陳亞偉， 蘭 玲， 張恒輝， 周炳喜， 韓明陽， 謝 毅， 李 劍， 李景南， 張 莉， 于 靜

1.鄭州大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 鄭州 450003；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院傳染病研究所；3.鄭州大學(xué)人民醫(yī)院胃腸外科；4.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院普外科；5.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院消化內(nèi)科

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結(jié)直腸癌患者血漿游離DNA含量與臨床特征的相關(guān)性

陳亞偉1， 蘭 玲1， 張恒輝2， 周炳喜1， 韓明陽3， 謝 毅3， 李 劍4， 李景南5， 張 莉1， 于 靜1

1.鄭州大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 鄭州 450003；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院傳染病研究所；3.鄭州大學(xué)人民醫(yī)院胃腸外科；4.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院普外科；5.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院消化內(nèi)科

目的 探討結(jié)腸癌及其早期病變不同分期之間血漿游離DNA水平的差異及結(jié)直腸癌病變特性與血漿游離DNA水平的關(guān)系。方法 收集2016年5月-2016年10月鄭州大學(xué)人民醫(yī)院收治的結(jié)腸息肉、結(jié)腸癌、直腸癌患者血漿樣本共72例。采用磁珠法提取患者血漿游離DNA，采用Qubit 3.0熒光計(jì)定量血漿游離DNA的濃度，分析血漿游離DNA含量與患者臨床特征的相關(guān)性。結(jié)果 結(jié)腸癌患者血漿游離DNA(439.4±218.8)ng/ml水平顯著高于結(jié)腸息肉組(307.6±215.4)ng/ml(P<0.05)，也顯著高于直腸癌組(256.7±123.2)ng/ml(P<0.01)，結(jié)腸息肉患者血漿游離DNA水平與患者年齡、性別、息肉病理類型、數(shù)量、大小無顯著相關(guān)性，結(jié)直腸癌患者血漿游離DNA水平與患者年齡、性別、腫瘤分期、大體類型無顯著相關(guān)性，與腫瘤體積的對(duì)數(shù)呈正相關(guān)(r=0.477，P<0.01)。結(jié)論 血漿游離DNA水平可有助于診斷結(jié)腸癌，并可間接反映結(jié)直腸癌患者體內(nèi)的腫瘤負(fù)荷。

結(jié)腸息肉；結(jié)腸癌；直腸癌；游離DNA；腫瘤負(fù)荷

結(jié)直腸癌是發(fā)病率和病死率都極高的惡性腫瘤之一[1-3]，早期無明顯癥狀，多數(shù)患者診斷時(shí)已為中晚期，約20%的患者在初診時(shí)就已發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，5年生存率僅為11.7%[4]。內(nèi)鏡及內(nèi)鏡下活組織檢查是診斷結(jié)直腸癌的金標(biāo)準(zhǔn)，然而，內(nèi)鏡及組織活檢為有創(chuàng)侵入性檢查，患者依從性較差，為早期診斷帶來困難，因此，采用非侵入性診斷方法篩選出結(jié)直腸癌的高風(fēng)險(xiǎn)人群，繼而進(jìn)行有目的內(nèi)鏡精查是較為可行的診斷策略。游離DNA(cell free DNA，cfDNA)是一種無細(xì)胞狀態(tài)的胞外DNA，在腫瘤患者中，主要來源于腫瘤細(xì)胞的壞死或凋亡、微轉(zhuǎn)移灶或循環(huán)腫瘤細(xì)胞的裂解和增殖旺盛的腫瘤細(xì)胞所釋放[5]。健康人外周血也存在cfDNA，腫瘤患者的外周血cfDNA含量較健康人顯著性增高[6]。因其采集簡便、快速、無創(chuàng)，可以對(duì)腫瘤患者進(jìn)行實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，在腫瘤的診斷、預(yù)后中顯現(xiàn)出越來越重要的前景。本研究納入結(jié)腸息肉、結(jié)腸癌、直腸癌患者，分析結(jié)腸癌及其早期病變不同分期之間血漿cfDNA水平的差異及結(jié)腸息肉、結(jié)直腸癌病變特性與血漿cfDNA水平的關(guān)系，以期為血漿cfDNA 在結(jié)直腸癌的早期篩查、伴隨診斷中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016年5月-2016年10月鄭州大學(xué)人民醫(yī)院收治的結(jié)腸息肉、結(jié)腸癌、直腸癌患者腫瘤血漿樣本共72例。本研究通過河南省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有樣本均在患者簽署了根據(jù)赫爾辛基宣言的擬定的書面知情同意書后收集。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理組織學(xué)/細(xì)胞學(xué)檢查診斷為結(jié)腸息肉、結(jié)腸癌、直腸癌；(2)心、肝、腎等主要臟器功能正常；(3)近期無手術(shù)史；(4)自愿入組，簽署知情同意書，依從性好，配合隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有肝炎、肺炎、結(jié)腸炎、直腸炎等慢性炎癥；(2)患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡等免疫性疾??；(3)目前存在未控制的嚴(yán)重感染；(4)依從性差，或患有精神疾病。

1.2 方法

1.2.1 材料：EDTA抗凝管購自臻和(北京)科技有限公司。MagMAX游離DNA抽提試劑盒購自賽默飛世爾科技有限公司。Qubit dsDNA HS Assay Kit核酸定量分析試劑盒購自賽默飛世爾科技有限公司。Qubit 3.0熒光計(jì)購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.2.2 血漿的采集、處理與儲(chǔ)存：采集患者術(shù)前乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝血5～8 ml。外周血6 h內(nèi)離心，以3 000 r/min低速離心10 min，取上清于1.5 ml離心管中，以5 000 r/min高速離心2 min去除有形細(xì)胞的沾染，再取上清于一新的1.5 ml離心管中，-20 ℃保存待用。

1.2.3 游離DNA的提?。篗agMAX游離DNA抽提試劑盒購自賽默飛世爾科技有限公司，具體操作步驟參照試劑盒說明書。在1 ml血漿中加入1 250 μl游離DNA結(jié)合液和15 μl Dynal磁珠，震蕩10 min，使游離DNA與磁珠結(jié)合。磁力收集后分別用500 μl游離DNA洗滌液和500 μl 80%乙醇洗滌磁珠。待磁珠干燥后，加入50 μl游離DNA洗脫液，將磁珠上的游離DNA洗脫下來。待磁力收集，上清即為純化的游離DNA，將游離DNA轉(zhuǎn)入1.5 ml離心管中備用。

1.2.4 游離DNA的定量：游離DNA定量使用Qubit dsDNA HS Assay Kit核酸定量分析試劑盒，具體操作步驟參照試劑盒說明書。一個(gè)反應(yīng)的Qubit工作液由199 μl緩沖液和1 μl染料組成。分別取190 μl Qubit工作液至2個(gè)Qubit分析管中，分別加入10 μl標(biāo)準(zhǔn)品1和標(biāo)準(zhǔn)品2，震蕩混勻，室溫孵育2 min用于校正Qubit 3.0熒光計(jì)。游離DNA定量時(shí)在199 μl Qubit工作液中加入1 μl游離DNA，室溫孵育2 min，在Qubit 3.0熒光計(jì)上讀取游離DNA的濃度。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 本研究納入結(jié)腸息肉患者27例，結(jié)腸癌患者21例，直腸癌患者24例，共72例。男48例，年齡(56.0±12.8)歲；女24例，年齡(57.8±13.8)歲。結(jié)腸息肉按照病變性質(zhì)分類[7]，其中炎性/增生性息肉9例，非進(jìn)展期腺瘤8例，進(jìn)展期腺瘤10例，結(jié)直腸癌患者按UICC/AJCC第7版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期[8-9]，其中Ⅰ期6例、Ⅱ期21例、Ⅲ期17例、Ⅳ期1例。

2.2 結(jié)腸息肉、結(jié)直腸癌患者血漿游離DNA水平與臨床特征分析 結(jié)腸癌患者的血漿cfDNA濃度顯著高于結(jié)腸息肉患者(P<0.05)。炎性/增生性息肉、非進(jìn)展期腺瘤、進(jìn)展期腺瘤患者血漿cfDNA濃度組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)腸癌Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ期患者血漿cfDNA濃度組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)。結(jié)腸息肉患者年齡、性別、病理類型、數(shù)量、大小與血漿cfDNA水平組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

病變性質(zhì)例數(shù)cfDNA濃度P值結(jié)腸息肉27307．6±215．40．042△ 炎性/增生性息肉9263．1±177．00．57 非進(jìn)展期腺瘤8285．2±208．0 進(jìn)展期腺瘤10365．4±257．6結(jié)腸癌21439．4±218．8 Ⅰ～Ⅱ期12417．3±230．80．606 Ⅲ期9468．9±211．5

注：△：與結(jié)腸癌比較的P值。

指標(biāo)例數(shù)cfDNA濃度P值年齡(歲)0．316 <6018287．5±221．9 ≥609347．8±208．2性別0．714 男19317．7±235．0 女8283．5±171．2病理類型0．276 炎性/增生性息肉9263．1±177．0 管狀腺瘤13284．5±190．5 絨毛狀管狀腺瘤5447．6±315．1數(shù)量(個(gè))0．474 <311293．5±233．5 ≥316317．3±209．3大小(cm)0．98 <116286．5±192．2 ≥111338．2±251．8

結(jié)腸癌患者血漿cfDNA濃度顯著高于直腸癌組患者(P<0.05)，右半結(jié)腸癌患者cfDNA濃度與左半結(jié)腸癌組患者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)直腸癌患者年齡、性別、腫瘤分期、大體類型與血漿cfDNA水平組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表3)。血漿cfDNA水平與腫瘤TNM綜合分期無相關(guān)性，與腫瘤體積大小的對(duì)數(shù)呈正相關(guān)(r=0.474，P<0.01)(見圖1～2)。

指標(biāo)例數(shù)cfDNA濃度P值年齡(歲) <6023363．6±245．10．449 ≥6022319．4±126．7性別 男29350．4±222．40．702 女16326．8±139．0TNM分期 Ⅰ6336．0±47．70．878 Ⅱ21319．9±224．1 Ⅲ17366．7±199．6 Ⅳ1422部位 結(jié)腸21439．4±218．80．001△ 右半結(jié)腸11434．4±255．90．526? 左半結(jié)腸10445．0±183．3 直腸24256．7±123．2大體類型 潰瘍型37337．7±203．20．603 隆起型8362．0±165．1

注：△:與直腸比較的P值;*:與左半結(jié)腸比較的P值。

圖1 結(jié)直腸癌不同分期游離DNA濃度；圖2 結(jié)直腸癌游離DNA濃度與腫瘤體積相關(guān)性

Fig 1 The level of cfDNA in different stages of colorectal cancer; Fig 2 The correlation analysis between cfDNA and tumor volume in colorectal cancer

3 討論

隨著近年研究的深入，cfDNA因其具有無創(chuàng)方便、可反復(fù)取材等優(yōu)點(diǎn)，在腫瘤早期篩查與診斷中的地位越來越得到重視[10-11]，然而通過cfDNA水平的定量分析來評(píng)價(jià)罹患腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)仍存在爭議，許多研究認(rèn)為cfDNA水平具有腫瘤早期診斷價(jià)值[12]，也有研究提出cfDNA水平與患者年齡、性別、發(fā)生部位、腫瘤分化程度、TNM分期等均無相關(guān)性[13]。目前國內(nèi)外有關(guān)cfDNA水平對(duì)結(jié)直腸癌的診斷價(jià)值研究并不多，且大部分研究都是對(duì)結(jié)直腸癌患者與健康對(duì)照組進(jìn)行比較研究，缺乏結(jié)直腸癌及其早期良性病變各分期亞組的對(duì)照研究，而對(duì)結(jié)直腸癌及其早期良性病變相關(guān)臨床病理特征進(jìn)行系統(tǒng)性分析及亞組分析,對(duì)于確定cfDNA是否可以作為腫瘤的早期診斷指標(biāo)具有重要意義。

本研究致力于探討結(jié)腸癌及其早期病變不同分期之間血漿cfDNA水平的差異及結(jié)腸息肉、結(jié)直腸癌病變特性與血漿cfDNA水平的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從結(jié)腸早期病變到結(jié)腸癌中晚期，隨著病變的進(jìn)展，血漿cfDNA水平逐漸增高，且結(jié)腸癌cfDNA水平顯著高于結(jié)腸息肉患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？赡艿脑蚴?，隨著腫瘤的進(jìn)展，腫瘤組織局部血供不足，缺氧壞死、壞死或凋亡的腫瘤細(xì)胞被巨噬細(xì)胞吞噬，釋放出大量的DNA片段，從而顯著增加了cfDNA的濃度，提示cfDNA水平可有助于診斷結(jié)腸癌，有望作為無創(chuàng)的分子診斷方法用于結(jié)腸癌高危人群的篩查。

在對(duì)結(jié)腸息肉病變特性與臨床病理特征系統(tǒng)分析中發(fā)現(xiàn)，血漿cfDNA水平與患者年齡，性別，息肉病理類型、數(shù)量、大小均無相關(guān)性。對(duì)結(jié)直腸癌病變特性與臨床病理特征系統(tǒng)分析中發(fā)現(xiàn)，血漿cfDNA水平與患者年齡、性別、腫瘤分期、大體類型均無相關(guān)性，與腫瘤部位、體積相關(guān)。血漿cfDNA水平與腫瘤體積呈正相關(guān)，這與現(xiàn)有的一些研究結(jié)果一致[14]。我們推測(cè)這可能是體積大的腫瘤，其癌細(xì)胞壞死或凋亡釋放更多的DNA到外周血，從而使血漿cfDNA水平升高，提示血漿cfDNA的水平可間接反映患者體內(nèi)的腫瘤負(fù)荷。結(jié)腸癌患者血漿cfDNA水平顯著高于直腸癌患者，分析發(fā)現(xiàn)，本研究入組結(jié)腸癌患者腫瘤體積顯著大于直腸癌，也進(jìn)一步說明cfDNA水平可反映患者體內(nèi)的腫瘤負(fù)荷。同時(shí)結(jié)腸癌與直腸癌在生化學(xué)、基因?qū)W等方面存在明顯差異。

總之，血漿游離DNA水平在早期結(jié)腸良性病變到晚期結(jié)腸癌的不同時(shí)期中呈上升趨勢(shì)，可有助于診斷結(jié)腸癌，并可間接反映結(jié)直腸癌患者體內(nèi)的腫瘤負(fù)荷。同時(shí)cfDNA樣本采集無創(chuàng)，臨床依從性較好，可以對(duì)腫瘤患者進(jìn)行實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，我們擬下一步對(duì)結(jié)直腸病變cfDNA基因突變進(jìn)行分析，了解結(jié)直腸癌及其早期良性病變各分期亞組在基因水平的差異，以期進(jìn)一步為結(jié)直腸癌伴隨診斷的平臺(tái)搭建提供基礎(chǔ)。

[1]Zheng R, Zeng H, Zhang S, et al. National estimates of cancer prevalence in China, 2011 [J]. Cancer Lett, 2016, 370(1): 33-38.

[2]Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2016 [J]. CA Cancer J Clin, 2016, 66(1): 7-30.

[3]姜艷芳， 魏志， 孫自勤. 中國青年大腸癌發(fā)病趨勢(shì)分析[J]. 胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志， 2016， 25(9)： 982-987. Jiang YF, Wei Z, Sun ZQ. Analysis of the incidence trend of young-onset colorectal cancer in China [J]. Chin J Gastroenterol Hepatol, 2016, 25(9): 982-987.

[4]Brenner H, Kloor M, Pox CP. Colorectal cancer [J]. Lancet, 2014, 383(9927): 1490-1502.

[5]van der Vaart M, Pretorius PJ. The origin of circulating free DNA [J]. Clin Chem, 2007, 53(12): 2215.

[6]Anker P, Mulcahy H, Chen XQ, et al. Detection of circulating tumour DNA in the blood (plasma/serum) of cancer patients [J]. Cancer Metastasis Rev, 1999, 18(1): 65-73.

[7]Strum WB. Colorectal adenomas [J]. N Engl J Med, 2016, 374(11): 1065-1075.

[8]Benson AB, Venook AP, Bekaii-Saab T, et al. Colon cancer, version 3.2014 [J]. J Natl Compr Canc Netw, 2014, 12(7): 1028-1059.

[9]Benson AB 3rd, Venook AP, Bekaii-Saab T, et al. Rectal cancer, version 2.2015 [J]. J Natl Compr Canc Netw, 2015, 13(6): 719-728; quiz 728.

[10]Schwarzenbach H, Hoon DS, Pantel K. Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients [J]. Nat Rev Cancer, 2011, 11(6): 426-437.

[11]Crowley E, Di Nicolantonio F, Loupakis F, et al. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood [J]. Nat Rev Clin Oncol, 2013, 10(8): 472-484.

[12]Chen K, Zhang H, Zhang LN, et al. Value of circulating cell-free DNA in diagnosis of hepatocellular carcinoma [J]. World J Gastroenterol, 2013, 19(20): 3143-3149.

[13]Frattini M, Gallino G, Signoroni S, et al. Quantitative analysis of plasma DNA in colorectal cancer patients: a novel prognostic tool [J]. Ann N Y Acad Sci, 2006, 1075: 185-190.

[14]Diehl F, Li M, Dressman D, et al. Detection and quantification of mutations in the plasma of patients with colorectal tumors [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102(45): 16368-16373.

(責(zé)任編輯：陳香宇)

The correlation analysis between the concentration of plasma cell free DNA and clinical features in colorectal cancer

CHEN Yawei1, LAN Ling1, ZHANG Henghui2, ZHOU Bingxi1, HAN Mingyang3, XIE Yi3, LI Jian4, LI Jingnan5, ZHANG Li1, YU Jing1

1.Department of Gastroenterology, Zhengzhou University People’s Hospital, Zhengzhou 450003; 2.Institute of Infectious Diseases, Beijing Ditan Hospital, Capital Medical University; 3.Department of Gastrointestinal Surgery, Zhengzhou University People’s Hospital; 4.Department of General Surgery, the Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University (Henan Cancer Hospital); 5.Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, China

Objective To compare the difference of the concentration of plasma cell free DNA (cfDNA) of patients with different stages of colon cancer and early benign lesions, and to analyze the correlation between the concentration of cfDNA and clinical features in colorectal cancer. Methods A total of 72 cases of colonic polyps, colonic cancer and rectal cancer were enrolled in this study. The plasma samples of patients were collected and extracted. The concentration of cfDNA was detected by Qubit 3.0 fluorimeter. Results The concentration of cfDNA of patients with colon cancer (439.4±218.8) ng/ml was significant higher than the colonic polyps group (307.6±215.4) ng/ml (P<0.05), and also significant higher than the rectal cancer group (256.7±123.2) ng/ml (P<0.01). The concentration of cfDNA was positively correlated with the logarithm of tumor size in colorectal cancer (r=0.477,P<0.01). The concentration of cfDNA was not related with TNM stage, gross type of tumor, gender, and age in colorectal cancer patients. The concentration of cfDNA was not related with pathological pattern, size and quantity of the polyps, gender, and age in colon polyps patients. Conclusion The concentration of cfDNA can help in the diagnosis of colonic cancer, and is positively correlated with tumor burden in colorectal cancer.

Colonic polyps; Colonic cancer; Rectal cancer; Cell free DNA; Tumor burden

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.06.021

陳亞偉，碩士研究生，研究方向：消化道腫瘤發(fā)病機(jī)制。E-mail：cchenyawei@163.com

于靜，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：消化系統(tǒng)疾病診治。E-mail：yuj123@126.com；蘭玲，副主任醫(yī)師，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：消化道腫瘤發(fā)病機(jī)制。E-mail：lanling95@163.com

R735.3+5

A

1006-5709(2017)06-0709-04

2017-03-26