文/高 楊 尚東洋

（黑龍江龍丹乳業(yè)科技股份有限公司）

高效液相色譜法測定嬰幼兒配方奶粉中葉黃素含量的探討

文/高 楊1尚東洋2

（黑龍江龍丹乳業(yè)科技股份有限公司）

提出并建立了一種快速測定嬰幼兒配方奶粉中葉黃素含量的高效液相色譜法。樣品處理后，經(jīng)C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）色譜柱分離，甲醇作為流動相，高效液相-紫外檢測器檢測，外標(biāo)法進(jìn)行定量。試驗(yàn)結(jié)果表明，C18色譜柱檢測葉黃素保留時(shí)間穩(wěn)定，分離效果良好，且峰型良好，能夠滿足檢測要求。該方法具有操作簡單、快速準(zhǔn)確、節(jié)省試劑、污染少等特點(diǎn)，具有較好的實(shí)用性。

葉黃素；高效液相色譜法；嬰幼兒配方奶粉

葉黃素系統(tǒng)名稱為3，3，-α，β-二羥基-胡蘿卜素，分子式為C40H56O2，相對分子質(zhì)量為568.88（按2007年國際相對原子質(zhì)量）。屬于類胡蘿卜素類色素，又名“植物黃體素”，是一種天然色素。葉黃素廣泛存在于自然界的植物體中，其中萬壽菊中含量最多。

葉黃素具有多種生物活性，富有營養(yǎng)而無副作用，因此用途非常廣泛，可應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥、煙草和禽類飼料等領(lǐng)域。大量醫(yī)學(xué)證據(jù)表明，葉黃素對視覺有保護(hù)作用，能夠預(yù)防白內(nèi)障、動脈硬化，并且有抗氧化、增強(qiáng)免疫力等功效，特別在預(yù)防癌變發(fā)生、延緩癌癥發(fā)展等方面發(fā)揮了重要作用，是目前國際上功能性食品成分研究中的熱點(diǎn)之一，具有廣闊的開發(fā)前景。

鑒于葉黃素獨(dú)特的生理功能，近年來，越來越多的乳品企業(yè)開展了將葉黃素添加到嬰幼兒配方奶粉中的相關(guān)研究工作，并取得了一定的成效。隨著添加葉黃素的嬰幼兒配方奶粉陸續(xù)上市，準(zhǔn)確、快速檢測產(chǎn)品中葉黃素的含量對嬰幼兒配方奶粉的質(zhì)量控制具有重要意義。

目前，關(guān)于葉黃素含量的檢測方法主要有紙層析法、薄層層析法、柱層析法、分光光度法、高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法等。其中，高效液相色譜法普及率高、分析速度快、準(zhǔn)確性高，是目前應(yīng)用最為廣泛，同時(shí)也是葉黃素含量測定最適用的檢測方法之一。

2016年8月31日，國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會發(fā)布了GB 5009.248-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中葉黃素的測定》，該標(biāo)準(zhǔn)代替了GB/T 23209-2008《奶粉中葉黃素的測定 液相色譜-紫外檢測法》。新發(fā)布的國標(biāo)和舊國標(biāo)相比，增加了對葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的校正要求、操作過程注意點(diǎn)，更改了提取溶劑等，方法更加嚴(yán)謹(jǐn)，提高了回收率，測定結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定，可以很好地控制產(chǎn)品質(zhì)量。但該方法操作步驟較為繁瑣費(fèi)時(shí)。筆者采用高效液相色譜-紫外檢測器，以甲醇作為流動相，采用最普遍使用的C18色譜柱進(jìn)行分離，操作簡單、快速準(zhǔn)確、節(jié)省試劑、減少污染、實(shí)用性強(qiáng)，可適用于嬰幼兒配方奶粉中葉黃素含量的快速測定。

1 儀器設(shè)備與試驗(yàn)方法

1.1 儀器、試劑與材料

1.1.1 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀（日本島津，型號為LC-20AT，配有紫外檢測器）；渦旋振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號為XW-80A）；分析天平（美國奧豪斯，型號為CAV214C，感量0.1 mg）；數(shù)控超聲波清洗器（昆明市超聲儀器有限公司，型號為KQ-700DE）；紫外可見分光光度計(jì)（日本島津，型號為UV2550）；氮吹濃縮裝置（天津奧特賽恩斯儀器有限公司，型號為WTN-2800D）；超純水儀（沃特爾，型號為WP-UPLH-20）；冷凍速離心機(jī)（鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，型號為TGL16M）；深冷冰柜（海爾醫(yī)療，型號為DW86L338）；移液器（DRAGON，1～5 mL）。

1.1.2 試劑材料

葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma，純度≥98.0%；正己烷，色譜純；無水乙醇，色譜純；甲醇，色譜純；二氯甲烷，色譜純；0.45 μm濾膜，有機(jī)系；試驗(yàn)用水為實(shí)驗(yàn)室自己制備。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

準(zhǔn)確稱取2.00 g（精確至0.01 g）均勻試樣于50 mL聚丙烯離心管中，加入20 mL約50 ℃的溫水，超聲20 min，使樣品充分溶解。

用移液管準(zhǔn)確移取處理好的均勻樣液1 mL于10 mL螺口試管中，加入1 mL無水乙醇，渦旋振蕩1 min混勻，再加入3 mL正己烷，避光渦旋振蕩提取3 min，4 500 r/min離心3 min，重復(fù)提取2 次，合并提取液，以10 mL水洗滌，4 500 r/min離心3 min分層，重復(fù)洗滌1 次，合并有機(jī)相，于室溫氮?dú)獯蹈桑约状紲u旋振蕩溶解殘?jiān)⒍ㄈ葜? mL。冷凍30 min，4 500 r/min離心3 min，取上清液過0.45 μm濾膜，供液相色譜測定。

1.2.2 液相條件

色譜柱：C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；

流動相：甲醇；

流速：1.0 mL/min；

檢測波長：445 nm；

進(jìn)樣體積：10 μL；

柱溫：30 ℃。

2 試驗(yàn)結(jié)果與注意事項(xiàng)

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（200 mg/L）：稱取標(biāo)樣0.001 g，用二氯甲烷溶解并定容至5 mL容量瓶，在-80 ℃冰箱中避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（8 mg/L）：吸取1 mL儲備液，用甲醇定容至25 mL容量瓶中，在-80 ℃冰箱中避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：根據(jù)靈敏度和使用需要，用甲醇稀釋成標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，濃度為0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg/L。此標(biāo)準(zhǔn)工作溶液需于分析前臨時(shí)配制。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

用葉黃素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對樣品進(jìn)行定量。在0.10～0.50 mg/L范圍內(nèi)，葉黃素線性范圍良好，線性回歸方程為Y=29330X+2993.6，相關(guān)系數(shù)為0.9989。測試溶液中被測組分濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。

2.2 加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

在不含葉黃素的空白樣品中，分別添加3 個(gè)不同梯度的葉黃素標(biāo)準(zhǔn)工作液，每個(gè)梯度做6 個(gè)平行樣，按照1.2的樣品處理方法進(jìn)行處理。結(jié)果見表1：加標(biāo)量為0.10～0.50 μg，其回收率為86.4%～95.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.20%～3.83%。

2.3 注意事項(xiàng)

2.3.1 由于葉黃素穩(wěn)定性差，對光敏感，所有試驗(yàn)操作應(yīng)在500 nm以下紫外光的黃色光源或紅色光源環(huán)境中進(jìn)行。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制后需要用紫外可見分光光度計(jì)校準(zhǔn)，得到準(zhǔn)確濃度。

圖1 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

3 結(jié)論

本文以GB 5009.248-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中葉黃素的測定》為基礎(chǔ)，對方法進(jìn)行了改進(jìn)，方法改進(jìn)后具有操作簡單、快速準(zhǔn)確、節(jié)省試劑、污染少等特點(diǎn)，具有較好的實(shí)用性。C

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高楊（1987-），女，助理工程師，從事乳品質(zhì)量管理工作。

2017-04-19）