邵尉，高德民

(山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南250355)

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【中藥與天然活性產(chǎn)物】

HPLC法同時(shí)測(cè)定有柄石韋中6種有效成分的含量

邵尉，高德民*

(山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南250355)

建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定有柄石韋中原兒茶酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、芒果苷以及蘆丁6個(gè)主要成分含量的方法。采用SinoChrom ODS-BP C18(4.6 mm × 150 mm，5 μm)色譜柱，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%磷酸(A)-乙腈(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm，柱溫25 ℃。結(jié)果表明，6種成分線性關(guān)系良好(R≥0.999 2，n=5)，且分離度較好，平均加樣回收率相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%。該方法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，為藥用植物有柄石韋的定量檢測(cè)和質(zhì)量控制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

有柄石韋；高效液相色譜法；成分；測(cè)定

有柄石韋(Pyrrosiapetiolosa(Christ) Ching)是中藥石韋的基源植物之一，為水龍骨科(Polypodiaceae)石韋屬(PyrrosiaMirbel)植物，其味甘、苦，性微寒，具有利尿通淋，清肺止咳，涼血止血等功效[1]，臨床上主要用于熱淋、血淋、石淋、小便不通、熱喘咳、尿血等癥[2]?，F(xiàn)代研究表明，有柄石韋中含有多酚、皂苷、多糖、揮發(fā)油等多種化學(xué)成分[3-5]。其中多酚是中藥石韋的主要活性成分，具有抗氧化、抗菌、抗癌等多種臨床藥用功效，對(duì)人類健康有著重要的作用[6-7]。在以往對(duì)中藥石韋的研究中，研究者大多數(shù)通過(guò)HPLC法測(cè)定指標(biāo)性成分分析中藥石韋的質(zhì)量，而指標(biāo)性成分大多只選擇綠原酸[8]。本文利用HPLC法對(duì)有柄石韋醇提取物中的原兒茶酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、芒果苷以及蘆丁6種化學(xué)成分進(jìn)行了含量測(cè)定，從而為有柄石韋的質(zhì)量控制以及后期更深入的開(kāi)發(fā)研究提供有效的數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-10AT高相液相色譜儀(日本島津公司)；N2000色譜工作站(浙大智達(dá)自動(dòng)化信息工程有限公司)；PS-40A超聲波清洗器(深圳超藝達(dá)科技有限公司)；HZT-A100電子天平(福建華志科學(xué)儀器有限公司)；DS-T300高速多功能打粉機(jī)(上海頂帥工貿(mào)有限公司)。

1.2 試藥

原兒茶酸(成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：151123)；綠原酸(成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-15041814)；香草酸(成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：151116)；咖啡酸(成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：151103)；芒果苷(成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-16040103)；蘆丁(成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-15091104)；以上標(biāo)準(zhǔn)品純度均大于98%。乙腈(美國(guó)天地公司)為色譜純；水(娃哈哈純凈水)；其余試劑均為分析純(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)。

所用藥材經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)高德民副教授鑒定為水龍骨科石韋屬植物有柄石韋，植物標(biāo)本保存于山東中醫(yī)藥大學(xué)標(biāo)本館(標(biāo)本號(hào)：樣品1 2014102701、樣品2 2014052712、樣品3 2014091202)，樣品信息見(jiàn)表 1。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用SinoChrom ODS-BP C18(4.6 mm × 150 mm，5 μm)色譜柱；以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的磷酸(A)-乙腈(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,梯度洗脫程序見(jiàn)表2；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm；柱溫25 ℃。

表2 流動(dòng)相A(0.1%磷酸)和B(乙腈)的線性梯度

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取原兒茶酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、芒果苷以及蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品適量，分別置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度線，搖勻，制成相應(yīng)的對(duì)照品溶液。各自取適量，混合，最終制成含原兒茶酸0.166 7 mg/mL、綠原酸0.024 6 mg/mL、香草酸0.017 1 mg/mL、咖啡酸0.029 6 mg/mL、芒果苷0.025 6 mg/mL、蘆丁0.057 4 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

將干燥的有柄石韋藥材粉碎，過(guò)40目篩，用石油醚浸泡過(guò)夜，晾干備用。精密稱取脫脂后的粉末5 g，置于具塞錐形瓶中，準(zhǔn)確加入50 mL 70%甲醇，稱定重量，超聲處理50 min，放冷，再次稱定重量，70%甲醇補(bǔ)足減少的重量，搖勻，靜置。取上清液，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，得供試品。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系

取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，加甲醇稀釋成5個(gè)不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，以對(duì)照品含有量為橫坐標(biāo)(X)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表 3，表明各成分在各自線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 6種成分的線性關(guān)系

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取2.2項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣20 μL，測(cè)定各個(gè)對(duì)照品的峰面積，結(jié)果顯示原兒茶酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、芒果苷以及蘆丁峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.04%、0.92%、1.02%、0.93%、0.89%、1.15%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取1號(hào)樣品6份，按照2.3項(xiàng)步驟制備6份供試液，依法測(cè)定。最終測(cè)得原兒茶酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、芒果苷以及蘆丁峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.98%、2.03%、1.02%、1.82%、0.92%、2.03%，結(jié)果表明儀器重復(fù)性較好。

2.4.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液1 d內(nèi)每隔4 h進(jìn)一次樣，最終測(cè)得原兒茶酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、芒果苷以及蘆丁峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.75%、1.04%、1.03%、1.12%、0.94%、1.06%，結(jié)果表明該方法具有良好的穩(wěn)定性。

2.4.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取1號(hào)樣品3份，按照2.3項(xiàng)制得供試液，精密加入原兒茶酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、芒果苷以及蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品適量，加甲醇定容至20 mL。在2.1項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 6種成分的加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.5 樣品測(cè)定

將混合對(duì)照品和供試品按照上述色譜條件進(jìn)行HPLC法測(cè)定，見(jiàn)圖1。利用線性回歸方程計(jì)算3個(gè)不同產(chǎn)地樣品中6種指標(biāo)成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

A 對(duì)照品;B 有柄石韋(陜西);C 有柄石韋(浙江);D 有柄石韋(河北)。圖1 HPLC色譜圖Fig.1 The chromatogram of HPLC

采集地點(diǎn)原兒茶酸綠原酸香草酸咖啡酸芒果苷蘆丁陜西漢中1．9165．0202．1160．1980．1920．707浙江溫州1．2069．0552．9290．6880．7691．593河北承德0．8623．3640．8470．1830．2140．467

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)了HPLC法同時(shí)對(duì)有柄石韋中原兒茶酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、芒果苷以及蘆丁6種化學(xué)成分含量的測(cè)定，同時(shí)又對(duì)3個(gè)不同產(chǎn)地的有柄石韋進(jìn)行了HPLC 法測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這3個(gè)不同產(chǎn)地的有柄石韋均符合《中國(guó)藥典》(2015版)[1]的標(biāo)準(zhǔn)(綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥0.2%)。其中樣品3(河北)中的6種化學(xué)成分含量均較另外兩個(gè)產(chǎn)地的含量低。樣品2(浙江)的綠原酸含量最高，每1 mg生藥中含綠原酸為9.055 μg(綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.905%)，并且，樣品2(浙江)中除原兒茶酸的含量低于樣品1(陜西)之外，其余5種化學(xué)成分含量均高于另外兩個(gè)產(chǎn)地樣品的含量。據(jù)此推測(cè)樣品2(浙江)的活性可能較另外兩個(gè)產(chǎn)地的樣品更好。

關(guān)于中藥石韋，《中國(guó)藥典》(2015版)只對(duì)綠原酸的含量做了具體要求，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有柄石韋中原兒茶酸、香草酸和蘆丁的含量也較高。近期研究發(fā)現(xiàn)，原兒茶酸不僅有降低心肌耗氧量、減慢心率等藥理作用，而且還有較好的體外抗氧化活性[9]；香草酸有較好的抗菌作用，體外顯示還有抗炎活性[10]；蘆丁可以降低毛細(xì)血管通透性和脆性，同時(shí)又具有抗炎，抗病毒、抗氧化等方面的作用[11]。目前對(duì)有柄石韋的研究指標(biāo)性成分大多只選擇綠原酸，而隨著對(duì)中藥質(zhì)量控制要求的日益嚴(yán)格，作者認(rèn)為多成分同時(shí)測(cè)定是必然趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)選擇原兒茶酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、芒果苷以及蘆丁6種化學(xué)成分作為指標(biāo)性成分進(jìn)行了研究，為藥用植物有柄石韋的定量檢測(cè)和質(zhì)量控制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2015年版一部[M]. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：90.

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Simultaneous determination of six active constituents in thePyrrosiapetiolosa(Christ) Ching by HPLC

SHAO Wei, GAO De-min*

(Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China)

∶A HPLC method for simultaneous determination of the contents of six main bioactive constituents (protocatechuic acid, chlorogenic acid, vanillic acid, caffeic acid, mangiferin, and rutin) in thePyrrosiapetiolosa(Christ) Ching was presented. The analysis was performed on SinoChrom ODS-BP C18(4.6 mm × 150 mm，5 μm)column. The six components were separated with gradient elution using mobile phase composed of 0.1% acetic acid (A)-acetonitrile (B) at a flow rate of 1.0 mL/min. The UV detection wavelength was set at 320 nm. The column temperature was kept at 25℃. Six ingredients showed good linear relationship (R≥0.999 2,n=5), with relative standard deviation values less than 5%. Results reveal that this method is rapid, simple, and accurate, to provide experimental foundation for the quantitative detection and quality control of MedicalPyrrosiapetiolosa(Christ) Ching.

∶Pyrrosiapetiolosa(Christ) Ching; HPLC; ingredient; determination

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.03.005

2016-11-28

邵尉(1992—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴庂Y源與質(zhì)量控制。

*通信作者，高德民。E-mail:gdm607@126.com

R284.1

A

1002-4026(2017)03-0021-05