李海玲++苗紅梅++張海洋++魏其超++段迎輝+汪學(xué)德

摘要：芝麻枯萎病是芝麻主要病害之一，由尖孢鐮刀菌芝麻?；颓秩疽?。為探明芝麻枯萎病菌產(chǎn)毒類型，試驗(yàn)采用高效乙酸乙酯萃取法，對(duì)尖孢鐮刀菌株HSFO07021菌液進(jìn)行了粗毒素提取；采用中壓制備色譜儀，首次成功分離了尖孢鐮刀菌芝麻?；?種主要毒素。結(jié)構(gòu)鑒定顯示，尖孢鐮刀菌芝麻?；偷?種毒素分別為鐮刀菌酸、9，10-脫氫鐮刀菌酸和10-羥基鐮刀菌酸。種子處理結(jié)果表明，尖孢鐮刀菌芝麻?；彤a(chǎn)生的鐮刀菌酸和9，10-脫氫鐮刀菌酸均能抑制芝麻幼苗的莖葉生長(zhǎng)和根部伸長(zhǎng)，對(duì)幼苗產(chǎn)生毒害；鐮刀菌酸的毒性強(qiáng)于9，10-脫氫鐮刀菌酸。

關(guān)鍵詞：芝麻；尖孢鐮刀菌芝麻?；?；鐮刀菌酸；9，10-脫氫鐮刀菌酸；分離

中圖分類號(hào)： S435.653文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）08-0082-05

芝麻為胡麻科胡麻屬植物，是世界上最古老的特色油料作物之一，也是我國(guó)重要的優(yōu)勢(shì)農(nóng)產(chǎn)品[1]。芝麻籽粒富含不飽和脂肪酸和維生素E[2-4]，并富含木酚素等多種生物活性物質(zhì)，對(duì)人體健康非常有益。但是在實(shí)際生產(chǎn)中，芝麻易受病害、漬澇等因素侵襲，產(chǎn)量與品質(zhì)均受影響。芝麻枯萎病是由尖孢鐮刀菌芝麻?；停‵usarium oxysporum f. sp. sesami，F(xiàn)OS）侵染引起的1種真菌病害[5-6]。研究表明，尖孢鐮刀菌在生長(zhǎng)代謝過程中能夠產(chǎn)生毒素（例如鐮刀菌酸），對(duì)寄主植物有強(qiáng)烈的毒害作用[7-8]。在香蕉枯萎病菌株培養(yǎng)液中，發(fā)現(xiàn)有鐮刀菌酸（FA）等多種毒素成分存在[8]，鐮刀菌酸可導(dǎo)致香蕉表現(xiàn)枯萎癥狀，而其他毒素成分則在致枯萎過程中起了增效作用，加速了植株枯萎。Wu等研究表明，尖孢鐮刀菌侵染時(shí)所產(chǎn)生的鐮刀菌酸能夠引起西瓜的氮素代謝紊亂；此外研究也顯示，枯萎病菌毒素是較為普遍存在的一類毒素，成分復(fù)雜，對(duì)農(nóng)作物生產(chǎn)和食品安全有重要影響[9]。Smith等從豬飼料、干玉米、高水分谷物、小麥、大麥中均不同程度地檢測(cè)出了鐮刀菌酸的存在[10]。近期研究表明，芝麻枯萎病菌亦能產(chǎn)生鐮刀菌毒素（統(tǒng)稱為FOS毒素），主要成分應(yīng)包括鐮刀菌酸（FA）以及FA-H2、FA+O和FA+O2等3種鐮刀菌酸類似物[11]。但是受毒素提取純化技術(shù)的限制，目前尚未獲得各毒素純品；芝麻枯萎病菌各主要毒素的特性如何尚不得而知。以往研究結(jié)果顯示，為獲得鐮刀菌毒素，人們多采用活性炭吸附法[12]、乙酸乙酯萃取法[13]從尖孢鐮刀菌濾液中提取。Bani等使用乙酸乙酯萃取法，提取了尖孢鐮刀菌粗毒素；隨后采用硅膠板+乙酸乙酯-甲醇-水（體積比為8.5 ∶2 ∶1）流動(dòng)相的分離條件，成功分離到了尖孢鐮刀菌酸[14]。為此，本研究主要探討芝麻枯萎病菌毒素主成分的制備和特性，首次獲得了FOS毒素3個(gè)主成分的純品，明確了毒素主成分對(duì)芝麻幼苗生長(zhǎng)的毒害特點(diǎn)，為下一步開展芝麻枯萎病菌致病機(jī)理和防控技術(shù)研究奠定了技術(shù)和材料基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1病原菌株及保存

選取尖孢鐮刀菌芝麻專化型菌株（編號(hào)：HSFO07021）開展毒素提取研究。菌株由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心病理室保存。

1.2儀器與試劑

毒素提取及分離用儀器設(shè)備主要包括：Waters 2695液相色譜儀（Waters公司，美國(guó)）、Waters LC150半制備液相色譜（Waters公司，美國(guó)）、液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀（UPLC-QTOF，xEVO G2，美國(guó)）、NICOLET 6700傅利葉紅外光譜儀（賽默飛世爾公司，美國(guó)）、500 MHz Bluke核磁共振儀（布魯克公司，德國(guó)）、離心機(jī)、分液漏斗、凍干機(jī)、真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、布氏漏斗、真空抽濾機(jī)等。鹽酸、乙酸乙酯等試劑均為分析純（國(guó)產(chǎn)）。乙腈（TEDIA，America）、乙酸（國(guó)產(chǎn)）均為高效液相色譜純度級(jí)別，水為純凈水級(jí)別。

1.3菌株培養(yǎng)

挑取HSFO07021菌株少量菌絲（-70 ℃保藏），接種在PDA平板培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)4 d。用無菌打孔器沿菌落邊緣打出直徑為8 mm菌片3～5個(gè)，接入裝有250 mL PD培養(yǎng)液的500 mL三角瓶?jī)?nèi)，28 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)4 d。用滅菌紗布濾除菌絲，收集孢子液，用無菌水將所得孢子液濃度調(diào)至107個(gè)/mL孢子，作為接菌母液。取1 mL接菌母液，加入100 mL理查德培養(yǎng)液中，28 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)，用于毒素提取試驗(yàn)。5 d取樣1次，用于檢測(cè)培養(yǎng)液FA含量，共計(jì)45 d。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g（煮熟過濾），葡萄糖20 g，瓊脂15 g，水1 000 mL。PD培養(yǎng)液：馬鈴薯150 g（煮熟過濾），葡萄糖20 g，水1 000 mL。理查德培養(yǎng)液：KNO3 10 g，KH2PO4 5 g，MgSO4·7H2O 2.5 g，F(xiàn)eCl3 0.02 g，蔗糖50 g，蒸餾水 1 000 mL。

1.4FOS濾液的HPLC檢測(cè)

取少量的HSFO07021菌株理查德培養(yǎng)液，2層鏡頭紙過濾，以濾除菌絲；經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾后進(jìn)行液相色譜分析。色譜柱選用sunfireC18反相柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A和B分別為乙腈、0.1%乙酸水溶液。梯度洗脫程序設(shè)置：0～12 min，A ∶B=5 ∶95；12～13 min，A相變化范圍為5%～27%，B相變化范圍為95%～73%；13～16 min，A ∶B=27 ∶73；16～17 min，A相變化范圍為27%～10%，B相變化范圍為73%～90%；17～22 min，A ∶B=10 ∶90；22～23 min，A相變化范圍為10%～5%，B相變化范圍為90%～95%；23～25 min，A ∶B=5 ∶95。流速為 1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

1.5FOS粗毒素提取

培養(yǎng)45 d后，取一定量的HSFO07021理查德培養(yǎng)液，用2層紗布過濾，以濾除菌絲；4 000 r/min條件下離心15 min，合并上清液，用于粗毒素提取。用2 mol/L鹽酸溶液調(diào)制上清液pH值至最佳條件。選用乙酸乙酯（A）與上清液（B）不同配比溶液進(jìn)行粗毒素提??；分別合并上層有機(jī)相和水相。真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)上層有機(jī)相，以去除乙酸乙酯，獲得FOS粗毒素。對(duì)水相進(jìn)行檢測(cè)，放于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6FOS毒素主成分的分離與純化

采用Waters LC150半制備液相色譜儀對(duì)FOS濾液進(jìn)行分離和純化。洗脫程序參照1.4 FOS濾液的HPLC檢測(cè)方法進(jìn)行。流速為10 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm；進(jìn)樣量為 500 μL，特定時(shí)間分別對(duì)提取物進(jìn)行收集。將收集到的不同物質(zhì)溶液分別合并，30 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，去除部分溶劑后真空凍干。將獲得的物質(zhì)分別做液質(zhì)、紅外和核磁共振氫譜分析，確定物質(zhì)結(jié)構(gòu)。

1.7FOS毒素主要成分對(duì)芝麻毒性分析

挑選豫芝11號(hào)芝麻種子各500粒，用清水沖洗種子表面5 min。3%次氯酸鈉浸泡種子10 min后，用無菌水沖洗種子3～4次；將消毒后的種子放入裝有10 mL無菌水的三角瓶中振蕩培養(yǎng)24 h。挑選露白的芝麻種子，分別接種在加有 5 μg/mL FA或9，10-脫氫FA的MS固體培養(yǎng)基上，25 ℃、光—暗周期14 h—10 h下培養(yǎng)。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種6粒種子，2周后調(diào)查芝麻幼苗及根生長(zhǎng)情況，拍照記錄。

2結(jié)果與分析

2.1尖孢鐮刀菌芝麻?；团囵B(yǎng)液毒素成分檢測(cè)

選取尖孢鐮刀菌芝麻?；虷SFO07021菌株，理查德培養(yǎng)液培養(yǎng)45 d，期間進(jìn)行孢子濃度檢測(cè)（圖1），并對(duì)菌液濾液進(jìn)行液相色譜分析（圖2）。結(jié)果顯示，在5～45 d培養(yǎng)過程中，理查德培養(yǎng)液中HSFO07021菌株的孢子數(shù)量在8×106～60×106個(gè)/mL范圍，孢子生長(zhǎng)量有一定的增長(zhǎng)；在25 d時(shí)，孢子濃度達(dá)到最大值。液相色譜分析表明，在保留時(shí)間分別是8.461、18.255、19.770 min時(shí)， 菌液中存在3種特異物質(zhì)，

分別命名為物質(zhì)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。物質(zhì)保留時(shí)間與朱強(qiáng)賓等報(bào)道的物質(zhì)Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ[11]較為一致。

2.2尖孢鐮刀菌芝麻?；投舅刂苽渑c鑒定

根據(jù)上述3種物質(zhì)的液相色譜峰位置，最終確定尖孢鐮刀菌芝麻?；投舅匚镔|(zhì)Ⅰ的收集時(shí)間為5.328～5.980 min（圖3-a）；物質(zhì)Ⅱ的收集時(shí)間是17.520～17.978 min，物質(zhì)Ⅲ的收集時(shí)間為18.321～18.860 min（圖3-b）。

將收集到的上述3種物質(zhì)溶液分別合并，30 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除部分溶劑后，真空凍干，獲得物質(zhì)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ純品。其中物質(zhì)Ⅰ為棕黃色黏稠狀液體，物質(zhì)Ⅱ?yàn)槲ⅫS色粉末，物質(zhì)Ⅲ為白色粉末。以FA標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，將獲得的3種物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

2.3毒素主要成分結(jié)構(gòu)分析

采用質(zhì)譜儀對(duì)獲得的粗毒素和各純化分離毒素成分進(jìn)行分析（表1）。結(jié)果顯示，物質(zhì)Ⅰ的質(zhì)核比值為196.097 3[M+H]+，218.079 0[M+Na]+；物質(zhì)Ⅱ的質(zhì)核比值為 178.086 8[M+H]+；物質(zhì)Ⅲ的質(zhì)核比值為180.102 4[M+H]+。3種物質(zhì)的摩爾質(zhì)量分別是195.097 3、177.086 8、179.094 6 g/mol，分子式分別為C10H13NO3、C10H11NO2和 C10H13NO2。

因物質(zhì)Ⅰ獲取量過少、純度較低，我們隨后對(duì)物質(zhì)Ⅱ、Ⅲ開展了傅立葉紅外光譜儀分析。對(duì)比結(jié)果顯示，F(xiàn)A標(biāo)品（圖4-a）在2 957.44、2 858.88、1 463.92 cm-1處有吸收峰，結(jié)構(gòu)中存在甲基；物質(zhì)Ⅱ（圖4-b）在3 079.22～3 004.55、1 639.28、1 535.71、1 309.45 cm-1處有特異的吸收峰，表明分子結(jié)構(gòu)中存在端基烯烴鍵。比較發(fā)現(xiàn)物質(zhì)Ⅲ（圖4-c）的峰位與FA完全一致，因此可以判定物質(zhì)Ⅲ與鐮刀菌酸標(biāo)準(zhǔn)品完全相同。

為確定上述3種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步進(jìn)行了核磁共振氫譜信息分析（圖5）。

與鐮刀菌酸標(biāo)準(zhǔn)品的核磁共振氫譜數(shù)據(jù)比對(duì)，確定物質(zhì)Ⅰ結(jié)構(gòu)為10-羥基鐮刀菌酸（10-OH-FA）。該物質(zhì)常溫下為黏液狀，可能與溶劑殘留較多有關(guān)。物質(zhì)Ⅱ結(jié)構(gòu)為9，10-脫氫FA，純度約98%。物質(zhì)Ⅲ核磁共振氫譜數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)品FA數(shù)據(jù)完全相同，再次確定該物質(zhì)為鐮刀菌酸FA，純度>98%。

根據(jù)上述結(jié)果，最終確定上述3種毒素主成分分別為鐮刀菌酸（FA）、9，10-脫氫鐮刀菌酸（9，10-脫氫FA）和10-羥基鐮刀菌酸（10-OH-FA）。結(jié)構(gòu)見圖6。

2.4FOS毒素主要成分的毒性分析

為判定FOS毒素主要成分對(duì)芝麻的毒害作用，采用HSFO7021菌液制備的FA和9，10-脫氫FA純品進(jìn)行了芝麻幼苗處理。由圖7可知，對(duì)照中芝麻幼苗處于1對(duì)真葉期，根生長(zhǎng)正常（圖7-a、圖7-d）。與對(duì)照相比，在5 μg/mL FA

和5 μg/mL 9，10-脫氫FA處理2周后，F(xiàn)A處理組植株真葉尚未展開，生長(zhǎng)遲緩（圖7-b、圖7-c）；9，10-脫氫FA處理組根伸長(zhǎng)緩慢（圖7-e）或尚未長(zhǎng)出（圖7-f）。結(jié)果表明，F(xiàn)A和9，10-脫氫FA毒素對(duì)芝麻有毒害作用；相對(duì)于FA，9，10-脫氫FA毒素處理對(duì)芝麻莖葉生長(zhǎng)和根伸長(zhǎng)的抑制程度弱。

3結(jié)論與討論

為評(píng)價(jià)尖孢鐮刀菌芝麻專化型產(chǎn)生毒素的種類和水平，本研究利用建立的高效乙酸乙酯萃取方法和分離方法，首次從HSFO7021菌液中制備出了鐮刀菌酸、9，10-脫氫鐮刀菌酸和10-羥基鐮刀菌酸等3種FOS毒素，研究結(jié)果為后續(xù)的芝麻枯萎病菌致病機(jī)理及芝麻抗病機(jī)理研究奠定了技術(shù)和材料基礎(chǔ)。在鐮刀菌毒素提取方面，目前主要選用活性炭吸附法[12，15]、活性炭吸附萃取法[16]和乙酸乙酯萃取法[13]進(jìn)行。Lffler等發(fā)現(xiàn)引起百合莖腐病的尖孢鐮刀菌可以產(chǎn)生鐮刀菌酸，并采用反相HPLC法和GC-MS法成功測(cè)定了粗毒素中鐮刀菌酸的含量[17]。Amalfitano等建立了鐮刀菌酸和脫氫鐮刀菌酸（FA-2H）及其甲酯化物的液相快速檢測(cè)方法[18]。在毒素分離方面，通用的方法為TLC（thin layer chromatography）法和柱色譜法[14]。但是由于該方法操作繁瑣，且物質(zhì)獲取量小、成功率低，毒素分離應(yīng)用受到限制。本研究借助于半制備液相色譜儀，結(jié)合液相檢測(cè)方法，最終確定用5%乙腈水溶液溶解粗毒素，以改進(jìn)液相分離方法，從而成功建立了FOS毒素制備及分離方法。與原洗脫程序相比，新方法在毒素分離方面節(jié)省了時(shí)間，且樣品分離效率得到顯著提高（數(shù)據(jù)未公開）。

鐮刀菌酸是一種非特異性真菌毒素，可以由許多鐮刀菌屬種類產(chǎn)生，可加速植物的枯萎。除鐮刀菌酸外，亦有學(xué)者從鐮刀菌的培養(yǎng)液中，發(fā)現(xiàn)了其他鐮刀菌酸類似物。Cappaso等首次從Fusarium nygamai菌株濾液中發(fā)現(xiàn)并分離出了FA和9，10-脫氫FA甲酯化物。處理后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A甲酯化物可導(dǎo)致番茄葉片變黃并迅速壞死，并能嚴(yán)重抑制根的生長(zhǎng)[19]。近期朱強(qiáng)賓等研究結(jié)果顯示，采用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)弱致病力菌株HSFO07021和強(qiáng)致病力菌株HSFO09100，不同菌株形成峰的數(shù)量有顯著差異[11]。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HSFO07021菌液有4種峰物質(zhì)存在。本研究從HSFO07021菌株的理查德培養(yǎng)液濾液中檢測(cè)到了10-羥基鐮刀菌酸（物質(zhì)Ⅰ）、9，10-脫氫鐮刀菌酸（物質(zhì)Ⅱ）和鐮刀菌酸（物質(zhì)Ⅲ）等3種主成分（圖2），純品收集時(shí)間分別為5.328～5.980 min、17.520～17.978 min和 18.321～18.860 min（圖2）。結(jié)構(gòu)檢測(cè)進(jìn)一步表明，以上3種物質(zhì)分別對(duì)應(yīng)了朱強(qiáng)賓等預(yù)測(cè)的物質(zhì)Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ[11]。研究首

次確定，尖孢鐮刀菌芝麻?；途戤a(chǎn)生的鐮刀菌酸和脫氫鐮刀菌酸2種毒素均對(duì)芝麻幼苗生長(zhǎng)發(fā)育有抑制作用，且毒害水平有一定差異（圖7）。Bani等通過葉片穿刺試驗(yàn)，證實(shí)了FA和9，10-脫氫FA對(duì)豌豆葉均表現(xiàn)出了高毒害活性[14]。Stipanovic開展了鐮刀菌酸、吡啶甲酸及其類似物對(duì)棉花子葉的生物測(cè)定試驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)鐮刀菌酸甲酯化物的毒性最高[20]。為明確芝麻枯萎病菌致病機(jī)理，下一步我們將深入開展FA及其類似物的毒害機(jī)理研究，以最終實(shí)現(xiàn)對(duì)芝麻枯萎病害的高效防控。

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