仲躋鳳，孟慶欣

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬海安縣中醫(yī)院 超聲科，江蘇 南通226600；2.南京軍區(qū)總醫(yī)院 超聲科)

卵巢腫塊中超聲造影參數(shù)圖像處理軟件的DVP表現(xiàn)及與VEGF和HIF-1a同步相關(guān)研究

仲躋鳳1，孟慶欣2

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬海安縣中醫(yī)院 超聲科，江蘇 南通226600；2.南京軍區(qū)總醫(yī)院 超聲科)

對(duì)于實(shí)質(zhì)性的腫瘤微環(huán)境來(lái)說(shuō)，缺氧狀態(tài)屬于一種非常常見(jiàn)的基本特征[1]。因?yàn)閻盒阅[瘤增殖生長(zhǎng)的速度過(guò)于迅速，和腫瘤細(xì)胞中的血管不成比例，造成局部組織嚴(yán)重缺氧[2]。腫瘤可通過(guò)多種方式適應(yīng)缺氧微環(huán)境，其中最重要的代償機(jī)制和腫瘤血管的誘導(dǎo)形成密切關(guān)聯(lián)[3，4]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)屬于一種非常重要的生長(zhǎng)因子，主要作用是對(duì)惡性腫瘤血管的形成產(chǎn)生刺激作用，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在缺氧情況下，機(jī)體組織的許多因子都會(huì)做出應(yīng)激反應(yīng)，在這個(gè)過(guò)程中起中心調(diào)節(jié)作用的因子就是缺氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia Inducibie Factor,HIF-1a)。HIF-1a可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移[5，6]。

1 材料與方法

1.1 材料

研究對(duì)象：2010年2月至2016年2月在本院及在南京軍區(qū)總醫(yī)院學(xué)習(xí)期間常規(guī)超聲發(fā)現(xiàn)卵巢包塊的患者50例，年齡24-70(44±12)歲。所有患者于術(shù)前1周內(nèi)行盆腔超聲造影檢查，初步判定卵巢腫塊的性質(zhì)，再結(jié)合手術(shù)病理結(jié)果分析卵巢良惡性腫塊不同的超聲造影特征。所有患者在檢查前簽署知情同意書(shū)，對(duì)無(wú)臨床指征者不以研究為理由進(jìn)行組織標(biāo)本采集。排除孕期或哺乳期婦女、術(shù)前行介入治療或化療、有心臟病史、近期血栓史及對(duì)造影劑中任何成分過(guò)敏者。50例病例分別為：良性腫塊28例，其中漿液性囊腺瘤8例，粘液型囊腺瘤6例，子宮內(nèi)膜異位囊腫2例，成熟畸胎瘤3例，炎性包裹性積液2例，卵泡膜細(xì)胞瘤1例，卵巢結(jié)核1例，出血性黃體囊腫2例，卵巢纖維瘤3例；惡性22例，其中漿液性囊性瘤9例，粘液性囊腺瘤5例，未成熟畸胎瘤2例，大網(wǎng)膜炎性纖維肉瘤2例，轉(zhuǎn)移性瘤3例，惡化卵泡膜瘤1例。

超聲診斷儀：VolusuanE8 ，探頭C1-5，頻率3.5-5.0 MHz。

超聲造影采用1.0造影分析軟件。造影劑Sonovue。試劑：鼠抗人VEGF、HIF-Ia單克隆抗體由美國(guó)Abcom公司提供。

1.2 方法

超聲造影檢查：患者取仰臥位，檢查過(guò)程中保持體位不變并勻速呼吸。每個(gè)病例由同一超聲醫(yī)師在相同條件下、同一臺(tái)超聲診斷儀完成。造影前所有患者均簽署知情同意書(shū)。根據(jù)上升時(shí)間、達(dá)峰時(shí)間及平均跨越時(shí)間等時(shí)間相關(guān)性指標(biāo)的參數(shù)成像圖特征，提出參數(shù)成像診斷法：以顏色邊界不清晰、顏色過(guò)渡紊亂，“點(diǎn)狀”分布者計(jì)1分；顏色邊界清晰，顏色過(guò)度均勻，“片狀”分布者計(jì)0分。對(duì)每個(gè)病例的這3個(gè)參數(shù)成像圖分別進(jìn)行計(jì)分，相加得出總分，以總分≦1分歸為良性組，總分≧2分歸為惡性組，將病理診斷作為金標(biāo)準(zhǔn)得出配對(duì)計(jì)數(shù)資料，計(jì)算兩種診斷方法的結(jié)果一致性。利用參數(shù)成像法計(jì)算卵巢腫塊的敏感性、特異性等。

免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)卵巢良惡性腫塊中VEGF、HIF-1a的表達(dá)：手術(shù)中的使用的標(biāo)本注意使用10%的甲醛液進(jìn)行固定，時(shí)間為1天，將該標(biāo)本送南京軍區(qū)總院病理科檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 造影前后卵巢良惡性腫瘤聲像圖特征

良性腫塊大多表現(xiàn)為囊性為主，邊界清楚，少數(shù)為實(shí)性或?qū)嵭詾橹?，常?guī)超聲測(cè)量腫塊直徑結(jié)果為良性組3.9-13.2 cm，平均(7.2±3.4)cm；惡性腫塊多表現(xiàn)為混合性包塊或?qū)嵭园鼔K，邊界不規(guī)則，直徑4.0-12.9 cm，平均(8.5±2.9)cm，造影后良性4.2-15.2 cm，平均(7.4±3.6)cm，造影后腫塊直徑較造影前無(wú)明顯增大，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.398)；對(duì)于惡性組來(lái)說(shuō)，大約是4.5-13.2 cm，平均直徑是(9.7±3.0)cm。由此可知造影之前的直徑要遠(yuǎn)小于造影后的直徑，兩者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006)。

2.2 卵巢良惡性腫塊造影前后病灶內(nèi)血流顯像情況

造影前后卵巢良惡性腫塊的血管數(shù)目、形態(tài)及分布明顯不同。卵巢良性腫塊顯示瘤內(nèi)無(wú)灌注或均勻性增強(qiáng)，多數(shù)從周邊向內(nèi)部灌注，血管多分布于腫塊的周邊，形態(tài)規(guī)則，偶見(jiàn)稀疏分支，但光滑，走行較直，血管之間無(wú)分流；而惡性腫塊在造影后顯示瘤體不均勻性增強(qiáng)，多數(shù)從中央向周邊灌注，血管數(shù)目較良性腫塊明顯增多，分布于腫塊內(nèi)外，外圍血管粗大、扭曲、走向不規(guī)則，呈樹(shù)枝狀、蟹足狀伸入瘤內(nèi)，瘤內(nèi)血管呈繁星點(diǎn)狀、團(tuán)簇狀。

對(duì)50例卵巢腫塊用SonoLiver超聲造影參數(shù)圖像處理分析軟件進(jìn)行脫機(jī)分析，良性腫塊中24例(86%)顯示內(nèi)部以藍(lán)色為主的低增強(qiáng)(圖1)，其中包括4例內(nèi)部無(wú)增強(qiáng)(2例炎性包裹性積液顯示內(nèi)部無(wú)增多，2例子宮內(nèi)膜異位囊腫顯示內(nèi)部無(wú)增強(qiáng)，但囊壁和分隔見(jiàn)造影增強(qiáng)顯像)；4例顯示內(nèi)部以紅色為主的高增強(qiáng)(14%)，分別是畸胎瘤2例，卵巢纖維瘤2例；惡性腫塊中15例(68%)顯示內(nèi)部以紅色為主的高增強(qiáng)(圖1)，7例顯示內(nèi)部以藍(lán)色為主的低增強(qiáng)(32%)。兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.190，P<0.01)。

圖1 卵巢漿液性囊腺瘤、上皮性癌超聲造影圖像

2.3 TIC、DVP曲線分析

卵巢良性腫塊時(shí)間-強(qiáng)度曲線(TIC)多表現(xiàn)為“緩升緩降”，波峰圓鈍，上升支與下降支較平滑，廓清時(shí)間較長(zhǎng)；惡性腫塊的TIC多表現(xiàn)為“速升速降”，波峰尖銳，上升支下降支均陡直，較周圍正常組織提前達(dá)峰。動(dòng)態(tài)血管模式(DVP)曲線的特征：良性組中的23例(79%)DVP曲線在造影全過(guò)程全部時(shí)段保持在基線之下(圖2)，5例在基線之上(18%)，這5例分別是畸胎瘤2例，纖維瘤1例，卵巢黃體囊腫出血2例；惡性組中有15例(68%)DVP曲線在造影全過(guò)程全部時(shí)段保持在基線之上(圖2)，6例(27%)在灌注其和廓清早期位于基線之上，廓清中晚期降至基線之下，1例(5%)在造影全過(guò)程全部時(shí)段保持在基線之下。

圖2 卵巢漿液性囊腺瘤、上皮性癌動(dòng)態(tài)血管模式曲線

2.4 卵巢良惡性腫塊超聲造影TIC定量參數(shù)比較

卵巢腫塊經(jīng)超聲造影圖像呈隨時(shí)間變化而出現(xiàn)灌注強(qiáng)弱、消退的變化規(guī)律。造影劑達(dá)峰強(qiáng)度惡性腫瘤顯著高于良性腫瘤(P=0.000)，達(dá)峰時(shí)間及平均跨越時(shí)間惡性組短于良性組(P<0.05)，上升時(shí)間雖惡性短于良性，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 卵巢良惡性腫塊的TIC各參數(shù)比較

2.5 卵巢良惡性腫塊中VEGF和HIF-1a的變動(dòng)情況及相關(guān)性

VEGF主要表達(dá)于卵巢癌細(xì)胞的胞質(zhì)或胞膜、腫瘤間質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及少量炎性細(xì)胞，胞質(zhì)中的表達(dá)最強(qiáng)。VEGF在良性卵巢腫塊組織陽(yáng)性表達(dá)率為22%(4/18)，其中中表達(dá)(++)，低表達(dá)(+)；但是惡性卵巢腫塊組織中的陽(yáng)性表達(dá)率是72.7%(16/22)，并且多為中表達(dá)(++)，高表達(dá)(+++)，低表達(dá)(+)。兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 卵巢良惡性腫塊中VEGF的表達(dá)情況

HIF-1a主要表達(dá)于卵巢癌細(xì)胞的胞質(zhì)，胞核及間質(zhì)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，胞質(zhì)最多見(jiàn)，見(jiàn)圖3。HIF-1a在良性卵巢腫塊組織的陽(yáng)性表達(dá)率為10.7%(3/28)，均表示低表達(dá)(+)；在惡性卵巢腫塊組織的陽(yáng)性表達(dá)率為69.2%(15/22)，多為高表達(dá)(+++)，中表達(dá)(++)。兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 卵巢良惡性腫塊中HIF-1a的表達(dá)情況

對(duì)于22例卵巢惡性腫塊組織來(lái)說(shuō)，大約有21例表現(xiàn)為HIF-1a和VEGF具有一致性，并且同時(shí)表現(xiàn)為陽(yáng)性的有15例；兩者同時(shí)表現(xiàn)為陰性的有6例；VEGF陽(yáng)性表達(dá)但是HIF-1a陰性表達(dá)的只有1例。經(jīng)Spearman相關(guān)分析，卵巢惡性腫塊組織仲HIF-1a表達(dá)與VEGF表達(dá)之間呈明顯正相關(guān)(r=0.791，P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 卵巢惡性腫塊中VEGF/HIF-1a表達(dá)的相關(guān)性

超聲造影定量參數(shù)達(dá)峰強(qiáng)度與卵巢良惡性腫塊中VEGF、HIF-1a的表達(dá)呈明顯的正相關(guān)，P均小于0.05。上升時(shí)間、達(dá)峰時(shí)間、平均跨越時(shí)間和卵巢良惡性腫塊中VEGF、HIF-1a的表達(dá)呈明顯的負(fù)相關(guān)，P均小于0.05，見(jiàn)表5。

表5 卵巢良惡性腫塊中VEGF、HIF-1a的表達(dá)與超聲造影定量參數(shù)的相關(guān)性(r值)

3 討論

常規(guī)的超聲檢查不能快速檢測(cè)低速的腫瘤血管，但超聲造影則可以。超聲造影的作用主要是通過(guò)超聲造影劑微泡在血管組織中利用相關(guān)的軌跡及造影增強(qiáng)達(dá)峰后腫瘤內(nèi)微血管的分布圖像，可觀察到70 μm左右小血管，獲得關(guān)于毛細(xì)血管的相關(guān)信息，也就是說(shuō)組織內(nèi)部的血供問(wèn)題[7-10]，這樣可以更清楚地獲得腫瘤血管的形態(tài)、走行、分布位置以及所有腫瘤內(nèi)部的血管情況等。

SonoLiver超聲造影定量分析軟件用顏色深淺反應(yīng)目標(biāo)組織內(nèi)的造影劑灌注情況。本研究的良性腫瘤中有86%顯示為以藍(lán)色為主的低增強(qiáng)，惡性腫瘤中68%顯示為以紅色為主的高增強(qiáng)，直觀的反映了良惡性腫塊中的血管分布和血流灌注情況。而良性腫瘤中2例成熟畸胎瘤病檢結(jié)果含有伴甲狀腺成分和神經(jīng)膠質(zhì)成分，血流豐富，因此顯示為紅色為主的高增強(qiáng)；2例卵巢纖維瘤，超聲造影顯示病灶內(nèi)造影劑呈絮狀慢慢充盈，較稀疏，也顯示為紅色為主的高增強(qiáng)。而惡性腫瘤以藍(lán)色為主的低增強(qiáng)可能與腫瘤的大片壞死有關(guān)。

本研究使用動(dòng)態(tài)血管模式曲線是標(biāo)準(zhǔn)化時(shí)間-強(qiáng)度曲線，是TIC的進(jìn)一步升華，研究病灶區(qū)與參考區(qū)的強(qiáng)度差隨時(shí)間變化的過(guò)程，反映強(qiáng)度差值的變化過(guò)程。卵巢惡性腫瘤TIC表現(xiàn)為“速升速降”、卵巢良性腫瘤TIC表現(xiàn)為“緩升緩降”。本次研究的22例惡性病灶中，有6例DVP曲線表現(xiàn)為灌注期以及廓清早期等都位于基線以上，但是廓清中晚期下降到基線之下，這樣的結(jié)果表明廓清中期和晚期的病灶內(nèi)部的造影劑強(qiáng)度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于周圍的正常組織的造影劑強(qiáng)度，進(jìn)而可以間接地反映出惡性病灶內(nèi)部的造影劑消失的速度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于正常組織。造影劑達(dá)峰強(qiáng)度惡性腫瘤顯著高于良性腫瘤(P=0.000)，反映了惡性腫瘤血管豐富，進(jìn)入腫瘤血管床的微泡總數(shù)量明顯多于良性腫瘤；達(dá)峰時(shí)間及平均跨越時(shí)間惡性腫塊短于良性腫塊(P<0.05)，說(shuō)明惡性腫瘤新生血管數(shù)目增多，血管壁不完整，存在大量的動(dòng)靜脈短路和血管環(huán)。而上升時(shí)間惡性短于良性，但二者無(wú)顯著性差異，可能與本研究樣本量小有關(guān)。

這里所說(shuō)的腫瘤血管生成屬于一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，在一系列影響腫瘤血管生成的因子中，VEGF、HIF-1a是刺激腫瘤血管形成的重要因子、與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。VEGF的主要作用是能夠增強(qiáng)血管的通透性，然后直接對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖分化產(chǎn)生刺激，進(jìn)而對(duì)血管的構(gòu)建和生長(zhǎng)產(chǎn)生促進(jìn)作用。HIF-1a屬于一種氨特異性感受器，主要來(lái)源于哺乳動(dòng)物體內(nèi)，并且在缺氧的狀態(tài)下對(duì)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)具有非常重要的作用。本次研究主要采用的是免疫化的方法，然后對(duì)卵巢良惡性腫瘤中的VEGF、HIF-1a因子的表達(dá)情況進(jìn)行及時(shí)的檢測(cè)，結(jié)果顯示VEGF在卵巢良性腫塊組織陽(yáng)性表達(dá)率分別為14.3%(4/28)，均為中低表達(dá)；在卵巢惡性腫塊組織的陽(yáng)性表達(dá)率為72.7%(16/22)，多為中高表達(dá)；HIF-1a在良性良性腫塊組織的陽(yáng)性表達(dá)率為10.7%(3/28)，且均為低表達(dá)；在惡性卵巢腫塊組織的陽(yáng)性表達(dá)率為68.2%(15/22)，多為中高表達(dá)。HIF-1a蛋白表達(dá)與VEGF水平呈顯著性相關(guān)。這與前人的研究結(jié)果一致，提示VEGF、HIF-1a在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有重要的作用，HIF-1a能夠在基因水平上對(duì)VEGF的表達(dá)產(chǎn)生調(diào)控作用，這樣可以加快腫瘤的生長(zhǎng)速度。腫瘤細(xì)胞不斷增生，但是血管生長(zhǎng)相對(duì)不足引起新生腫瘤細(xì)胞局部出現(xiàn)缺氧的情況，缺氧又可以反饋性的對(duì)VEGF表達(dá)產(chǎn)生影響，進(jìn)而促進(jìn)血管增生，最終為腫瘤的進(jìn)一步生長(zhǎng)提供必要條件[11]。

本研究通過(guò)對(duì)卵巢腫塊的超聲造影動(dòng)態(tài)血管模式表現(xiàn)、定量參數(shù)與血管生成因子VEGF、HIF-1a表達(dá)的相關(guān)性研究發(fā)展，達(dá)峰強(qiáng)度與卵巢良惡性腫塊中VEGF、HIF-1a的表達(dá)呈明顯的正相關(guān)；腫瘤血管內(nèi)的血流灌注及血流量明顯增加，這表示卵巢腫塊的VEGF、HIF-1a表達(dá)越強(qiáng)，卵巢腫塊內(nèi)新生血管數(shù)目越多，造影時(shí)進(jìn)入血管床的微泡流量越大，而達(dá)峰強(qiáng)度反映了某一時(shí)間進(jìn)入腫瘤血管床的最大微泡數(shù)量，說(shuō)明了超聲造影達(dá)峰強(qiáng)度可間接反映腫瘤的血管生成情況。上升時(shí)間、達(dá)峰時(shí)間、平均跨越時(shí)間和卵巢良惡性腫塊中VEGF、HIF-1a的表達(dá)呈明顯的負(fù)相關(guān)，這表示卵巢腫塊的VEGF、HIF-1a表達(dá)越強(qiáng)，血液與組織液之間的交換面積越大，造影時(shí)血流灌注量越大，微泡流速越大，故超聲造影時(shí)間相關(guān)性指標(biāo)就越短。

綜上所述，本研究術(shù)前利用SonoLiver超聲造影定量分析，從影像學(xué)宏觀評(píng)價(jià)腫瘤血管灌注狀態(tài)，術(shù)后從免疫組化的分子學(xué)微觀評(píng)價(jià)腫瘤血管生成狀態(tài)。雖然免疫組化檢測(cè)腫瘤是目前評(píng)價(jià)腫瘤血管生成最常用的方法，但它通過(guò)活檢或術(shù)后取得標(biāo)本，是有創(chuàng)檢查，而且術(shù)后的檢查并不能達(dá)到早期診斷的目的。而造影技術(shù)作為一種新型的影像學(xué)檢查技術(shù)，以腫瘤內(nèi)部血管特征為病理基礎(chǔ)，實(shí)時(shí)觀察病變區(qū)造影劑灌注的全過(guò)程，在腫塊的定性診斷中頗有發(fā)展[12，13]。具有無(wú)創(chuàng)、安全、快捷、重復(fù)性好，因此超聲造影彌補(bǔ)了免疫組化有創(chuàng)、術(shù)后評(píng)價(jià)的缺點(diǎn)，為卵巢癌的早期診斷提供依據(jù)。

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1007-4287(2017)06-1046-05

仲躋風(fēng)，女，副主任醫(yī)師，超聲科主任，研究方向：婦科疾病的超聲診斷，各種介入性治療。

2016-10-12)