朱曉彤 張圣潔 梁雪 李廣平

300211 天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心臟科 天津市心血管病離子與分子機(jī)能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津心臟病學(xué)研究所

·基礎(chǔ)研究·

MicroRNA-21及其靶基因程序性細(xì)胞死亡因子4在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用

朱曉彤 張圣潔 梁雪 李廣平

300211 天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心臟科 天津市心血管病離子與分子機(jī)能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津心臟病學(xué)研究所

目的 探討microRNA(miR)-21及其靶基因程序性細(xì)胞死亡因子4(PDCD4)在動(dòng)脈粥樣硬化(AS)發(fā)生發(fā)展中的作用。方法 收集38例急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)患者及34例非冠心病患者的血漿，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-21的表達(dá)水平。在Lipo3 000的介導(dǎo)下，將miR-21類似物、抑制劑及沉默PDCD4(siPDCD4)分別轉(zhuǎn)染鼠巨噬細(xì)胞系RAW 264.7細(xì)胞，并用氧化修飾低密度脂蛋白(ox-LDL)與細(xì)胞共同孵育，設(shè)立空白對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染且未加ox-LDL)及ox-LDL組(僅加ox-LDL)。采用油紅O染色檢測(cè)細(xì)胞泡沫化程度，實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot分別檢測(cè)泡沫細(xì)胞中miR-21及PDCD4蛋白水平。此外，建立ApoE-/-小鼠AS模型20只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：?jiǎn)渭兏咧桂B(yǎng)組6只、過(guò)表達(dá)miR-21組7只及陰性對(duì)照組(NC，7只)，鼠尾靜脈注射膽固醇包裹的miR-21激動(dòng)劑(agomiR-21)及陰性對(duì)照agomiR-NC分別建立過(guò)表達(dá)miR-21組及NC組。選用正常飼料喂養(yǎng)的C57BL/6小鼠作為正常對(duì)照組。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-21在AS斑塊及正常動(dòng)脈組織中的表達(dá)；Western blot及免疫組化分別檢測(cè)PDCD4蛋白水平。結(jié)果 與相應(yīng)的對(duì)照組比較，miR-21在STEMI患者血漿、泡沫細(xì)胞及單純高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠斑塊組織中的表達(dá)水平均明顯升高(P<0.001；P<0.01；P<0.01)；泡沫細(xì)胞及單純高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠斑塊內(nèi)PDCD4蛋白水平明顯增多；與ox-LDL組比較，ox-LDL+miR-21類似物組及ox-LDL+siPDCD4組巨噬細(xì)胞泡沫化程度明顯下降，ox-LDL+miR-21抑制劑組細(xì)胞泡沫化程度明顯增加。過(guò)表達(dá)miR-21組AS斑塊內(nèi)PDCD4蛋白水平較NC組明顯減少，且斑塊較NC組明顯減小。結(jié)論 miR-21在急性STEMI患者血漿中、泡沫細(xì)胞及AS斑塊內(nèi)的水平明顯升高。過(guò)表達(dá)miR-21及沉默PDCD4可抑制巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，這與動(dòng)物組織實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，表明miR-21或可靶向調(diào)控PDCD4的表達(dá)，從而發(fā)揮抗AS的作用。

microRNA-21； 程序性細(xì)胞死亡因子4； 動(dòng)脈粥樣硬化； 急性ST段抬高型心肌梗死； 泡沫細(xì)胞

MicroRNAs(miRs)是一類長(zhǎng)22個(gè)核苷酸左右的非編碼RNA小分子，參與多種生理和病理機(jī)制發(fā)生，包括炎癥和心血管疾病[1]。其中，miR-21在血管平滑肌細(xì)胞的增殖、凋亡，心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)、死亡以及心肌成纖維細(xì)胞的功能中均發(fā)揮重要作用。研究表明，miR-21在缺血性細(xì)胞死亡及心肌梗死中的保護(hù)性作用是通過(guò)其靶基因程序性細(xì)胞死亡因子4(programmed cell death 4，PDCD4)及其下游激活蛋白1(activating protein 1，AP-1)實(shí)現(xiàn)的[2]。PDCD4是新確定的一種抑癌基因，目前認(rèn)為PDCD4的缺失可促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞自噬介導(dǎo)的脂質(zhì)降解，阻止巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞，并可減少ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)斑塊中的脂質(zhì)沉積，進(jìn)而減緩AS斑塊的形成[3]。然而，miR-21及其靶基因PDCD4在AS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用尚存在爭(zhēng)論。本研究通過(guò)分析急性ST段抬高型心肌梗死(ST-segment elevation myocardial infarction，STEMI)患者血漿中的含量，初步闡明miR-21水平與STEMI的關(guān)系，并通過(guò)體外細(xì)胞及動(dòng)物組織模型，證實(shí)miR-21與PDCD4及二者之間的關(guān)系在AS中的作用。

1 材料與方法

1.1 患者入選及樣本采集

收集于天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院住院的STEMI患者38例，并收集同期住院的非冠心病患者34例作為對(duì)照組，所有患者均行冠狀動(dòng)脈造影檢查。排除惡性腫瘤、血栓栓塞、進(jìn)展中的肝臟疾病、腎功能衰竭、瓣膜性心臟病、擴(kuò)張型心肌病及其他炎性疾病等。收集所有入選對(duì)象的臨床病例資料，血漿樣本于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及泡沫細(xì)胞誘導(dǎo)

將小鼠巨噬細(xì)胞系RAW 264.7細(xì)胞(ATCC，美國(guó))于轉(zhuǎn)染前1 d鋪至6孔板中，加入完全培養(yǎng)基，按Lipo3000(Invitrogen，美國(guó))說(shuō)明書進(jìn)行miR-21類似物/抑制劑及siPDCD4的轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)6 h后，加入終濃度為50 μg/ml的氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞提取RNA及蛋白，并采用油紅O染色液試劑盒(北京雷根)按說(shuō)明書對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。

1.3 AS小鼠模型建立及取材

4～6周齡的雄性ApoE-/-小鼠共20只，給予高脂飼料喂養(yǎng)20周，建立AS模型，按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：?jiǎn)渭兏咧桂B(yǎng)組6只、過(guò)表達(dá)miR-21組7只及陰性對(duì)照組(negative control，NC)7只，膽固醇包裹的miR-21激動(dòng)劑(miR-21 agonist，agomiR-21)及陰性對(duì)照agomiR-NC凍干粉(廣州銳博)溶入PBS配成混懸液，單次注射劑量為10 nmol，于單純高脂喂養(yǎng)組、過(guò)表達(dá)miR-21組及NC組小鼠尾靜脈內(nèi)分別注入等體積PBS、agomiR-21及agomiR-NC，1次/3 d共4周。選用正常飼料喂養(yǎng)的C57BL/6小鼠作為正常對(duì)照組(controls)7只。

小鼠斷頸處死，將四肢固定于鼠板，75%乙醇消毒并剪開(kāi)胸部皮膚，剪去小鼠的胸骨和肋骨，去除肺組織，由近端剪斷食管和氣管，剝離完整的主動(dòng)脈，將主動(dòng)脈浸泡于4%多聚甲醛過(guò)夜，制備HE染色及免疫組化切片。未經(jīng)4%多聚甲醛灌流的主動(dòng)脈用DEPC·H2O處理過(guò)的研磨棒將血管研磨溶解后，分成兩部分，一部分待提取RNA；另一部分加RAPI裂解液，-80 ℃保存，留待提取蛋白。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-21及U6基因表達(dá)

采用miRNA提取試劑盒(北京天根)按說(shuō)明書從血漿中提取總RNA，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，按動(dòng)物組織RNA提取試劑盒(北京天根)說(shuō)明書提取主動(dòng)脈內(nèi)總RNA，并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。定量PCR以U6為內(nèi)參，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min熱啟動(dòng)后，進(jìn)行40個(gè)如下循環(huán)：95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s。miR-21的相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt方法計(jì)算。

1.5 HE染色

石蠟包埋，間斷均勻切片，厚度為5 μm，進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察血管形態(tài)學(xué)改變。

1.6 免疫組織化學(xué)及Western blot檢測(cè)PDCD4的表達(dá)

免疫組化：采用SP法。石蠟切片脫蠟，3%H2O2避光孵育20 min，蒸餾水、PBS各洗5 min。用檸檬酸鈉緩沖液微波抗原修復(fù)15 min，取出迅速冷卻，PBS洗2次各5 min。滴加封閉液，37 ℃孵育30 min，傾去不洗。加入PBS按1：100稀釋的Rabbit-antiPDCD4(ab79405)一抗，37 ℃孵育30 min，4 ℃過(guò)夜。PBS洗2次各5 min，加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG，37 ℃孵育30 min。PBS洗2次各5 min，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育30 min。PBS洗2次各5 min，DAB顯色。用蘇木精復(fù)染，脫水、透明，中性樹(shù)膠封片。

Western blot：細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞及動(dòng)脈組織

研磨裂解后，加蛋白上樣緩沖液后煮5 min，經(jīng)10% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維素膜上，5% TBSTM封閉過(guò)夜，次日用一抗孵育2 h，TBST洗3次，5 min/次，再加二抗孵育1 h，TBST洗6次，5 min/次，ECL顯色，暗室曝光顯影。內(nèi)參選用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鼠抗β-actin 抗體，圖像分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-21在STEMI患者血漿中的表達(dá)

實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，miR-21在急性STEMI患者血漿中的水平明顯升高(9.477±1.500比1.000±0.3795，P<0.001)。

2.2 miR-21、PDCD4在小鼠泡沫細(xì)胞中的表達(dá)

實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot結(jié)果顯示，小鼠巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中miR-21及PDCD4的表達(dá)水平明顯升高(圖1)。

A：miR-21在小鼠泡沫細(xì)胞中的表達(dá)(aP<0.01)；B：PDCD4在小鼠泡沫細(xì)胞中的表達(dá)圖1 miR-21和PDCD4在小鼠泡沫細(xì)胞中的表達(dá)

2.3 miR-21和PDCD4對(duì)細(xì)胞泡沫化的影響

油紅O染色顯示，與ox-LDL組比較，ox-LDL+miR-21類似物組及ox-LDL+siPDCD4組巨噬細(xì)胞泡沫化程度明顯下降，ox-LDL+miR-21抑制劑組細(xì)胞泡沫化程度明顯增加(圖2)。

圖2 miR-21和PDCD4對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化的影響(油紅O染色，×40)

A：AS模型、agomiR-21及陰性對(duì)照組模型的建立(油紅O染色×10)；B：miR-21在各組小鼠的主動(dòng)脈中的表達(dá)；C、D：小鼠主動(dòng)脈PDCD4蛋白免疫組化染色及Western blot (aP<0.01)，(油紅O染色，×40)圖3 miR-21含量與PDCD4蛋白水平在AS病變動(dòng)脈中的表達(dá)

2.4 miR-21和PDCD4對(duì)AS斑塊的影響

動(dòng)物模型建立(圖3A)。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組(C57BL/6小鼠)比較，單純高脂喂養(yǎng)小鼠AS斑塊中miR-21的表達(dá)水平明顯升高(P<0.01，圖3B)。免疫組化及Western blot結(jié)果顯示，單純高脂喂養(yǎng)小鼠斑塊內(nèi)PDCD4蛋白水平較正常對(duì)照組明顯增多(圖3C)；過(guò)表達(dá)miR-21組AS斑塊內(nèi)PDCD4蛋白水平較NC組明顯減少，且斑塊明顯減小(圖3D)。

3 討論

AS是動(dòng)脈硬化性疾病中最常見(jiàn)的一種。其特點(diǎn)是病變從動(dòng)脈內(nèi)膜開(kāi)始，先后有脂質(zhì)和復(fù)合糖類積聚、出血和血栓形成、纖維組織增生和鈣質(zhì)沉著，并有動(dòng)脈中層的逐漸蛻變和鈣化。近年來(lái)，AS導(dǎo)致的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronary artery disease，CAD)成為我國(guó)人群的主要死亡原因之一，而急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是導(dǎo)致冠心病患者發(fā)生不良預(yù)后及猝死的主要原因。2016年5月10日發(fā)布的《中國(guó)心血管病報(bào)告2015》顯示，2014年中國(guó)AMI死亡率城市為55.32/10萬(wàn)，農(nóng)村為68.60/10萬(wàn)，AMI死亡率均隨年齡的增加而增加，其遞增趨勢(shì)近似于指數(shù)關(guān)系[4]。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥氧化反應(yīng)貫穿AS斑塊的起始形成，炎癥介質(zhì)和脂類相互作用決定斑塊進(jìn)展破裂，在AMI的病變中起著核心作用[5]。

miR-21是一種廣泛表達(dá)于多種組織并且參與多種疾病發(fā)生發(fā)展的miR。多項(xiàng)研究表明，miR-21在AS患者血漿中的表達(dá)升高[6]。然而，miR-21在AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用尚存在爭(zhēng)論。有研究表明，AMI模型及患者心肌缺血邊緣區(qū)及非缺血部位中miR-21的表達(dá)升高，轉(zhuǎn)染miR-21可以縮小缺血面積，提示miR-21或可改善冠心病的預(yù)后[7]。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miR-21在球囊拉傷、剪切力損傷或H2O2損傷的血管平滑肌細(xì)胞中顯著升高，并可促進(jìn)血管平滑肌增殖及遷移[8]，提示miR-21升高可促進(jìn)AS的形成。

PDCD4是近年發(fā)現(xiàn)的一種重要的抑癌基因，通過(guò)抑制蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展從而發(fā)揮抑癌基因的功能[9]。miR作為生物體內(nèi)重要的小分子非編碼RNA在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控靶基因起到了廣泛作用。多項(xiàng)研究表明miR-21直接靶向調(diào)節(jié)PDCD4基因在人多數(shù)腫瘤組織如口咽癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等中發(fā)揮重要作用[10-13]。另外，對(duì)巨噬細(xì)胞自噬及其相關(guān)功能的影響證實(shí)PDCD4能夠抑制多種刺激誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞自噬，發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞自噬促進(jìn)巨噬細(xì)胞泡沫化形成，并且在AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也發(fā)揮至關(guān)重要作用[3]。有研究表明，miR-21可以靶定并抑制PDCD4的表達(dá)以減輕H2O2導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷[14]，提示miR-21或可改變AS斑塊穩(wěn)定性，可能成為早期識(shí)別AS的循環(huán)標(biāo)志物，成為CAD的新的治療靶點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)在臨床患者外周血中檢測(cè)到miR-21的表達(dá)。有研究表明細(xì)胞可通過(guò)分泌含有miRs的微泡進(jìn)入到外周血循環(huán)，miRs可以在細(xì)胞和組織器官中建立信號(hào)通路，并攜帶細(xì)胞內(nèi)的生理及病理信息，可作為疾病診斷、預(yù)測(cè)及疾病監(jiān)控的新的生物標(biāo)志物[15]。Deddens等[16]在小鼠缺血再灌注損傷模型中發(fā)現(xiàn)損傷的心肌可釋放含有心臟和肌肉特異性miRs的微泡到血液循環(huán)中，并可在血漿中快速檢測(cè)到。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-21水平在急性STEMI患者血漿中顯著升高，但循環(huán)miR-21能否取代傳統(tǒng)的心血管病標(biāo)記物，如肌鈣蛋白、肌酸激酶等，我們需進(jìn)一步證實(shí)miR-21與急性冠狀動(dòng)脈綜合征相對(duì)應(yīng)的動(dòng)態(tài)變化，并尋找一種快速的檢測(cè)方法。本實(shí)驗(yàn)在入選人群中，并未納入非ST段抬高型心肌梗死及心絞痛患者，未能涵蓋所有冠心病人群，有待進(jìn)一步完善。

在轉(zhuǎn)染miR-21類似物/抑制劑及siPDCD4并用ox-LDL處理RAW264.7細(xì)胞成泡沫細(xì)胞的體外模型中發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-21及沉默PDCD4可抑制巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。提示miR-21可發(fā)揮抗AS的作用。建立ApoE-/-小鼠AS模型，并采用鼠尾靜脈注射法建立過(guò)表達(dá)miR-21 AS模型，結(jié)果顯示，單純高脂喂養(yǎng)小鼠AS斑塊中miR-21的表達(dá)水平明顯升高，且過(guò)表達(dá)miR-21組AS斑塊內(nèi)PDCD4蛋白水平較NC組明顯減少，且斑塊明顯減小。提示miR-21抑制PDCD4的表達(dá)，并可減緩AS斑塊的發(fā)展。同時(shí)，單純高脂喂養(yǎng)小鼠斑塊內(nèi)PDCD4蛋白水平較正常小鼠動(dòng)脈組織中明顯增多，提示PDCD4蛋白很可能具有促AS的作用，進(jìn)一步證實(shí)miR-21在AS發(fā)生發(fā)展中起保護(hù)性作用。本研究在細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，有待進(jìn)一步明確miR-21與PDCD4之間的關(guān)系及深入探索發(fā)生機(jī)制。

綜上可見(jiàn)，miR-21在急性STEMI患者、泡沫細(xì)胞及AS斑塊中的水平明顯升高，有望成為臨床診斷急性STEMI和預(yù)測(cè)AS形成的新的指標(biāo)。miR-21或可靶向調(diào)控PDCD4的表達(dá)，從而發(fā)揮抗AS作用，為延緩AS從而治療CAD提供了新的治療方向，對(duì)于早期預(yù)防、診斷及治療CAD將具有重要意義。

利益沖突：無(wú)

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(本文編輯：譚瀟)

Roles of microRNA-21 and its target gene programmed cell death 4 in atherosclerosis

ZhuXiaotong,ZhangShengjie,LiangXue,LiGuangping

DepartmentofCardiology,TianjinInstituteofCardiology,SecondHospitalofTianjinMedicalUniversity，TianjinKeyLaboratoryofIonic-MolecularFunctionofCardiovasculardisease,TianjinInstituteofCardiology,Tianjin300211,China

Correspondingauthor:LiGuangping,Email:tjcardiol@126.com

Objective To investigate the roles of microRNA (miR)-21 and its target gene, programmed cell death 4 (PDCD4) in the development of atherosclerosis (AS). Methods The plasma of 38 patients with acute ST elevation myocardial infarction (STEMI) and 34 non-coronary heart disease patients were collected and used for detecting the levels of miR-21 by real-time quantitative PCR. Rat macrophage line RAW 264.7 cells were transfected with the miR-21 analogue, inhibitor and silencing PDCD4 (siPDCD4) in mediation of Lipo3000, then co-incubated with ox-LDL and cultured for 48 h,blank control group (untransfected with no ox-LDL) and ox-LDL group (ox-LDL only) were also set up meanwhile. The effect of miR-21 and PDCD4 on foam RAW 264.7 cells was analyzed by oil red staining. High fat feeding was given to 20 ApoE-/-male mice (4-6 weeks) to establish AS animal models, and the mice were randomly divided into 3 groups: 6 in AS group, 7 in miR-21 mimics treated group and 7 in NC group. Every 3 days, mice in the miR-21 mimics treated group and NC group

tail vein injection of cholesterol conjugated miR-21 agonist (agomiR-21) and agomiR-NC, respectively. C57BL/6 mice fed with standard diet were arranged in the normal control group. qRT-PCR was performed to detect the expression levels of miR-21 in atherosclerotic plaque and normal artery. Immunohistochemistry and Western blot were used to measure the expression of PDCD4 protein. Results The expression levels of miR-21 in plasma of patients with STEMI, foam cells and plaque tissue from simple high fat fed ApoE-/-mouse were significantly higher than those in the control group (P<0.001,P<0.01,P<0.01, respectively). As compared with those in ox-LDL group, the bubbling levels in ox-LDL+miR-21 mimics group and ox-LDL+siPDCD4 group decreased significantly while those in ox-LDL+miR-21 inhibitor group increased significantly. Compared with the C57BL/6 mice, the high fat diet-fed ApoE-/-mice exhibited a greater accumulation of PDCD4 protein in the aorta. Nevertheless, tail vein injection of miR-21 mimics markedly inhibited the protein expression of PDCD4, and significantly decreased the sizes of AS areas. Conclusions Overexpression of miR-21 may inhibit the transformation of macrophages to foam cells and decrease AS area by regulating the expressions of PDCD4 thus plays a critical and protective role in anti-AS.

microRNA-21； Programmed cell death 4； Atherosclerosis； Acute ST-segment elevation myocardial infarction； Foam cells

李廣平，電子信箱：tjcardiol@126.com

10.3969/j.issn.1007-5410.2017.03.009

2016-10-21)