師仁麗++于文龍++梁娜+張群+王向紅

摘要：以靜態(tài)吸附與解吸率為指標，考察了6種大孔吸附樹脂對金絲小棗總黃酮的分離純化效果，從而篩選出1種效果最佳的大孔吸附樹脂。采用正交優(yōu)化的方法確定出純化金絲小棗總黃酮的工藝參數(shù)。確定AB-8樹脂對金絲小棗總黃酮的分離純化效果最好，其對金絲小棗總黃酮的吸附率可達88.57%，解吸率為99.71%。最佳工藝條件為上樣液pH值為3、吸附流速3 mL/min、上樣濃度0.35 mg/mL、洗脫劑為70%乙醇，此時總黃酮收率可達到9339%。同時，繪制了泄露曲線與解吸曲線，確定了最佳上樣體積與洗脫劑用量分別為40、70 mL。

關(guān)鍵詞：金絲小棗；黃酮；大孔吸附樹脂；純化

中圖分類號： R284.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）08-0172-04

棗（Ziziphus jujuba Mill.）是鼠李科（Rhamnaceae）棗屬植物的成熟果實，原產(chǎn)于中國，栽培已有4 000年的歷史[1]。紅棗營養(yǎng)價值高，且有很高的藥用價值，是營養(yǎng)和醫(yī)療保健的優(yōu)質(zhì)滋補果品，是很重要的食用材料和經(jīng)濟產(chǎn)品，享有“營養(yǎng)保健丸、木本糧食”的美譽[2]。由于其具有抗氧化、抗炎、抗癌、保護心肌等功能而被用作營養(yǎng)食品和傳統(tǒng)藥品[3]。金絲小棗廣泛分布在河北滄州一帶，果核細小、可食率達97%、含可溶性固形物40%～45%、制干率約55%、質(zhì)脆細嫩、品質(zhì)優(yōu)良等特點[4]。

黃酮類化合物是植物產(chǎn)生的一類次生代謝產(chǎn)物，是一類重要的天然化合物，對人體健康起著重要的作用。大量研究表明黃酮類物質(zhì)具有降血壓、降血脂、增大心臟血流量、增強心臟收縮、減少心臟搏動數(shù)、止咳祛痰、抗菌消炎的功效[5]。

在提取的粗黃酮中一般含有多種雜質(zhì)，如糖類、色素、蛋白質(zhì)、氨基酸等。為了提高黃酮純度，需要對粗提物進行進一步的分離純化，從而提高黃酮含量。目前，使用的黃酮類化合物純化方法很多，主要有柱層析、薄層層析、氣相層析、溶劑萃取、沉淀法等方法，在工業(yè)生產(chǎn)中均存在一定的缺點。大孔吸附樹脂純化法是目前使用最為廣泛的純化方法[6-7]。該技術(shù)具有生產(chǎn)成本低、周期短、效率高、可再生等優(yōu)點，所以在天然產(chǎn)物有效成分的分離技術(shù)中有較好的應(yīng)用發(fā)展趨勢。

本試驗選取6種在黃酮類化合物純化中應(yīng)用較為廣泛的大孔吸附樹脂，通過研究金絲小棗黃酮類化合物在不同樹脂上的靜態(tài)吸附、解吸效果，從而選擇出1種精制金絲小棗黃酮較理想的吸附樹脂，并采用正交優(yōu)化法對該樹脂的各種純化工藝參數(shù)進行研究，以期為金絲小棗黃酮的分離純化提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

金絲小棗，購自河北省滄州；蕓香苷對照品（≥99%），購自上海源葉生物科技有限公司；石油醚（60～90 ℃）、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、鹽酸，購自天津市天力試劑；AB-8樹脂、D-101樹脂、HPD-600樹脂、ADS-17樹脂、HPD-826樹脂、聚酰胺樹脂，購自滄州寶恩吸附材料科技有限公司；101-OAB電熱古鼓風干燥箱，購自天津市泰斯特儀器有限公司；UV-2008H型紫外可見風光光度計，購自上海UNIC公司；HT-300BQ型數(shù)控超聲提取器，購自天津市瑞普電子儀器公司；DZWK-C型恒溫水浴鍋，購自北京市光明醫(yī)療儀器廠；BS-214D型電子分析天平，購自Sartorius公司；TGL-16M快速離心機，購自浙江金壇市杰瑞爾電器有限公司；層析柱，購自華美儀器公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，購自上海亞榮生化儀器廠；真空恒流泵，購自上海滬粵明科學儀器有限公司；自動收集器，購自上海嘉鵬科技有限公司；FZG-4A型真空干燥箱，購自南京天利制藥設(shè)備有限公司。

1.2原料預(yù)處理

將金絲小棗洗凈烘干、去核、取1 g加10 mL石油醚（60～90 ℃），超聲（180 W，45 ℃）30 min，置于60 ℃水浴鍋中揮發(fā)干，加入20 mL 70%乙醇，超聲50 min，取上層清液，重復(fù)3次，最后合并清液，在3 500 r/min的離心條件下，離心 10 min，棄去沉淀，得到總黃酮粗提液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇，至無醇味，加入蒸餾水定容至500 mL得到樣品液。

1.3蕓香苷標準曲線的繪制

準確稱取干燥至恒質(zhì)量的蕓香苷標準品1 mg，置于 10 mL 容量瓶中，用95%乙醇溶解至刻度、搖勻、得到 1 mg/mL 的蕓香苷標準液。分別精密吸取標準液0、1.0、20、3.0、4.0、5.0 mL，置于5 mL容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度，加入5%NaNO2溶液0.5 mL。搖勻，靜置6 min；再加入10%Al（NO3）3溶液0.5 mL，混勻，靜置6 min；最后加入4%NaOH溶液4 mL，搖勻，放置10 min，以不加標準品的空白作參比，測定510 nm處吸光度（D），作3個平行，取平均值。以標準品濃度與吸光度作線性回歸，繪制蕓香苷標準曲線。

1.4測定樣品總黃酮含量

用標準曲線的方法測定樣品的吸光度，作3個平行，取平均值，根據(jù)線性回歸方程計算樣品中總黃酮濃度。

1.5黃酮純化工藝研究

1.5.1大孔樹脂的篩選

1.5.1.1大孔樹脂的預(yù)處理將6種大孔吸附樹脂（AB-8樹脂、D-101樹脂、HPD-600樹脂、ADS-17樹脂、HPD-826樹脂、聚酰胺樹脂）取適量，用95%乙醇浸泡24 h，使其充分溶脹，后用乙醇清洗，當流出液與水以1 ∶5的比例混合時，無渾濁出現(xiàn)為止，用蒸餾水洗至無醇味。之后用4%HCl溶液浸泡3 h后水洗至中性，再用2%NaOH浸泡3 h水洗至中性，最后浸泡于蒸餾水中備用。

1.5.1.2大孔樹脂飽和吸附量的測定準確稱取已處理好的樹脂2 g（濕質(zhì)量），至于200 mL具塞磨口三角瓶中，加入已知濃度的全棗黃酮溶液25 mL、100 r/min，在電動振蕩機上振蕩24 h，充分吸附后，抽濾，計算濾液中黃酮的質(zhì)量濃度，按下列公式計算各樹脂的飽和吸附量Q（mg/g）。

Q=（C0-C1）×V1m。（1）

式中：C0為樣品液起始濃度（mg/mL）；C1為濾液中黃酮濃度（mg/mL）；V為溶液體積（mL）；m為樹脂質(zhì)量（g）。

1.5.1.3大孔樹脂解吸率的測定取上述吸附飽和的大孔樹脂，用蒸餾水清洗至洗脫液無色，轉(zhuǎn)移至干凈的具塞磨口三角瓶中，加入70%的乙醇溶液50 mL，100 r/min，在電動振蕩機上振蕩24 h，抽濾，測定濾液中黃酮濃度，計算解吸率P（%）。

P（%）=C×V1Q×m×100。（2）

式中：C為解吸液中黃酮濃度（mg/mL）；V為解吸液體積（mL）；Q為飽和吸附量（mg/g）；m為樹脂質(zhì)量（g）。

1.5.2單因素試驗由上述試驗篩選出效果最佳的大孔吸附樹脂，進行上樣液pH值、流速、濃度、用量，解吸液濃度及用量的動態(tài)吸附與解吸試驗。取出層析柱（10×30 mm），將10 g預(yù)處理好的AB-8型樹脂采用濕法裝柱，使樹脂沿著玻璃棒緩慢倒入層析柱中，及時將產(chǎn)生的氣泡趕出，裝柱高度為10 cm。

1.5.2.1pH值對黃酮吸附的影響取6份已知濃度的全棗黃酮粗提液25 mL，分別調(diào)節(jié)其pH值為3、4、5、6、7、8，以 1 mL/min 的流速上柱吸附，分管收集流出液（5 mL/管），測定每管的黃酮濃度，從而計算到達吸附飽和時的流出液體積，并計算吸附量。

吸附量（mg）=上樣液濃度（mg/mL）×流出液體積（mL）。（3）

1.5.2.2上樣流速對黃酮吸附的影響取已知濃度的全棗黃酮粗提液（pH值=4），分別以1、2、3、4 mL/min的速度上柱吸附，利用自動收集器，分管收集流出液（5 mL/管），測定每管的黃酮濃度，從而計算到達吸附飽和時的流出液體積，按（3）式計算不同流速下的吸附量。

1.5.2.3上樣濃度對黃酮吸附的影響分別取4份濃度分別為0.05、0.15、0.25、0.35 mg/mL的樣品溶液（pH值=4），以2 mL/min的流速上樣，分管收集流出液（5 mL/管），測定每管的黃酮濃度，從而計算到達吸附飽和時的流出液體積，按（3）式計算不同流速下的吸附量。

1.5.2.4解吸液濃度的考察取一定量樣品黃酮粗提液（pH值=4，C=0.25 mg/mL），以2 mL/min的流速上柱吸附，做4組試驗，待吸附飽和后，用蒸餾水清洗樹脂，之后用 50 mL 濃度分別為30%、50%、70%、90%的乙醇以2 mL/min的流速進行洗脫，測得洗脫液黃酮濃度，計算黃酮含量。

黃酮含量（mg）=洗脫液黃酮濃度（mg/mL）×洗脫劑用量（mL）。（4）

1.5.2.5泄露曲線的繪制按上述已確定的吸附條件，取濃度為0.25 mg/mL的黃酮粗提液適量，pH值=4，以2 mL/min的流速上樣，分管收集流出液（5 mL/管），測定每管在510 nm處的吸光度，以吸光度為縱坐標，試管號為橫坐標，繪制泄露曲線，確定泄漏點。

1.5.2.6洗脫曲線的繪制取一定量全棗黃酮粗提液，按上述已確定的吸附及解吸條件，即樣液濃度為0.25 mg/mL、pH值=4，上樣流速為2 mL/min，待吸附飽和后，用70%乙醇洗脫，分管收集洗脫液（7 mL/管），測定洗脫液的吸光度，繪制解吸曲線，從而確定洗脫劑用量。

1.5.3正交試驗優(yōu)化純化工藝為確定金絲小棗總黃酮提取物的純化工藝，精確量取體積為40 mL的棗黃酮提取液，以上樣液pH值（A）、上樣流速（B）、上樣濃度（C）、洗脫劑濃度（D）4個因素作為試驗因子，以總黃酮收率為指標，進行4因素3水平的L9（34）正交試驗，因素水平見表1。

2結(jié)果與分析

2.1標準曲線測定結(jié)果分析

由圖1可以看出，蕓香苷標準曲線方程為y=13.629x-0.000 05，決定系數(shù)r2=0.999 62。結(jié)果表明，黃酮標準品的吸光度在0.0～0.7范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，因此在相同的條件下，由樣品的吸光度可計算出其相應(yīng)的黃酮濃度。

2.2大孔樹脂的篩選

通過對6種大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附與解吸試驗，得出每種樹脂的飽和吸附量和解吸率（表2）。

由表2可以看出，D-101樹脂的飽和吸附量最大，可達到0.87 mg/g，HPD-600樹脂和AB-8樹脂次之，分別為086、0.85 mg/g，但相差均不大。D-101和HPD-600樹脂的解吸率分別為81.51%、87.08%，均明顯小于AB-8樹脂的解吸率（99.71%）。綜合考慮，選擇AB-8型樹脂對金絲小棗黃酮提取液進行純化。

2.3單因素試驗結(jié)果與分析

2.3.1pH值對黃酮吸附影響的結(jié)果黃酮類化合物含有羥基，是弱酸性類物質(zhì)，適宜在酸性條件下進行吸附。所以根據(jù)被吸附物的結(jié)構(gòu)特點，調(diào)整粗提液的pH值可以達到較佳的吸附效果。由圖2可以看出，上樣液的pH值對大孔吸附樹脂的吸附效果影響較大，pH值在3～4時，吸附量逐漸增大；當黃酮粗提液的pH值=4時，樹脂對棗黃酮的吸附量最大；之后隨著pH的增加，樹脂的吸附量逐漸減小。因此確定4為最佳的吸附液pH值。

2.3.2上樣流速對黃酮吸附的影響由圖3可知，上樣流速對黃酮吸附量的影響，總黃酮的吸附率在一定范圍內(nèi)與上樣流速成反比，流速越大吸附率越小。但當流速過低時，雖然吸附率較大，但吸附時間過長。流速過快時，被吸附物質(zhì)來不及被樹脂吸附而泄露出去，降低樹脂的吸附率。流速為 1 mL/min 時，吸附率為77.89%；流速為2 mL/min時，吸附率為71.58%，兩者相差較小，綜合考慮，選擇2 mL/min為最佳吸附流速。

2.3.3上樣濃度對黃酮吸附的影響由圖4可知，在 0.05～0.25 mg/mL 的濃度范圍內(nèi)，總黃酮收率隨濃度的升高而增大，但0.25～0.35 mg/mL的濃度范圍內(nèi)總黃酮收率不再增大確，有略微降低的趨勢。推測認為，適當增加上樣濃度就增大了樹脂與被吸附物的接觸機會，樹脂的吸附作用增強，但濃度過高，導(dǎo)致樹脂的選擇吸附性降低，使總黃酮過早泄露。因此，選擇0.25 mg/mL為最適宜的上樣濃度。

2.3.4解吸液濃度對黃酮含量的影響由圖5可知，選擇不同濃度的含水乙醇作為解吸液，30%～70%濃度的乙醇對總黃酮的洗脫效果逐漸增強，大于70%的乙醇的洗脫效果下降。因此，選擇70%作為最佳解吸液濃度。

2.3.5泄露曲線的繪制在動態(tài)吸附過程中，提取液首先與樹脂上層接觸，達到飽和狀態(tài)，隨后這種狀態(tài)逐漸向下推移，當所有樹脂吸附飽和時，停止吸附，提取液開始泄露。由圖6可知，總黃酮從第8管開始泄露，此時上柱液體積為 40 mL，所以選擇40 mL為最佳上柱液體積。

2.3.6洗脫曲線的繪制由圖7可知，洗脫液用量在3號試

管之前，隨洗脫液用量增加，流出液中黃酮的質(zhì)量濃度不斷增加；洗脫液用量繼續(xù)增大，流出液中黃酮的質(zhì)量濃度逐漸減小。在第10管時，黃酮質(zhì)量濃度基本無變化，此時洗脫液用量為70 mL。因此，確定洗脫液最佳體積為70 mL。

2.4正交試驗優(yōu)化純化工藝結(jié)果

由表3可以看出，各因素對黃酮動態(tài)吸附率的影響程度依次為D>B>A>C，且最佳組合為A1B3C2D1，即最佳吸附條件為pH值=3，流速為3 mL/min，洗脫劑濃度70%，上樣濃度0.35 mg/mL，而該試驗組在正交試驗中未涉及，所以要經(jīng)過驗證試驗，其吸附率可以達到93.39%，高于以上試驗組合。

3結(jié)論

通過靜態(tài)吸附試驗發(fā)現(xiàn)AB-8樹脂在6種常用的純化黃酮類化合物的大孔吸附樹脂中對金絲小棗黃酮化合物的吸附與解吸性能較好，吸附率為88.57%，解吸率為99.71%。通過正交優(yōu)化試驗繼續(xù)考察了AB-8樹脂的動態(tài)吸附與解吸條件，最佳工藝條件為上樣液pH值=3，吸附流速為 3 mL/min，上樣濃度為0.35 mg/mL，洗脫劑為70%乙醇，總黃酮收率可達到93.39%，同時測定了最佳上樣體積與洗脫劑體積分別為40、70 mL。

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