楊勝男，牛德新，張洪映，連文力，張權(quán)，張曉陽，楊新士，崔 紅

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院 河南 鄭州 450002; 2.山東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司青州卷煙廠 山東 青州 262500； 3.江西省贛州市煙草公司石城分公司 江西 贛州 341000)

雙波法測定煙草淀粉組分含量的前處理改進(jìn)

楊勝男1，牛德新1，張洪映1，連文力1，張權(quán)2，張曉陽2，楊新士3，崔 紅1

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院 河南 鄭州 450002; 2.山東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司青州卷煙廠 山東 青州 262500； 3.江西省贛州市煙草公司石城分公司 江西 贛州 341000)

為改進(jìn)雙波長分光光度計(jì)法測定煙草淀粉組分的前處理，參照其他作物淀粉組分的測定方法，結(jié)合煙草淀粉的特殊來源，借助索氏提取器將脂肪、色素、糖類等對淀粉測定有影響的物質(zhì)除去，然后對樣品中淀粉組分含量進(jìn)行測定。結(jié)果表明，前處理改進(jìn)后所得樣品的重復(fù)性試驗(yàn)相對偏差小，待測樣品溶液穩(wěn)定性良好；加標(biāo)樣直鏈淀粉的平均回收率為103.71%。改進(jìn)后的前處理方法操作便捷，適用于煙草制品批量檢測。

煙草；淀粉組分；雙波長分光光度法；前處理改進(jìn)

淀粉是煙草生長過程中重要的碳水化合物。烤后煙葉中的淀粉影響燃燒速度和燃吸安全性，同時(shí)產(chǎn)生焦糊氣味，對煙氣產(chǎn)生不良影響，淀粉含量已成為煙草品質(zhì)評價(jià)的重要指標(biāo)[1]。淀粉的降解除了與烘烤過程中的溫濕度條件有關(guān)之外，也與淀粉本身的結(jié)構(gòu)組成有關(guān)，因此，相對于淀粉總量，研究淀粉積累過程中組分的變化更具意義[2,3]。測定淀粉含量的常用方法有比色法、酶解法、酸解法和旋光法等，最為普遍的是碘比色法。直鏈淀粉與碘生成深藍(lán)色復(fù)合物，支鏈淀粉與碘生成紫紅-棕紅色復(fù)合物，在同一波長處兩者均有吸收，而雙波長法正好消除了兩類淀粉吸收背景的相互影響，減少兩者引起的誤差，大幅度提高測定的準(zhǔn)確度[4-6]。目前利用雙波法對淀粉組分的測定主要集中在小麥、水稻等禾本科作物上，煙草淀粉組分含量的測定報(bào)道較少。煙葉淀粉含量較少，烤后煙葉淀粉含量更少；同時(shí)，葉片淀粉中含有脂質(zhì)、色素等較淀粉作物更多的影響因素，因此，煙草淀粉組分的測定更為麻煩，樣品前處理成為是測定組分含量的關(guān)鍵。通過本試驗(yàn)的探索，以期為煙草中直鏈淀粉的測定提供一條更為簡便快速，適用于大批量的樣品分析的途徑，同時(shí)為研究淀粉組分與淀粉降解、煙葉品質(zhì)的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

煙葉品種K 326，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草栽培生理生化研究基地提供。直鏈淀粉、支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)樣品(購于美國Sigma公司，來自馬鈴薯)；無水乙醇、丙酮、石油醚、KI、KOH、碘和鹽酸(均為市售A.R.)。直鏈淀粉、支鏈淀粉得標(biāo)準(zhǔn)溶液及碘液的制備參照王文超等[7]的方法。80%乙醇-氯化鈉飽和溶液：稱取64 g氯化鈉，溶于200 mL水中，加入800 mL無水乙醇，溶解，靜置待溶液澄清后過濾。

UV-2550紫外可見分光光度計(jì)(上海精密儀器儀表有限公司)，HHS-21-4數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋(上海百典儀器設(shè)備有限公司)，F(xiàn)A1004N電子分析天平(感量：0.000 1 g，上海賽德利思精密儀器儀表有限公司)，SXT-06索氏脂肪抽提器(杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司)；PHS-3CT型酸度計(jì)(上海正舉自動(dòng)化儀表有限公司)；DRGF-026電熱鼓風(fēng)干燥箱(吳江品格烘箱電爐制造有限公司)；容量瓶(50，100 mL)和吸量管(0.5，2.0和5.0 mL)(成都昌元玻璃制品有限公司)；濾紙(脫脂，中速)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)原理 根據(jù)雙波長比色原理[8]，如果溶液中某溶質(zhì)在2個(gè)波長下均有吸收，則2個(gè)波長的吸收差值與溶質(zhì)濃度呈正比。兩類淀粉的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別與碘起顯色反應(yīng)，按照全波長吸收曲線確定最大吸收波長和參比波長，對含有直鏈淀粉和支鏈淀粉的未知樣品，與碘顯色后，在選定的波長處進(jìn)行4次比色，然后利用標(biāo)準(zhǔn)曲線即可分別求出樣品中兩類淀粉的含量。

1.2.2 直鏈淀粉和支鏈淀粉的標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別吸取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL的直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液于50 mL三角瓶中，各加入蒸餾水30 mL，用0.1 mol·L-1鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3.0，再加碘溶液0.5 mL，移入容量瓶并用蒸餾水定容至50 mL混勻。靜置15 min后，以KI-I2水溶液為空白對照，在直鏈淀粉的最大波長λ1和參比波長λ2下分別測定吸收值A(chǔ)λ1和Aλ2，即可得到雙波長下直鏈淀粉吸收度差值ΔA直= |Aλ1-Aλ2|。以直鏈淀粉質(zhì)量濃度(mg·L-1)為橫坐標(biāo)，ΔA直為縱坐標(biāo)，繪制雙波長測定直鏈淀粉的線性標(biāo)準(zhǔn)曲線。支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定參照直鏈淀粉。

1.2.3 樣品前處理 目前國家標(biāo)準(zhǔn)或者行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中并沒有對煙草淀粉組分進(jìn)行準(zhǔn)確測定的方法，所檢測到的文獻(xiàn)中大多數(shù)是小麥、水稻等禾本科作物，因此，參照禾本科作物的淀粉組分測定方法進(jìn)行前處理。前處理中主要借助索氏抽提器除去對淀粉組分測定有影響的其他物質(zhì)，相對來講方法簡便、快捷。

煙葉樣品干燥后用研磨器研磨，過100目篩，密封保存?zhèn)溆谩７Q取試樣(0.500 0±0.000 5) g于濾紙包中，記錄其總質(zhì)量M1(g)；可提前將濾紙包放入石油醚中浸泡過夜進(jìn)行預(yù)處理，后將樣品移入索氏抽提器提取管中，濾紙包高度不能超過虹吸管，以所有濾紙包可浸入提取劑為準(zhǔn)。連接好燒瓶、提取器、回流冷凝管，接通冷凝水，加熱。提取器中加入石油醚(沸程30～60 ℃)，于(45±1)℃水浴中回流萃取，控制回流速度100～150滴·min-1，6～8 h后，將濾紙包取出烘干；將石油醚換做丙酮，于(60±1)℃水浴中繼續(xù)加熱回流約3～5 h，結(jié)束后將濾紙包取出，烘干；低溫條件下將濾紙包放入80%乙醇-氯化鈉飽和溶液，超聲萃取20 min，重復(fù)超聲步驟至上清液無色，烘干后記錄濾紙包質(zhì)量M2。

1.2.4 淀粉含量測定 取處理后樣品0.100 0 g于燒杯中，加入1 mL無水乙醇助溶，后加入10 mL 0.5 mol·L-1KOH溶液，80 ℃水浴溶解10 min，用冰水迅速冷卻后移入容量瓶，加蒸餾水定容至50 mL，混勻。取上述溶液5 mL于100 mL三角瓶中，加蒸餾水30 mL左右，用0.1 mol·L-1鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至3.0～3.5，加0.5 mL碘試劑，移入容量瓶加蒸餾水定容至50 mL，混勻，靜置15 min后比色。

利用UV-2550紫外可見分光光度計(jì)測定樣品在634 和430 nm處的吸光值。0.100 0 g處理后樣品中直鏈淀粉含量M(mg)計(jì)算如下：

M=

未處理樣品中直鏈淀粉所占的比例W計(jì)算如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 雙波長法測定煙草淀粉組分含量的波長確定

根據(jù)雙波長分光光度法測定原理，采用作圖法選定測定波長(圖1)。配制30 mg·L-1直鏈淀粉與100 mg·L-1支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液，用紫外可見分光光度計(jì)對其進(jìn)行掃描，得到直鏈淀粉的最大吸收波長為634 nm，按照等吸收點(diǎn)作圖法確定測定直鏈淀粉含量的參比波長為430 nm。

2.2 雙波長法測定煙草直鏈淀粉的標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過測定不同質(zhì)量濃度直鏈淀粉在最大吸收波長和參比波長處的吸收差值可得到直鏈淀粉的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。直鏈淀粉的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.019 7x+0.007 2，R2=0.999 3。

2.3 雙波長法測定煙草淀粉組分含量的精密度評價(jià)

對同一樣品進(jìn)行直鏈淀粉含量的測定，重復(fù)5

次，計(jì)算平均值和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值(RSD)，結(jié)果如表1所示。表1結(jié)果表明，該方法適用于不同干燥方法處理的樣品，相對于殺青樣品和烤后樣品，凍干樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差更?。豢傮w重復(fù)性良好，可用于直鏈淀粉含量測定。

1.陰性對照1.Negative

圖2 直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 2 The standard curve of amylose

樣品Sample測定結(jié)果/(mg·L-1)Measurementresult平均值/(mg·L-1)Mean相對標(biāo)準(zhǔn)偏差/%Relativestandarddeviation凍干樣品Lyophilizedsample18.11318.26518.57018.21518.97618.4281.902殺青樣品Hightemperaturedesicca-tion16.69216.54015.98116.33716.94616.4992.212烤后樣品Sampleafterbaking4.0024.3064.0524.1544.3064.1643.382

2.4 淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液穩(wěn)定性檢測

配制30 mg·L-1的直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照樣品處理方法配制檢測溶液，同時(shí)加碘液，混勻，在最大吸收波長634 nm和參比波長430 nm處每隔5 min測定1次，檢測吸光值的穩(wěn)定性，結(jié)果見表2。由表2可知，直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液吸光度值在10～25 min內(nèi)基本穩(wěn)定；淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液較樣品處理溶液更為穩(wěn)定，測定中選擇加碘液后15 min更準(zhǔn)確。

2.5 淀粉樣品溶液加標(biāo)樣的回收率試驗(yàn)

隨機(jī)選擇3個(gè)煙草樣品中，分別添加一定量的直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液，按前述方法同時(shí)測定原樣品和添加了標(biāo)準(zhǔn)液的煙草樣品，計(jì)算回收率(表3)。回收率計(jì)算公式如下：回收率=[(測得的直鏈淀粉含量‐樣品中直鏈淀粉的含量)/直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液加入量]×100%。由表3可知，直鏈淀粉的平均回收率為103.71%。表明此方法測定的直鏈淀粉含量具有較高的準(zhǔn)確性。

表2 淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液不同時(shí)間的吸光度 Table 2 Absorbance of amylose standard solution and the sample solution at Different times

表3 煙草淀粉樣品回收率Table 3 Recovery rate of starch of tobacco samples

3 結(jié)論與討論

利用碘顯色法測定淀粉含量時(shí)，對淀粉含量有影響的因素主要是脂肪和糖類，煙草淀粉因其來源還有色素、醌類等[9-11]。前處理中通過石油醚和丙酮分別除去脂質(zhì)和色素；通過 80%乙醇-氯化鈉飽和溶液去除糖類和醌類等。提前浸泡處理減少抽提時(shí)間，提高效率；利用索氏脂肪提取器可減少試劑用量，一定程度上減少了能耗。脫糖處理參照煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[11]中連續(xù)流動(dòng)法測定淀粉含量的前處理，與85%乙醇加熱回流脫糖相比，樣品未經(jīng)過高溫環(huán)境，減少了淀粉糊化的可能，并且該處理進(jìn)一步除去煙草中含有的醌類。

通過對直鏈淀粉和支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液的全波長掃描確定，直鏈淀粉的最大吸收波長和參比波長分別為635 nm和433 nm，并制作直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線，表明直鏈淀粉在0～70 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2=0.999 3。同理可得到支鏈淀粉最大吸收波長和參比波長分別為545 nm和746 nm，理論上同樣可得到支鏈淀粉的標(biāo)準(zhǔn)曲線。但在實(shí)際試驗(yàn)過程中，所測得的支鏈淀粉含量數(shù)值太大，與理論值相差甚遠(yuǎn)，因此,不采用此種方法測定支鏈淀粉含量。分析原因可能有三：一是樣品處理的不夠完全徹底，殘余的雜質(zhì)對支鏈淀粉的影響更大；二是支鏈淀粉本身性質(zhì)的影響，直鏈淀粉與碘的親和力約為200 mg·g-1，而支鏈淀粉約為10 mg·g-1[12]，這也應(yīng)該是雖然支鏈淀粉含量高但加碘反應(yīng)后樣品溶液顯示藍(lán)色的原因；三是所用支鏈淀粉純品來自馬鈴薯，雖與煙草同屬茄科，但仍可能與煙草支鏈淀粉性質(zhì)相差較多，標(biāo)準(zhǔn)曲線不符合煙草樣品測定。此種方法雖未能測定支鏈淀粉含量，如若參照張峻松等[13]碘比色法測定淀粉總量的方法，可測定該前處理方法下的總淀粉含量，由總淀粉含量與直鏈淀粉的差值即可得支鏈淀粉含量。本試驗(yàn)旨在摸索淀粉組分測定的簡便方法，支鏈淀粉含量仍需進(jìn)一步探索。

目前關(guān)于煙草淀粉的研究較少，王文超等[7]的方法對葉片淀粉直接進(jìn)行提取，所需樣品質(zhì)量較大。試驗(yàn)中樣品經(jīng)過研磨、勻漿、過濾等過程，多次轉(zhuǎn)移，樣品總量和組分都可能損耗較大。本試驗(yàn)主要結(jié)合小麥等谷物類淀粉含量的測定，將對淀粉含量測定有影響的物質(zhì)去除，前處理過程中樣品始終在濾紙包中，減少試驗(yàn)操作產(chǎn)生的誤差。改進(jìn)后的前處理相較于王文超等[7]通過無水乙醇、丙酮、乙醚重復(fù)洗滌的方法更簡單，試劑用量少，未直接接觸樣品且可最大程度上除去對淀粉含量測定有影響的成分。提取煙葉中淀粉操作過程煩瑣，單次試驗(yàn)只能處理一個(gè)樣品，才能保證樣品之間無影響；改進(jìn)后的索氏提取器一次可處理多個(gè)樣品，且樣品之間互不影響，因此更適用于大批量測定?？偟膩碇v，改進(jìn)后的前處理方法更適用于凍干樣品。該前處理方法簡單，操作便捷，測定結(jié)果相對偏差小，回收率高，準(zhǔn)確可靠。

目前關(guān)于煙草淀粉組分的測定方法主要是利用雙波法，樣品的前處理是試驗(yàn)的關(guān)鍵，既要保證煙葉中淀粉性質(zhì)不發(fā)生變化，含量不降解，又要最大限度去除影響物質(zhì)。對淀粉組分含量測定不論采用哪種方法都要用到標(biāo)準(zhǔn)樣品作為參照，但是，由于物種來源不同，直鏈淀粉和支鏈淀粉的分子大小、聚合度、分支程度等存在差異，進(jìn)而造成不同來源的淀粉的紫外光譜波形相似，但最大吸收波長和最大吸收值存在差異，因此,要更加精確測定淀粉組分的含量，應(yīng)純化和分離煙草本身的淀粉，再進(jìn)行進(jìn)一步的探索。煙草淀粉含量的測定既要借鑒其他淀粉來源的測定方法，又要結(jié)合煙草淀粉來源的特殊性，在進(jìn)一步的試驗(yàn)中改進(jìn)和創(chuàng)新。

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(責(zé)任編輯：常思敏)

Improving the pretreatment of determination of the tobacco starch components by dual wavelength spectrophotometry

YANG Shengnan1, NIU Dexin1, ZHANG Hongying1, LIAN Wenli1, ZHANG Quan2, ZHANG Xiaoyang2, YANG Xinshi3, CUI Hong1

(1.College of Tobacco Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China； 2 .Qingzhou Cigarette Factory，China Tobacco Shandong Industial Co.,Ltd., Qingzhou 262500，China； 3.Shicheng County Tobacco Company of Jiangxi Province, Shicheng 341000, China)

To improve the pretreatment of determination of the tobacco starch components by dual wavelength spectrophotometry, we referenced the measurement methods of other crops and considered its specific source, and used Soxhlet extraction System to remove the fat, pigmentum, sugars and other substances that affect the determination of starch components, then determined the starch component content in the samples. The results showed that the relative standard deviation of the repeated test of the sample from the improved pretreatment is small and the stability of the sample solution is good. The recovery rate of added mylose was 103.71%. The improved pretreatment program is simple, and easy to operate, and the new method can be applied for analyzing plentiful samples due to its accuracy and rapidness.

tobacco; starch components；dual wavelength spectrophotometry; improved pretreatment

2016-05-13

中國煙草總公司特色優(yōu)質(zhì)煙葉開發(fā)重大專項(xiàng)(110200902045TS-01)

楊勝男(1991-)，女，河南洛陽人，碩士研究生，主要從事煙草生物技術(shù)研究。

崔 紅(1966-)，女，河南鄭州人，教授。

1000-2340(2017)01-0008-05

S 572

A