖為600 mg/kg。 給藥后，小鼠稱重，采集血液樣本進(jìn)行生化分析，解剖分離肝臟。

1.2.3 實時熒光定量PCR測定mRNA的表達(dá) 肝組織標(biāo)本用天根RNA提取試劑盒，提取總mRNA， HiScriptTM RT Super Mix for qPCR試劑盒要求，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBER Green嵌合熒光法，實時熒光定量PCR儀擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參基因。按照Vazyme實時熒光定量PCR試劑盒說明加樣。以β-actin作為內(nèi)參照，設(shè)計引物序列如下。TNF-α：上游為5′ATTGAGCACAGGCATAAAGAT3′，下游為5′TCTAGTTCTGGTTTTGAACAGTG 3′；片段長度為715 bp。TLR4：上游為5′ GCACTGTTCTTCTCCTGCC3′，下游為5′ GTTTCCTGTCAGTATCAAG3′；片段長度為293 bp。內(nèi)參照：β-actin：上游為5′ GGCTCCCAGCACCATGAA3′，下游為5′ GCCACCGATCCACACAGAGT3′；片段長度為185 bp。

結(jié)果判斷: 公式1： △循環(huán)閾值(cycle threshold, Ct)= 樣品Ct均值-內(nèi)參照Ct均值,公式2： △△Ct = △Ct -(隨機(jī)陰性對照樣品Ct均值-該樣品內(nèi)參照Ct均值), 以2-△△Ct表示樣品中目的基因初始cDNA相對表達(dá)量。mRNA的相對表達(dá)用公式2來控制基因的靶基因的比率(ΔΔCT)，ΔΔCt=control (CtTarget-Ctβ-actin)-treatment(CtTarget-Ctβ-actin)。

1.2.4 病理組織切片觀察 取肝臟左葉浸泡于40 mL/L多聚甲醛溶液固定48 h，石蠟包埋切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微鏡鏡檢，拍照成像，觀察肝組織病理改變。

1.2.5 統(tǒng)計分析 數(shù)值以 mean ± SD 表示。差異顯著性通過 SPSS 19.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，t 檢驗比較各試驗組與對照組間的差異，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 刺糖對小鼠酒精誘導(dǎo)的肝臟TNF-α和TLR4 mRNA表達(dá)水平的影響

實時熒光定量PCR結(jié)果表明，模型組小鼠的肝臟中TNF-α和TLR4 mRNA表達(dá)水平顯著增加，作為比較對照組5.2±0.54和5.13±0.48(表1)。各刺糖給藥組均抑制酒精所致的TNF-α和TLR4基因 mRNA表達(dá)水平的增強(qiáng)。特別是AHH和AHM刺糖給藥組顯著性降低TNF-α和TLR4 mRNA的表達(dá)，TNF-α mRNA表達(dá)水平分別為1.48±0.30和1.65±0.65，TLR4 mRNA的表達(dá)水平分別為2.81±0.28和3.05±0.06(P< 0.01)。

2.2 刺糖對酒精引起的肝組織病理變化的影響

400倍光鏡下觀察，空白對照組肝臟組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核大、圓而清晰，有的細(xì)胞是雙核的，肝小葉輪廓清晰，肝細(xì)胞排列整齊(圖1A)。酒精所灌胃的模型組肝臟出現(xiàn)了顯著的病理變化，肝細(xì)胞排列紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞。肝小葉界限不清，細(xì)胞界限及胞核模糊不清，胞漿內(nèi)出現(xiàn)彌漫性大小不等的脂肪空泡，并出現(xiàn)壞死和炎性細(xì)胞浸潤(圖1B)。各治療組損傷有不同程度的減輕，以中、高劑量組較為明顯。低劑量組肝細(xì)胞核出現(xiàn)少量的雙核形式，但細(xì)胞輕微水腫(圖1C)，中、高劑量藥組和陽性藥物對照組大部分肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列變得緊密，肝細(xì)胞壞死程度減小，肝細(xì)胞形狀基本規(guī)則，出現(xiàn)雙細(xì)胞核現(xiàn)象，與正常組相比無顯著性病理變化(圖1D，E和F)。結(jié)果表明，刺糖能夠明顯減輕酒精導(dǎo)致的肝組織損傷。圖中箭頭所指為雙核細(xì)胞； 圈圈中細(xì)胞漿疏松呈空泡樣。A為正常對照組，肝細(xì)胞呈多面形，細(xì)胞核大而圓，有的細(xì)胞為雙核；B為模型組，肝細(xì)胞漿疏松呈空泡樣； C為刺糖低劑量(150 mg/kg)+ 酒精組，伴有少量肝細(xì)胞水腫，胞漿疏松呈空泡樣病變；D為刺糖中劑量(300 mg/kg)+ 酒精組，大量肝細(xì)胞恢復(fù)雙核，肝血竇位于肝板間；E為刺糖高劑量(600 mg/kg)+ 酒精組，肝細(xì)胞出現(xiàn)雙核，與正常組無差異；F為陽性對照組，肝細(xì)胞出現(xiàn)雙核，與正常組無差異。

表1 刺糖對小鼠酒精誘導(dǎo)的肝臟TNF-α和TLR4 mRNA表達(dá)水平的影響

圖1 刺糖對酒精引起的小鼠肝臟病理變化的影響

Fig.1 Effect ofAlhagihoney on histopathological lesions in the liver of mice after alcohol induction

3 討論

本研究中酒精性肝損傷模型的小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的酒精代謝導(dǎo)致的肝損傷，顯示肝組織病理變化及炎癥因子TNF-α在肝臟中的表達(dá)明顯增加，提示酒精性肝損傷模型成功建立。ALD作為全世界范圍內(nèi)常見的肝病之一，廣泛受到學(xué)術(shù)界的關(guān)注，其最初為急性炎癥，然后發(fā)展到脂肪肝，酒精性肝炎，最終導(dǎo)致肝纖維化和肝硬化。長期過量飲酒能夠造成酒精中毒，但是目前還沒有確切的發(fā)病機(jī)制及有效治療方法，因此，ALD預(yù)防和治療藥物及策略研究成為研究的熱點(diǎn)[11]。刺糖是野生駱駝刺分泌的一種天然果糖，是維吾爾醫(yī)用于治病的上品，主要成分為多聚糖，多糖有利于肝細(xì)胞的恢復(fù)[12]，研究表明多糖可能有肝臟保護(hù)作用[13]。

TLR4通路促進(jìn)TNF-α的釋放，然后增加促炎細(xì)胞因子和炎癥[14]。LPS-TLRs信號通路的下游基因應(yīng)答產(chǎn)物中，TNF-α主要由活化的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，促進(jìn)白細(xì)胞聚集和活化，釋放多種炎癥介質(zhì)，引起一系列炎性損傷。研究證實，TNF-α在急性炎癥所致的肝衰竭的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。酒精增加門靜脈血液循環(huán)內(nèi)毒素的水平，激活Kupffer細(xì)胞，從而導(dǎo)致關(guān)鍵細(xì)胞因子(包括TNF-α)的上調(diào)[15]。

本研究結(jié)果亦顯示了TLR4在LPS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要作用?？瞻捉M僅有少量TLR4基因表達(dá), 而模型小鼠肝組織TLR4基因表達(dá)量均明顯增高。各組刺糖均能顯著降低模型大鼠肝組織TLR4基因表達(dá). 在降低TLR4表達(dá)方面, 高>中>低刺糖均可降低TLR4的基因表達(dá), 阻止信號的進(jìn)一步傳遞。降低內(nèi)毒素信號傳導(dǎo)的效率, 減少炎癥因子的產(chǎn)生和對肝細(xì)胞的損傷。此外，肝臟病理組織學(xué)檢查顯示，酒精模型組肝損傷比較明顯，而刺糖組肝損傷明顯減輕。上述結(jié)果表明，刺糖通過促進(jìn)酒精代謝而能夠顯著降低TNF-α與TLR4 mRNA的表達(dá)水平，促進(jìn)肝組織修復(fù)和肝細(xì)胞再生，從而對肝損傷產(chǎn)生有效保護(hù)作用。

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Effect ofAlhagiHoney on TNF-α, TLR4 Expressions and Pathological Lesions in Mice with Alcohol Induced Liver Disease

KUERBANJIANG-Maimaitimin1, AILI-Aierken1,JIANG Zhi-hui2, ZHANG Xiao-ying1, 2, MIKEREMU-Shayibuzhati1
(1.CollegeofVeterinaryMedicine,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi,Xinjiang，830052,China; 2.CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling，Shaanxi,712100,China)

To investigate the effect ofAlhagihoney on TNF-α, TLR4 expressions and pathological lesions in mice with alcohol induced liver disease (alcoholic liver diseases, ALD), 42 mice were randomly divided into control group, model group, silybin positive group,Alhagihoney high, medium and low dose groups. A model of alcoholic liver disease was induced by gastric perfusion of alcohol, expect the control group, high, medium and low Alhagi honey (600 mg/kg, 300 mg/kg, 150 mg/kg), silymarin (300 mg/kg) gastric perfusion, after intragastric administration with 50% alcohol (10 mL/kg) 2 times a day, 3 consecutive days, the last 12 h after intragastric administration of alcohol, the liver extraction of RNA, liver tissue sections were stained with HE, real-time quantitative PCR was performed to detection TNF-α, TLR4 mRNA expressions in liver tissue. Results indicated that compared with the model group, the expressions of TNF-α and TLR4 mRNA levels in liver were significantly improved. EachAlhagihoney group inhibited alcohol induced mRNA expressions of TNF-α and TLR4. The high, medium and low dose groups were able to improve the alcohol-induced liver pathological lesions. This study showed thatAlhagihoney has a protective effect on alcohol induced liver injury, and its mechanism may be related to the inhibition of TNF-α and TLR4 mRNA expressions.

Alhagihoney; TNF-α; TLR4; pathological lesion; alcohol liver disease

2016-11-11

國家自然科學(xué)基金項目(31460677)

庫爾班江·麥麥提敏(1991-)，男(維吾爾族)，新疆和田人，碩士，主要從事基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)研究。 *通訊作者

S852.3

A

1007-5038(2017)06-0029-04