劉雯雯 方寧遠

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易普利姆瑪對Lewis肺癌小鼠體內PTHrP表達的影響及與癌細胞衰老的關系

劉雯雯 方寧遠

目的 建立Lewis肺癌小鼠模型，觀察Ipilimumab對荷瘤小鼠體內PTHrP及MCT1表達的影響并探討與癌細胞衰老的關系。方法 取C57BL/6小鼠共30只，建立Lewis肺癌小鼠模型，隨機分為對照組、低劑量處理組、高劑量處理組，每組10只。開始給藥，給藥劑量與方法：低濃度Ipilimumab處理組3 mg/kg，高濃度Ipilimumab處理組 5 mg/kg，共給藥5次，對照組給予等量生理鹽水。采用免疫組織化學法檢測3組中PTHrP、MCT1的表達。結果 3組動物細胞PTHrP蛋白的分泌及MCT1的陽性表達率高度一致，且隨Ipilimumab濃度的增高而增高，第3組表達水平較第2組和第1組明顯升高，有統計學意義(P<0.05)，第2組表達水平較第1組明顯升高，有統計學意義(P<0.05)。且2個指標陽性表達率均與細胞衰老相關基因βGal的表達呈顯著負相關性(P<0.05)。結論 Ipilimumab處理后的荷瘤小鼠通過上調PTHrP、MCT1的表達，延緩癌細胞的衰老，最終引起癌細胞侵襲或轉移。

肺癌；易普利姆瑪；甲狀旁腺激素相關蛋白；單羧酸轉運蛋白1；細胞衰老

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1052～1055)

Ipilimumab是1種單克隆抗體，是新型的T細胞增強劑及免疫系統激活劑。本研究主要采用免疫組化法對不同劑量Ipilimumab處理的3組動物細胞進行PTHrP、MCT1檢測，探討其在肺癌中表達的相關性及與癌細胞衰老的關系。

1 材料與方法

1.1 動物及細胞株

實驗動物為近交系C57BL/6小鼠，雄性，體質量16～18 g，清潔級，購于上海實驗動物中心，飼養(yǎng)于上海交通大學實驗動物中心，室溫20 ℃，濕度 (60%±5%)，飼料及墊料均經消毒處理。實驗前小鼠適應環(huán)境飼養(yǎng)1周。Lewis肺腺癌細胞株(LLC，為C57BL/6小鼠源性肺腺癌細胞)購自上海中科院細胞生物研究所。瘤細胞培養(yǎng)于高糖完全培養(yǎng)液中。Ipilimumab購于香港華特藥房，廠家百時美施貴寶公司。即用型快速免疫組化MaxVisionTM檢測試劑盒購于福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。細胞衰老β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色試劑盒購自北京碧云天公司。

1.2 實驗分組及動物腫瘤模型的建立

無菌條件下對2只C57BL/6小鼠進行右側腋下皮下注射細胞懸液0.2 ml(Lewis肺腺癌細胞株)，注意觀察小鼠生長狀況。接種10天后，脫頸處死Lewis肺癌小鼠，放入75%酒精浸泡消毒10min，在超凈臺上分離瘤體，用生理鹽水洗凈后剪碎，研磨，染色，計算活細胞數>95%，調整腫瘤細胞懸液濃度為1×107/m1瘤細胞，繼續(xù)皮下接種5只小鼠，每只接種0.2 ml，飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境，如此皮下接種2次后接種30只小鼠。皮下接種后14天，可以觸及皮下直徑約10 mm腫塊，隨機分為對照組、低劑量處理組、高劑量處理組，每組10只。開始給藥，給藥劑量與方法：低濃度Ipilimumab處理組3 mg/kg，高濃度Ipilimumab處理組5 mg/kg，共給藥5次，對照組給予等量生理鹽水。

1.3 PTHrP、MCT1、βGal的檢測

標本經固定、脫水、包埋、切片、染色，按即用型快速免疫組化MaxVisionTM試劑盒說明步驟操作檢測MCT1、PTHrP 表達。標本用PBS漂洗2次，室溫下固定，加入X-Gal染色液，調節(jié)pH為6.0，孵育48 h，鏡下觀察，陽性物質為藍色沉淀，采用Image.ProPlus圖文分析系統，隨機選取100個細胞，測定每個細胞中陽性著色面積與該細胞總面積的百分比，取其均值作為 SA-β-Gal 陽性表達結果。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 PTHrP、MCT1組織化學檢測結果

3組動物細胞PTHrP、MCT1的陽性表達趨勢一致，且隨Ipilimumab濃度增高而增強(表1)：第3組表達水平較第2組和第1組明顯升高，有統計學意義(P<0.05)；第2組表達水平較第1組明顯升高，有統計學意義(P<0.05)，且兩者陽性表達情況呈顯著正相關(相關系數0.486,雙側顯著性P=0.006<0.01)。

2.2 βGal組織化學檢測結果

βGal作為細胞衰老的常用指標，會隨著細胞的老化而表達增強。從蛋白水平檢測了βGal的變化，以驗證3組細胞的衰老情況，結果發(fā)現：與第1組相比，第2組和第3組細胞中兩種蛋白的表達水平明顯下降(P<0.05)，且第3組兩種蛋白的表達水平明顯低于第2組(P<0.05) (表2)。PTHrP、MCT1的陽性表達情況與βGal的陽性表達情況呈顯著負相關(P<0.01)。

表1 3組細胞 PTHrP、MCT1、βGal 表達情況

表2 細胞 PTHrP、MCT1、βGal 表達三組組間比較( LSD 檢測)

3 討論

易普利姆瑪(Ipilimumab)是1種細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(CTLA-4)的抑制劑，與CTLA-4特異性的結合，上調T淋巴細胞活化增殖[1]，滲入腫瘤中發(fā)揮抗癌作用。2011年美國食品藥品管理局年批準了Ipilimumab用于惡性黑色素瘤的免疫治療。臨床治療中，Ipilimumab單獨或聯合其他藥物在治療惡性黑色素瘤方面均取得了較好療效[2]，近年來Ipilimumab治療肺癌取得良好療效的研究也有報道[3]。Ipilimumab治療肺癌的推薦劑量也經歷了諸多實驗驗證[4]，在我們的實驗選取的處理劑量為3 mg·kg-1、5 mg·kg-1。Ipilimumab通過活化免疫系統殺傷腫瘤細胞，故不可避免地引起免疫相關性不良反應，近期研究[5]發(fā)現接收Ipilumumab治療的轉移性黑色素瘤患者可出現副腫瘤綜合征及惡病質相關，其機制不明。

細胞衰老是機體中常見生物學現象，是指細胞脫離細胞周期喪失增殖能力后進入的1種相對穩(wěn)定的狀態(tài)，是正常細胞的必然歸宿。研究表明腫瘤細胞具有衰老障礙而表現出無限增殖的能力，這也就是機體出現惡病質的原因。腫瘤細胞生長在1種缺氧的環(huán)境中，上調糖酵解和適應酸中毒是腫瘤由原位癌轉變?yōu)榍忠u性癌的關鍵因素。MCT1是單羧酸轉運泵家族(MCTs)家族中一員，主要存在于多種腫瘤細胞中，參與乳酸的跨膜轉運，加速腫瘤細胞的代謝，調節(jié)腫瘤細胞的凋亡。研究證實[6]晚期腫瘤可高表達MCT1，但對于肺癌的相關研究比較少。PTHrP作為1種分泌蛋白，可調節(jié)細胞生長周期，改變癌細胞的增殖率、調節(jié)凋亡傾向，改變腫瘤的侵襲、轉移[7]、影響肺癌癥患者的生存率[8]。

PTHrP、MCT1指標均可調節(jié)腫瘤細胞衰老逃逸，參與腫瘤細胞侵襲，Ipilumumab治療后病人也會出現惡病質狀態(tài)，那么Ipilumumab、PTHrP、MCT1 3者關系如何？該研究主要采用免疫組化法對3組經不同劑量Ipilumumab處理后的動物細胞進行PTHrP、MCT1檢測，探討其在肺癌中表達的相關性及與細胞衰老的關系。

細胞經歷DNA損傷、端粒功能下降、癌基因激活后首先出現細胞衰老，細胞衰老便成為抑制正常細胞發(fā)生惡性轉化的關鍵條件，這可對抗細胞的無限增生而對機體起到保護作用。細胞繞過衰老途徑是其永生化及癌變的必要條件。衰老逃逸參與腫瘤惡化、發(fā)展，并成為今后預測腫瘤侵襲轉移的因素之一。細胞衰老存在多種標志物，現在應用最廣、特異性比較高的為β-半乳糖苷酶[9]。之前研究表明腫瘤細胞在發(fā)生遠處轉移后可大量分泌PTHrP，而衰老相關指標β-Gal表達明顯下降，表明腫瘤細胞發(fā)生了衰老逃逸，那么PTHrP和腫瘤細胞衰老逃逸之間關系如何，PTHrP是通過什么途徑引起腫瘤細胞衰老逃逸的呢？PTHrP是一種分泌蛋白，在胎兒及成人的肺組織及肺癌組織中都有表達，在肺的發(fā)育、肺的生理功能、肺損傷及肺癌細胞的侵襲性上均有重要作用。研究表明PTHrP通過影響細胞生長周期而改變癌細胞的增殖率、調節(jié)凋亡、阻止腫瘤血管生成等，從而調節(jié)腫瘤的進展、腫瘤的侵襲、轉移、改變腫瘤對治療的敏感性，并在不同方面影響腫瘤的病理發(fā)生，影響肺癌患者的生存率。大多研究提示在肺癌中PTHrP的表達是1個有益的預后因子，如Hastings 等觀察兩株肺腺癌細胞株，轉染PTHrP 后肺癌細胞的DNA合成受抑制，肺癌細胞的增殖率下降，肺癌細胞的生長速度減慢。Yamada[10]和Bhatia[11]也分別在實驗中用抗PTHrP抗體治療腫瘤患者，均降低了骨轉移的發(fā)生率，并增加了腫瘤細胞的凋亡。但也有研究顯示PTHrP的過度表達可能與機體的惡病質狀態(tài)有關。早在 2000 年就有研究指出PTHrP 的表達與細胞的惡性轉化有關，PTHrP、P53可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中共同發(fā)揮作用。2012年王小虎等人的研究也指出胃腺癌組織高表達PTHrP，中低分化組織表達陽性率較高[12]。近期多項研究表明PTHrP能促進乳腺癌、前列腺癌、非小細胞肺癌的浸潤和轉移[13]，亦是骨溶解最重要的調節(jié)因子之一。 腫瘤細胞是生長在相對低氧的環(huán)境中，增加糖酵解、適應酸中毒是腫瘤由原位癌轉變?yōu)榍忠u性癌的必備條件。糖酵解越旺盛，腫瘤細胞生長越快、侵襲性越強，往往迅速復發(fā)，預后更差。MCT1表達予腫瘤細胞膜，負責將乳酸轉運出細胞，加速糖酵解過程，延緩腫瘤細胞衰老，增加腫瘤細胞侵襲。在我們的實驗中觀察到經高劑量Ipilumumab處理后的腫瘤細胞，β-Gal表達明顯下降，表明細胞衰老被抑制，腫瘤細胞大量繁殖，而這一過程有PTHrP分泌的逐漸增多，同時伴隨MCT1表達的明顯升高，且兩者升高具有顯著的正相關性。從中我們猜測高劑量Ipilumumab處理后的腫瘤細胞分泌大量PTHrP蛋白，通過MCT1途徑，提高腫瘤細胞的高代謝，促進腫瘤細胞的增殖、分化等，從而有效的抑制其衰老，最終從原位癌轉變成浸潤癌，使機體最終成為惡病質狀態(tài)。 在腫瘤高發(fā)的當今，免疫治療為晚期腫瘤患者帶來了新的希望，但免疫治療尚缺乏相應的分子標記來篩選最佳適用患者，同時,目前臨床研究發(fā)現免疫治療的近期毒性較小,但其遠期毒性仍未可知，如在我們的動物試驗中就發(fā)現Ipilumumab處理后腫瘤細胞處于衰老逃逸狀態(tài)，機體最終成為惡病質狀態(tài)。但我們的實驗有一定局限性，如樣本數量少，僅限于動物實驗。

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(編輯：吳小紅)

Effect of Lpilimumab on the Expression of PTHrP in Lewis Lung Cancer Mice and Its Relationship with the Aging of Cancer Cells

LIUWenwen，FANGNingyuan.RenjiHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine，Shanghai,200127

Objective To establish Lewis lung cancer mice model,and observe the effect of ipilimumab on PTHrP and MCT1 in tumor bearing mice and its relationship with cancer cell senescence.Methods A total of 30 Lewis mice which was established Lewis lung cancer mice model were divided into the control group,low dose treatment group and high dose treatment group,and each group with 10 cases.Start to give medicine,dosage and methods:low concentration ipilimumab treatment group 3mg/kg,high concentration ipilimumab treatment group 5mg/kg,a total of 5 times,the control group to give the same amount of normal saline.The expression of PTHrP and MCT1 in the 3 groups was detected by immunohistochemistry.Results The positive expression of PTHrP protein secretion and MCT1 in the 3 groups of animal cells rate highly consistent and tend to increase with the increasing of the concentration of ipilimumab,2 indicators in expression in group 3 than in group 2 and group 1 expression increased significantly,there had statistical difference (P<0.05);in group 2 expression than in the group 1 expression was significantly increased,there had statistical difference (P<0.05).And the positive expression rate of the 2 indicators were significantly negative correlated with the expression of cell senescence associated gene Gal,and the results were statistically significant (P<0.05).Conclusion Ipilimumab treatment of tumor bearing mice by up regulation of MCT1,PTHrP expression,delay the aging of cancer cells,and eventually cause cancer cell invasion or metastasis.

Lung cancer;Lpilimumab;PTHrP;Single carboxylic acid transporter 1;Cell senescence

200025 上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.07.003

R734.2

A

1001-5930(2017)07-1052-04

2016-08-19

2017-04-20)