楊雨宇+高正蓮+喻詩(shī)洋+朱丹+李藝

摘 要：目的：用檸檬酸溶液腹腔注射法制作SD大鼠卵巢氧化應(yīng)激模型并分析其造模效果。方法 體重相近SD雌性成年大鼠45只，隨機(jī)分成四組模型組和空白對(duì)照組各9只，分別每隔3日用0.30 g/ml、0.60 g/ml、0.90g/ml、1.20g/ml的檸檬酸溶液和生理鹽水腹腔注射0.2ml一次，共注射6次。于第6次腹腔注射后第2天，取大鼠卵巢組織，進(jìn)行大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察、總超氧化物歧化酶（T-SOD）測(cè)定、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）測(cè)定。結(jié)果：模型組卵巢組織切片中可見(jiàn)大量閉鎖卵泡，生長(zhǎng)卵泡減少。并且隨著檸檬酸溶液濃度的升高，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶含量較空白對(duì)照組逐漸降低。結(jié)論：檸檬酸引起SD大鼠卵巢氧化應(yīng)激的發(fā)生，可以作為卵巢氧化應(yīng)激的動(dòng)物模型。

關(guān)鍵詞：大鼠；卵巢；氧化應(yīng)激；檸檬酸

中圖分類號(hào)：R-332 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-2064（2017）09-0196-02

Abstract：0bjective： The oxidative stress model of SD rat model was made by intraperitoneal injection of citric acid solution to analyze the effect of the model. Methods： Fourty-five adult female SD rats which were similar in weight were randomized equally into four ovarian oxidative stress model groups and a normal control group for intraperitoneal injections of 0.2ml 0.30 g/ml、0.60 g/ml、0.90g/ml、1.20g/ml citric acid solution and normal saline every three days， respectively， infected six times totally. After 6 injections，the rats were sacrificed for histological observation of the ovarian sections and superoxide dismutase（SOD） and glutathione peroxidase（GSH-Px） in the ovary homogenate.Results： Numerous atretic follicles were found in the ovaries of mice in the model group with obviously reduced growing follicle. And with the concentration of citric acid solution increasing， the concentration of SOD and GSH-PX of ovarian oxidative stress model groups in the ovary homogenate is lower than normal control group. Conclusion A rat model of ovarian oxidative stress can be established by intraperitoneal iniecfions of citric acid solution.

Key words：rat；ovary；oxidative stress；citric acid solution

氧化應(yīng)激（Oxidative Stress）是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，傾向于氧化，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞炎性浸潤(rùn)，蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物。氧化應(yīng)激是破壞了強(qiáng)氧化劑和抗氧化劑的平衡導(dǎo)致的潛在傷害，氧化劑、抗氧化劑平衡的破壞是細(xì)胞損傷的主要原因。氧化應(yīng)激是由自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負(fù)面作用，并被認(rèn)為是導(dǎo)致衰老和疾病的一個(gè)重要因素。事實(shí)上，人體幾乎所有的器官都很容易受到氧化應(yīng)激帶來(lái)的傷害，癥狀表現(xiàn)具有多樣性，如疲倦、全身無(wú)力、肌肉和關(guān)節(jié)痛、消化不良、焦慮、抑郁、皮膚瘙癢、頭痛，以及注意力難以集中和感染難以痊愈等。由氧化應(yīng)激水平升高誘發(fā)的最常見(jiàn)疾病有心臟病、癌癥、骨關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病以及神經(jīng)退化性問(wèn)題，如阿爾茲海默癥、帕金森病。其中就卵巢而言，氧化應(yīng)激不僅影響著卵子的生成、卵泡的發(fā)育、卵子的成熟、卵泡的閉鎖和排卵等，還能降低卵母細(xì)胞和胚胎的質(zhì)量以及影響早期胚胎的發(fā)育能力，這些都會(huì)使受精率、胚胎質(zhì)量、妊娠率顯著降低[1]。本課題將進(jìn)行大鼠卵巢氧化應(yīng)激模型建立方法的探究，希望能夠找到一種經(jīng)濟(jì)適用便捷的卵巢氧化應(yīng)激試劑進(jìn)行建模，為相關(guān)科學(xué)領(lǐng)域的研究提供建模方法，增加實(shí)驗(yàn)成功的幾率，減少資源的浪費(fèi)，為臨床研究相關(guān)機(jī)制提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

選用西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的健康雌性SD大鼠45只，鼠齡6～7周。

1.2 材料

檸檬酸購(gòu)自山東省中創(chuàng)檸檬生化有限公司。模型組總超氧化酶歧化酶（T-SOD）測(cè)試盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）測(cè)試盒、蛋白盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司。

1.3 方法

選擇健康的、體重相近的雌性SD大鼠45只，隨機(jī)分為A、B、C、D、E五組，其中A、B、C、D組為模型組，E組為對(duì)照組，每組9只，適應(yīng)性喂養(yǎng)7d。于第8天對(duì)A、B、C、D、E五組大鼠分別腹腔注射0.30g/ml、0.60 g/ml、0.90g/ml、1.20g/ml的檸檬酸溶液和生理鹽水0.2ml，之后每隔三天按照上述操作注射一次，共注射6次。于第6次注射后第二天用乙醚麻醉后取卵巢組織，進(jìn)行大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察、總超氧化物歧化酶（T-SOD）測(cè)定、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）測(cè)定。

1.4 觀察指標(biāo)和方法

（1）一般情況。在實(shí)驗(yàn)期間，觀察各小鼠飲食、活動(dòng)情況以精神狀況的變化。

（2）組織形態(tài)學(xué)觀察。第6次注射后第2天用乙醚麻醉后，立即解剖，取大鼠左側(cè)卵巢組織，立即置于4%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，4um厚度連續(xù)切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠卵巢組織學(xué)特點(diǎn)及差異。

（3）組織氧化應(yīng)激標(biāo)志物檢測(cè)。第6次注射后第2天用乙醚麻醉后，立即解剖，取大鼠右側(cè)卵巢組織，在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，準(zhǔn)確稱重，放入勻漿管中。按重量（g）：體積（ml）=1：9的比例加入9倍體積的0.86%的生理鹽水于勻漿管中，冰水浴條件下，用眼科小剪盡快剪碎組織塊，用內(nèi)切式勻漿機(jī)制備勻漿，10秒/次，間隙30秒，連續(xù)5次，制成10%的勻漿液。將制備好的10%勻漿液用普通離心機(jī)2000轉(zhuǎn)/分，離心15分鐘，取上清液，用總超氧化酶歧化酶（T-SOD）測(cè)試盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）測(cè)試盒按照試劑盒說(shuō)明測(cè)定卵巢組織勻漿中SOD、GSH-Px的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSSl7.0軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均值比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

在實(shí)驗(yàn)期間，各小鼠飲水、飲食正常，E組均未出現(xiàn)現(xiàn)反應(yīng)淡漠、異常興奮、少食少動(dòng)等異常表現(xiàn)，但A、B、C、D組不同程度地出現(xiàn)了煩躁不安，易怒多動(dòng)等異常表現(xiàn)。

2.2 組織形態(tài)學(xué)觀察

正常對(duì)照組小鼠卵巢形態(tài)規(guī)整，可見(jiàn)各級(jí)發(fā)育中卵泡。模型組卵巢皮質(zhì)變薄，間質(zhì)過(guò)度增生，出現(xiàn)大量原始卵泡，卵泡多呈囊性擴(kuò)張，內(nèi)含大量漿液性物質(zhì)，生長(zhǎng)卵泡數(shù)目較少，卵泡大量閉鎖，極少見(jiàn)黃體出現(xiàn)。

2.3 組織氧化應(yīng)激標(biāo)志物檢測(cè)

用檸檬酸溶液造摸后，引起卵巢組織勻漿中SOD、GSH-Px含量降低，且與正常對(duì)照組相比具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≤0.05，表1）。

3 討論

隨著生活節(jié)奏和社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)的日益加劇，人們的學(xué)習(xí)工作、日常生活都處于緊張的狀態(tài)。而這種過(guò)度的緊張和焦慮導(dǎo)致了現(xiàn)代女性的心理壓力愈來(lái)愈大，生殖系統(tǒng)疾病的發(fā)病率也相應(yīng)的增高了不少。其中由氧化應(yīng)激引起的人類女性生殖系統(tǒng)的疾病比較常見(jiàn)，如受精卵低植入率、低妊娠率、高流產(chǎn)率等[2]。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)氧化應(yīng)激模型的研究是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)之一，其中對(duì)肺、小腸、肝臟、心臟等器官和腸道上皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、ECFC細(xì)胞、黑素細(xì)胞、精子等都有了相關(guān)的研究。如研究不同濃度葡萄糖氧化酶（GO）對(duì)人肝細(xì)胞L02氧化應(yīng)激水平的影響，以確定建立肝細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的合適濃度[3]。而針對(duì)卵巢的氧化應(yīng)激研究較少。

本課題組查閱文獻(xiàn)未見(jiàn)有針對(duì)大鼠卵巢氧化應(yīng)激模型的研究，大鼠卵巢氧化應(yīng)激模型的建立具有如下優(yōu)點(diǎn)：1）小鼠卵巢較小，取材量極少，不適合多指標(biāo)研究，而大鼠卵巢較大，適合進(jìn)行多指標(biāo)研究；2）大鼠生存能力較強(qiáng)，能較好的耐受造模過(guò)程中的種種刺激，比較適合較強(qiáng)刺激性造模。

我們以常見(jiàn)的SD大鼠為研究對(duì)象，該鼠種適應(yīng)性強(qiáng)，體格健壯，對(duì)疾病的抵抗力強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果易觀察和記錄，具有代表性，總體費(fèi)用低，在醫(yī)學(xué)院校的實(shí)驗(yàn)室可完成，是復(fù)制病理模型較常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

本實(shí)驗(yàn)中，抗氧化酶類包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH—Px）等，SOD能夠?qū)⒊蹶庪x子（O2-·）分解成過(guò)氧化氫（H202）和氧分子（O2），中和（O2-·）等自由基，保護(hù)組織不受自由基損傷[4]。通過(guò)對(duì)SD大鼠腹腔注射不同濃度的檸檬酸，檢測(cè)SD大鼠卵巢組織勻漿中SOD活力，發(fā)現(xiàn)模型組SOD活力較對(duì)照組降低，且隨著檸檬酸濃度的增加，SOD活力逐漸降低。說(shuō)明模型組SD大鼠卵巢組織受到了氧化損傷，且隨著氧化劑濃度的增高，氧化損傷的程度越嚴(yán)重；產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物越多，所消耗SD大鼠體內(nèi)的SOD越多，檢測(cè)的SOD活力越低。

通過(guò)本建模實(shí)驗(yàn)可以得出，用檸檬酸建立SD大鼠卵巢氧化應(yīng)激模型，不僅可以引起卵巢組織形態(tài)的變化，還能引起SOD，GSH-PX等相關(guān)氧化標(biāo)記物的變化，而且在一定的氧化劑濃度范圍內(nèi)，隨著氧化劑濃度的增高，氧化應(yīng)激的效果越明顯。因此可以推測(cè)檸檬酸通過(guò)氧化應(yīng)激機(jī)制引起了SD大鼠卵巢組織和功能的變化，造成了氧化損傷，用檸檬酸建立SD大鼠卵巢氧化應(yīng)激模型的方法可取，可用于實(shí)驗(yàn)室造模等。

通過(guò)此次實(shí)驗(yàn)，我們嘗試找到了一種經(jīng)濟(jì)適用便捷的卵巢氧化應(yīng)激試劑進(jìn)行建模，為相關(guān)科學(xué)領(lǐng)域的研究提供了一種新的建模方法，該方法可增加實(shí)驗(yàn)成功的幾率，減少資源的浪費(fèi)，為臨床研究相關(guān)機(jī)制提供一定的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

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