古巧燕，史盛梅，張 軍，年媛媛，馮義朝

1.延安大學附屬醫(yī)院消化科，陜西 延安 716000； 2.西安交通大學第二附屬醫(yī)院消化內科

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Nesfatin-1對內臟高敏感大鼠內臟敏感性影響機制的研究

古巧燕1，史盛梅1，張 軍2，年媛媛2，馮義朝1

1.延安大學附屬醫(yī)院消化科，陜西 延安 716000； 2.西安交通大學第二附屬醫(yī)院消化內科

目的 研究Nesfatin-1對內臟高敏感大鼠血液、腦腸軸組織5-HT表達的影響，探討Nesfatin-1對內臟高敏感大鼠內臟敏感性影響的機制，為進一步明確內臟高敏感形成機制的研究提供思路。方法 將新生2 d齡雄性SD大鼠隨機分為健康對照組和模型組，模型組大鼠通過母嬰分離和醋酸灌腸相結合的方法制備內臟高敏感大鼠模型。模型驗證成功后，模型組分為干預對照組、低濃度干預組、中濃度干預組和高濃度干預組，應用IHC、ELISA、Western blotting方法檢測內臟高敏感模型大鼠血液、腦腸軸不同部位5-HT的表達，對實驗結果進行統(tǒng)計學分析。結果 (1)不同分組大鼠血清5-HT水平的ELISA檢測結果：健康對照組、干預對照組大鼠分別與低濃度組、中濃度組、高濃度組比較，大鼠血清5-HT水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(2)不同分組大鼠腦腸軸組織5-HT表達IHC檢測結果：健康對照組、干預對照組分別與低濃度組、中濃度組、高濃度組比較，結腸組織、脊髓組織、腦組織中5-HT陽性表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，Nesfatin-1不同濃度組大鼠腦腸軸5-HT陽性表達明顯高于健康對照組、干預對照組。(3)不同分組大鼠腦腸軸組織5-HT表達Western blotting檢測結果：健康對照組、干預對照組分別與低濃度組、中濃度組、高濃度組比較，結腸組織、脊髓組織、腦組織中5-HT表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論 Nesfatin-1通過中樞途徑干預內臟高敏感大鼠，發(fā)現(xiàn)Nesfatin-1可以上調內臟高敏感大鼠血液、腦腸軸不同部位5-HT水平，推測Nesfatin-1可能通過上調5-HT的水平影響中樞和外周5-HT信號通路，最終參與內臟高敏感的形成及調控。

Nesfatin-1；內臟敏感性； 大鼠

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一種最常見的功能性腸道疾病，臨床表現(xiàn)為持續(xù)或間歇加重的腹痛、腹脹、腹瀉、便秘等腸道功能紊亂的癥狀，同時又缺乏腸道生化學和形態(tài)學改變[1-2]。2006年首次發(fā)現(xiàn)Nesfatin-1[3]，它是一種新型的腦腸肽，參與機體攝食活動、體溫調控、意識活動、消化液分泌等多種復雜的生理病理活動[4-9]，我們前期研究[10]顯示,Nesfatin-1對內臟高敏感模型大鼠的內臟敏感性、結腸運動有影響，基于此，本研究通過建立內臟高敏感性大鼠模型，給予中樞途徑Nesfatin-1對內臟高敏感性大鼠進行干預，觀察干預后內臟高敏感性大鼠血液、腦腸軸組織5-HT水平的變化，探討Nesfatin-1影響內臟高敏感大鼠內臟敏感性的可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Nesfatin-1(上海吉爾生化有限公司，批號：P140508-SL262333)；大鼠5-HT ELISA檢測試劑盒(武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司，貨號：CEA808Ge；批號：L140908201)；羊抗兔二抗(英國Abcam公司，批號：GR101082-1)，工作濃度為1∶500。

1.2 實驗動物分組及藥物干預 選取實驗大鼠40只，其中內臟高敏感模型大鼠32只，健康大鼠8只，模型組大鼠通過母嬰分離醋酸灌腸相結合的方法制備內臟高敏感大鼠模型。模型大鼠隨機分為4組：干預對照組、低濃度組、中濃度組、高濃度組，每組8只大鼠；各組大鼠具體處理措施如下：健康對照組：大鼠不給予任何處理；干預對照組：大鼠給予側腦室注射生理鹽水0.5 μl 0.9%氯化鈉；低濃度組：大鼠給予側腦室注射0.5 μl 0.5 μmol/L的Nesfatin-1；中濃度組：大鼠給予側腦室注射0.5 μl 5 μmol/L的Nesfatin-1；高濃度組：大鼠給予側腦室注射0.5 μl 50 μmol/L的Nesfatin-1。

1.3 ELISA檢測 取實驗大鼠靜脈血2 ml，分離血漿，進行5-HT檢測。

1.4 Western blotting檢測 不同分組大鼠腦腸軸不同組織進行處理后，進行5-HT檢測。

1.5 制作切片及免疫組化檢測 實驗結束后處死大

鼠，結腸組織取材部位為降結腸，脊髓組織取材部位為腰骶段、脊髓背角、胸腰段，腦組織取材部位為大腦皮質、海馬、中縫核，組織制片后應用免疫組化方法檢測5-HT表達。采用半定量法分析染色結果：按照染色強度和陽性細胞百分比乘積進行評價。

2 結果

2.1 實驗大鼠血清5-HT水平的ELISA檢測結果 健康對照組、干預對照組大鼠分別與低濃度組、中濃度組、高濃度組比較，大鼠血清5-HT水平差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

組別只數(shù)5?HT健康對照組871．12±3．73干預對照組893．11±21．63#低濃度組8118．25±19．93##?中濃度組8146．14±22．64##??高濃度組8163．34±14．08##??

注：與健康對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與干預對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 實驗大鼠腦腸軸組織5-HT表達的IHC檢測結果 健康對照組、干預對照組分別與低濃度組、中濃度組、高濃度組比較，結腸組織、脊髓組織、腦組織中5-HT陽性表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Nesfatin-1不同濃度組大鼠腦腸軸5-HT陽性表達明顯高于健康對照組和干預對照組，且腦組織中5-HT陽性表達最顯著(見表2、圖1～3)。

2.3 實驗大鼠腦腸軸組織5-HT表達的Western blotting檢測結果 健康對照組、干預對照組分別與低濃度組、中濃度組、高濃度組比較，結腸組織、脊髓組織、腦組織中5-HT表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表3、圖4～6)。

組別只數(shù)結腸脊髓腦健康對照組82．96±0．912．50±0．783．88±1．39干預對照組83．58±1．21#2．96±0．75#4．92±1．25##低濃度組85．92±1．47##??3．63±1．09##?6．33±1．37##?中濃度組86．33±1．37##??4．29±1．19##??8．08±1．18##??高濃度組88．08±1．18##??5．96±1．19##??9．42±1．95##??

注：與健康對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與干預對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖1 不同分組大鼠結腸組織5-HT陽性表達(200×) A～B: 健康對照組； C～D： 干預對照組； E～F： 低濃度組； G～H： 中濃度組； I～J： 高濃度組

Fig 1 Expressions of 5-HT in colon in different groups (200×) A-B: healthy control group; C-D: intervention control group; E-F: low concentration intervention group; G-H: medium concentration intervention group; I-J: high concentration intervention group

圖2 不同分組大鼠脊髓組織5-HT陽性表達(200×) A～B: 健康對照組； C～D： 干預對照組； E～F： 低濃度組； G～H： 中濃度組； I～J： 高濃度組

Fig 2 Expressions of 5-HT in spinal cord in different groups (200×) A-B: healthy control group; C-D: intervention control group; E-F: low concentration intervention group; G-H: medium concentration intervention group; I-J: high concentration intervention group

圖3 不同分組大鼠腦組織5-HT陽性表達(200×) A～B: 健康對照組； C～D： 干預對照組； E～F： 低濃度組； G～H： 中濃度組； I～J： 高濃度組

Fig 3 Expressions of 5-HT in brain in different groups (200×) A-B: healthy control group; C-D: intervention control group; E-F: low concentration intervention group; G-H: medium concentration intervention group; I-J: high concentration intervention group

組別只數(shù)結腸脊髓腦健康對照組80．31±0．000．52±0．030．59±0．08干預對照組80．36±0．02#0．60±0．09#0．71±0．12#低濃度組80．45±0．12##?0．69±0．01##?0．81±0．08##?中濃度組80．52±0．00##??0．72±0．01##?0．93±0．04##??高濃度組60．64±0．06##??0．97±0．09##??1．17±0．04##??

注：與健康對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與干預對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖4 不同分組大鼠結腸組織5-HT表達情況;圖5 不同分組大鼠脊髓組織5-HT表達情況;圖6 不同分組大鼠腦組織5-HT表達情況

Fig 4 Expressions of 5-HT in colon in different groups; Fig 5 Expressions of 5-HT in spinal cord in different groups; Fig 6 Expressions of 5-HT in brain in different groups

3 討論

內臟高敏感是IBS的重要機制，但是其具體的形成機制仍不明確，本研究前期發(fā)現(xiàn)Nesfatin-1可以增加內臟高敏感模型大鼠的內臟敏感性和影響模型大鼠結腸快波、慢波、收縮波，提示Nesfatin-1與內臟敏感性有關[10]，可能參與IBS內臟高敏感的形成，我們仍需要進一步思考研究，Nesfatin-1對IBS內臟高敏感形成中的具體作用機制如何，怎樣通過干預Nesfatin-1可以有效調控內臟敏感性，進而控制IBS呢？

5-HT是一種重要的腦腸肽物質，參與機體復雜的神經內分泌免疫網絡系統(tǒng)的調控，通過激活相應的受體來調節(jié)腸道動力和腸道敏感性，同時在內臟敏感性疼痛產生、調控、傳遞、情緒調控及睡眠等生理病理活動中起著正反調控的重要作用；IBS患者體內血清、腸黏膜組織中5-HT水平有不同程度升高，眾多研究從不同角度證實了5-HT信號通路與IBS的發(fā)生、發(fā)展有密切關系[11-14]，5-HT曾被認為是內臟高敏感形成的啟動因子，5-HT合成、釋放、與相應受體結合及重攝取等信號轉導系統(tǒng)中任何環(huán)節(jié)的異常都可能導致胃腸道動力、分泌功能異常和內臟敏感性的變化，目前，許多5-HT受體及相關制劑已經很廣泛地應用到IBS的臨床治療和基礎研究。

一方面，我們基于前期研究結果即Nesfatin-1與內臟高敏感模型大鼠內臟敏感性及結腸動力有關；另一方面，基于許多研究結果顯示的Nesfatin-1、5-HT與內臟高敏感的相關性及三者之間各種復雜關系，我們這部分研究通過Nesfatin-1中樞途徑干預模型大鼠后，應用ELISA、IHC、Western blotting檢測方法，檢測內臟高敏感模型大鼠腦腸軸不同部位5-HT陽性表達情況，進一步探討Nesfatin-1參與內臟高敏感形成的可能機制。本實驗研究首先應用ELISA方法檢測各組大鼠血清中5-HT水平，健康對照組和干預對照組分別與不同濃度組大鼠進行比較，差異均有統(tǒng)計學意義。其次應用IHC方法檢測不同實驗分組大鼠腦腸軸不同部位組織5-HT陽性的表達情況，健康對照組、干預對照組分別與不同濃度組比較，結腸組織、脊髓組織、腦組織中5-HT陽性表達差異均有統(tǒng)計學意義，Nesfatin-1不同濃度組大鼠在結腸組織、脊髓組織、腦組織三個部位的表達均高于健康對照組、干預對照組。最后，應用Western blotting方法檢測實驗大鼠腦腸軸不同部位組織5-HT表達情況，健康對照組和干預對照組分別與不同濃度組比較，結腸組織、脊髓組織、腦組織中5-HT陽性表達差異也有統(tǒng)計學意義。由上可見，三種不同的檢測方法從不同的角度對比健康對照組、干預對照組與不同濃度組大鼠腦腸軸不同部位的5-HT表達的差異，結果均提示Nesfatin-1可以上調模型大鼠外周及中樞5-HT水平，不同方法的差異性不完全一致，有必要調整實驗條件進一步深入研究。

總之，Nesfatin-1能夠通過中樞途徑增加內臟高敏感模型大鼠的內臟敏感性，改變內臟高敏感大鼠結腸電生理指標，上調模型大鼠外周及中樞不同部位5-HT表達，高表達的5-HT可以作用于胃腸道5-HT受體，激活多種活性生物物質釋放，調控胃腸道運動和分泌功能，并將這種影響傳至中樞，同時高表達的5-HT還參與中樞對下行神經系統(tǒng)的調控；由此推測在內臟高敏感大鼠模型中Nesfatin-1可能通過上調5-HT的表達水平，進而影響中樞和外周5-HT信號通路，導致內臟高敏感模型大鼠的內臟敏感性增加，從而參與IBS內臟高敏感的形成及調控，可見Nesfatin-1的參與有可能是形成內臟高敏感的一個重要機制，而且Nesfatin-1參與內臟高敏感形成的機制是多靶點、多通路的，但是關于Nesfatin-1與IBS之間的研究剛剛開始，尤其是其與內臟高敏感的關系，故還需要進一步深入探討Nesfatin-1在內臟高敏感形成中的具體作用及影響5-HT信號通路的具體機制。深入研究這些可以為未來明確IBS發(fā)病機制，進一步闡明內臟高敏感機制及有效控制內臟高敏感，提高IBS的治療效果和預后提供新思路。

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(責任編輯：王全楚)

The effect of Nesfatin-1 on visceral sensitivity in visceral hypersensitivity rats

GU Qiaoyan1, SHI Shengmei1, ZHANG Jun2, NIAN Yuanyuan2, FENG Yichao1

1.Department of Gastroenterology, the Affiliated Hospital of Yan’an University, Yan’an 716000; 2.Department of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, China

Objective To study the effect of Nesfatin-1 on 5-HT expression and the mechanism of Nesfatin-1 on visceral sensitivity in visceral hypersensitivity rats, in order to provide the new ideas for clarifying the mechanism visceral hypersensitivity.Methods Two days male Spragne-Dawley rats were divided randomly into healthy control group and model group. The model group was induced to visceral hypersensitivity by maternal separation and acetic acid enema methods. After the model validation succeeded, the rats in model group were divided randomly into intervention control group, low concentration intervention group, medium concentration intervention group and high concentration intervention group. The expressions of 5-HT in blood and the brain gut axis were tested by immunohistochemistry (IHC), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and Western blotting methods, then the results were analyzed by statistical method.Results (1) The ELISA blood test results of 5-HT in different groups: compered with the healthy control group and the intervention control group respectively, the expression of serum 5-HT in the different concentration groups had statistical difference (P<0.05). (2) The IHC test results of 5-HT expression in different groups: the positive expression of 5-HT in the healthy control group and the intervention control group had statistical difference compared with the different concentration groups (P<0.05), the positive expression of 5-HT was significantly higher in different concentration groups than that in the healthy control group and the intervention control group. (3) The Western blotting test results of 5-HT expression in different groups: compared with the healthy control group and the intervention control group respectively, the expression of 5-HT in the different parts of the brain gut axis in different concentration groups had statistical difference (P<0.05).Conclusion The different concentrations of Nesfatin-1 interven the visceral hypersensitivity rats by the central route, Nesfatin-1 can up-regulate the level of 5-HT in the blood and the brain gut axis of model rats; Nesfatin-1 may affect 5-HT signaling pathways in the central and peripheral parts by increasing the level of 5-HT,finally involves in the formation and the regulation of visceral hypersensitivity.

Nesfatin-1; Visceral sensitivity; Rat

古巧燕，博士研究生，副主任醫(yī)師，研究方向：各種肝病、胃腸動力疾病的診斷與治療。E-mail：guyewuyue@163.com

張軍，博士，主任醫(yī)師，教授，研究方向：胃腸動力及食管疾病的診治。E-mail：jun3z@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.06.020

R574.4

A

1006-5709(2017)06-0704-05

2016-12-27