邱小明，謝建華，2(.漳州職業(yè)技術學院食品與生物工程系，福建漳州 363000；2.農產品深加工及安全福建省高校應用技術工程中心，福建漳州 363000)

響應面法優(yōu)化酶解提取帶魚內臟魚油的工藝研究

邱小明1，謝建華1，2
(1.漳州職業(yè)技術學院食品與生物工程系，福建漳州 363000；2.農產品深加工及安全福建省高校應用技術工程中心，福建漳州 363000)

采用響應面法優(yōu)化酶解提取帶魚內臟魚油，在篩選出最優(yōu)酶的基礎上，進行單因素和響應面優(yōu)化分析，結果發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶酶解帶魚內臟提取魚油的效果最好，用胰蛋白酶酶解得到魚油的最佳工藝參數(shù)條件為：加酶量2.08 %，酶解溫度38.34 ℃，pH值8.21，酶解時間180 min，預測魚油提取率為79.0 %。為了方便實際操作，選取魚油提取率的最佳工藝參數(shù)條件為：加酶量2.0 %，酶解溫度38 ℃、pH值8.20，酶解時間180 min，得到的實際魚油提取率78.66 %，這與預測值基本相吻合。因此，響應面法優(yōu)化得到的最佳工藝參數(shù)可靠性較高。

響應面法；酶解法；帶魚；魚油

帶魚又稱白帶魚，是我國四大海洋經(jīng)濟魚類之一，年捕撈達量達400多萬噸，為我國最重要的海洋魚類資源[1-2]。帶魚的利用主要被加工成魚肉制品，而加工過程中產生的內臟、魚頭、魚骨等下腳料占原料魚的40 %左右[3]，目前主要用于生產飼料。魚油中含有豐富的不飽和脂肪酸，具有降低膽固醇、治療心臟病、抗衰老、抗疲勞、預防心肌梗塞等多種功效[4-5]。研究表明，帶魚的內臟含油量高，維生素A含量豐富[6]。目前，對于魚油的提取主要采用蒸煮提取、溶劑提取、壓榨、淡堿水解、酶解等方法[7]，溶劑提取、蒸煮提取、壓榨對魚油的提取率較低，淡堿水解提取不易控制，提取率不穩(wěn)定，而酶解法提油具有提取率高、反應條件穩(wěn)定、有效成分損失少等優(yōu)點。因此，本文采用酶解法對帶魚內臟中的魚油進行提取，研究不同的蛋白酶對魚油提取的影響，并優(yōu)化蛋白酶對帶魚內臟魚油提取的工藝條件，得出最佳的酶解工藝參數(shù)，為帶魚的綜合利用提供參考。

1 材料與設備

1.1 實驗材料

帶魚，從漳州水產批發(fā)市場購得。

1.2 試劑

胃蛋白酶(3×104U/g)、胰蛋白酶(5×104U/g)、木瓜蛋白酶(2×105U/g)、中性蛋白酶(1×105U/g)、堿性蛋白酶(3×104U/g)均購于華順生物技術有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、石油醚等均為分析純。

1.3 儀器

JA5003型電子分析天平(常州市宏衡電子儀器廠)，RE-6000A型旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；DS-1型組織搗碎機(上海欣茂儀器有限公司)；PHS-3G型pH計(上海精密科學儀器有限公司)。

2 實驗方法

2.1 原料預處理

將帶魚內臟取出，并搗碎成糊狀冷藏備用。

2.2 酶解法提取帶魚內臟魚油過程

精確稱取帶魚內臟25 g于錐形瓶中，加水調節(jié)固液比，加氫氧化鈉或鹽酸溶液調節(jié)酶解pH值，加蛋白酶后搖勻密封，于水浴鍋中加熱到設定溫度，搖勻后調節(jié)pH值使蛋白酶失活。酶解完成后，過濾殘渣，得酶解液。

2.3 帶魚內臟魚油提取工藝

2.3.1 帶魚內臟酶解蛋白酶的篩選

對帶魚內臟魚油分別采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶5種蛋白酶進行提取，在各自最適的pH值、溫度下，設置提取條件為酶添加量2.0 %，時間150 min，篩選出帶魚內臟魚油提取率最高的酶。

2.3.2 酶解工藝的研究

2.3.2.1 帶魚內臟酶解單因素研究

在上述2.3.1篩選出最優(yōu)酶的基礎上，進行單因素實驗，考察加酶量、酶解pH值、酶解溫度、酶解時間等因素對帶魚內臟酶解的影響，計算魚油提取率。

(1)加酶量對帶魚內臟魚油提取率的影響。設定酶解pH值7.5、溫度45 ℃、時間150 min，探討不同加酶量(0.5 %、1.0 %、1.5 %、2.0 %、2.5 %)對帶魚內臟魚油提取率的影響。

(2)酶解pH值對帶魚內臟魚油提取率的影響。在上述(1)得出的最適加酶量的基礎上，設定酶解溫度45 ℃、時間150 min，探討不同酶解pH值(6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)對帶魚內臟魚油提取率的影響。

(3)酶解溫度對帶魚內臟魚油提取率的影響。在上述(1)(2)得出的最適加酶量、酶解pH值的基礎上，設定酶解時間150 min，探討不同酶解溫度(35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃)對帶魚內臟魚油提取率的影響。

(4)酶解時間對帶魚內臟魚油提取率的影響。在上述(1)(2)(3)得出的最適加酶量、酶解pH值、溫度的基礎上，探討不同酶解時間(90 min、120 min、150 min、180 min、210 min)對帶魚內臟魚油提取率影響。

2.3.2.2 響應面實驗設計

在上述篩選出最優(yōu)酶和單因素實驗結果的基礎上，以魚油提取率作為指標，設計響應面實驗確定帶魚內臟魚油提取的最佳酶解工藝條件。

2.4 魚油提取率計算

酶解魚油的提取參照吳奎元的方法，采用萃取法，萃取條件為：石油醚75 mL、pH值4.0、溫度40℃、時間為30 min[8]，并計算出提取魚油的質量。

采用索氏抽提法測定粗脂肪含量，其操作參照國家標準“食品中粗脂肪的測定”(GB/T 14772-2008)進行。經(jīng)測定，帶魚內臟的粗脂肪含量為8.69 %，說明帶魚內臟的粗脂肪含量較高。

3 結果與分析

3.1 帶魚內臟酶解蛋白酶的篩選

對帶魚內臟魚油分別采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶5種蛋白酶進行提取，在各自最適的pH值、溫度下，提取條件為酶添加量2.0%，時間150 min，篩選出帶魚內臟魚油提取率最高的酶。其實驗結果見表1。

表1 不同蛋白酶對帶魚內臟魚油提取率的影響

從表1可知，胰蛋白酶酶解帶魚內臟魚油提取率最高，達到了70.15%，其次為堿性蛋白酶，而中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶的提取效果較差。說明，酶對蛋白質的水解具有專一性，胰蛋白酶對帶魚內臟中蛋白質的肽鍵具有較好水解作用，可分離出相結合的脂肪分子。因此，本實驗選擇胰蛋白酶進行酶解帶魚內臟，并進一步優(yōu)化提取魚油的條件。

3.2 帶魚內臟酶解單因素研究

3.2.1 加酶量對帶魚內臟魚油提取率的影響

用胰蛋白酶進行酶解，設定酶解pH值7.5、溫度45 ℃、時間150 min，探討不同加酶量對帶魚內臟魚油提取率的影響，結果見圖1。

圖1 加酶量對帶魚內臟魚油提取率的影響

從圖1可知，帶魚內臟魚油提取率隨加酶量的增加先升高后降低，在加酶量為2.0 %時，魚油提取率最高。隨著加酶量的增加，酶解效率提升，但是酶過量時，可能酶本身也會產生水解而導致酶活性下降。

3.2.2 酶解pH值對帶魚內臟魚油提取率的影響

用胰蛋白酶進行酶解，在上述3.2.1得出的最適加酶量的基礎上，設定酶解溫度45 ℃、時間150 min，探討不同酶解pH值對帶魚內臟魚油提取率的影響(圖2)。

圖2 不同酶解pH值下對帶魚內臟魚油的提取率

由圖2可以看出，帶魚內臟魚油的提取率隨酶解pH值的升高先增加后降低，用胰蛋白酶進行酶解，在pH值為8時，魚油提取率最高。酶解pH值過高或過低都會影響到酶的活性以及底物與酶反應的動力學參數(shù)。

3.2.3 酶解溫度對帶魚內臟魚油提取率的影響

用胰蛋白酶進行酶解，在上述3.2.1、3.2.2得出的最適加酶量、酶解pH值的基礎上，設定酶解時間150 min，探討不同酶解溫度對帶魚內臟魚油提取率的影響,結果見圖3。

圖3 酶解溫度對帶魚內臟魚油提取率的影響

從圖3可知，帶魚內臟魚油提取率隨酶解溫度的升高先增加后降低，在溫度為35 ℃和40 ℃時，魚油提取有較好效果，其中40 ℃時魚油提取率稍高于35 ℃。酶解溫度過高或過低都會影響到酶的活性，影響酶對底物的作用效果，此外酶解溫度過高也會引起魚油發(fā)生氧化作用。

3.2.4 酶解時間對帶魚內臟魚油提取率的影響

用胰蛋白酶進行酶解，在上述3.2.1、3.2.2、3.2.3得出的最適加酶量、酶解pH值、溫度的基礎上，探討不同酶解時間對帶魚內臟魚油提取率的影響，結果見圖4。

圖4 酶解時間對帶魚內臟魚油提取率的影響

從圖4可知，帶魚內臟魚油提取率隨酶解時間的延長而升高，在酶解時間達到180 min后，魚油提取率趨于平穩(wěn)。這是因為，帶魚內臟中蛋白質逐漸被胰蛋白酶水解，分離出相結合的脂肪分子，隨著反應的進行，內臟中蛋白質逐漸減少，在反應180 min后，蛋白質大部分被水解，脂肪分子也基本被釋放出，延長反應時間，魚油提取率升高也不明顯。

3.3 響應面優(yōu)化酶解帶魚內臟內臟魚油的實驗結果

3.3.1 響應面實驗方案

從上述單因素實驗結果可以看出，加酶量、酶解溫度、pH值對魚油提取率的影響顯著。因此，依據(jù)Design Expert(version 8.0.3)軟件的Box-Benhnken實驗設計原理，以魚油提取率為響應值，以加酶量、酶解溫度、pH值為考察指標，實驗方案設計三因素三水平，對提取條件開展響應面分析，各因素水平見表2。

表2 Box-Behnken實驗因素水平表

3.3.2 實驗結果與分析

以Y(%)魚油提取率為響應值，A(加酶量)、B(酶解溫度)、C(pH值)三因素為自變量，實驗結果見表3。

表3 響應面實驗設計與結果

3.3.3 實驗數(shù)據(jù)處理分析

利用Design Expert軟件，建立魚油提取率Y與影響因素之間關系的數(shù)學模型為：Y=-74.36500+1.51348A+8.59080B+0.84930C-0.05200AB-0.003AC-0.015BC-0.00781A2-5.042B2-0.02255C2。

其中，Y為魚油提取率(%)，A為加酶量(%)，B為酶解溫度(℃)，C為pH值。

表4 回歸模型方差分析

通過表4的回歸模型方差分析可知，P值小于0.001，R2=0.9863，模型具有極顯著性，說明該數(shù)學模型能很好地解釋98.63 %的魚油提取率的變化。從表4可知，A、B、C三因素對魚油提取率Y影響均極顯著(P<0.01)，且酶解溫度和pH值的影響程度高于加酶量。BC對魚油提取率Y的影響也顯著(P<0.05)。而回歸模型的失擬相不顯著(P=0.2034>0.05)，說明該數(shù)學模型與真實響應面的擬合度較高。

3.3.4 響應面分析

圖5 加酶量與酶解溫度對魚油提取率的響應面圖及等高線圖

從圖5可知，響應面的坡度比較陡，不同水平的酶解溫度和加酶量對魚油提取率的影響顯著，與加酶量相比，不同酶解溫度水平對響應曲線最高值影響較為顯著。從等高線圖可知，整個圖形呈橢圓形，說明加酶量與酶解溫度的交互作用比較明顯。

圖6 pH值與酶解溫度對魚油提取率的響應面圖及等高線圖

如圖6所示，響應面的坡度比較陡，說明不同水平的酶解溫度和pH值對魚油提取率的影響顯著。從pH值與酶解溫度的等高線圖可知，整個圖形呈橢圓形，說明pH值與酶解溫度的交互作用對魚油提取率的影響較小。

圖7 加酶量與pH值對魚油提取率的響應面圖及等高線圖

如圖7所示，不同水平的加酶量對pH值的響應曲線最高值影響相對較小，而不同pH值對加酶量的響應曲線最高值影響比較高。從等高線圖可知，整個圖形呈近橢圓形，兩者之間的交互作用顯著。

3.4 最佳提取方案驗證

從上述的方差分析和響應面分析可知，加酶量、酶解溫度、pH值三因素對魚油提取率的影響均極顯著，且從這三個因素間交互作用的響應面圖和等高線圖可知，魚油提取率存在最高值。因此，對魚油提取率與影響因素之間關系的數(shù)學模型進行優(yōu)化分析，得到最高魚油提取率的最佳工藝參數(shù)條件為：加酶量2.08 %、酶解溫度38.34 ℃、pH值8.21、酶解時間180 min，預測魚油提取率為79.0 %。為了方便實際操作，選取魚油提取率的最佳工藝參數(shù)條件為：加酶量2.0 %、酶解溫度38 ℃、pH值8.20、酶解時間180 min，得到的實際魚油提取率78.66 %，這與預測值基本相吻合。因此，響應面法優(yōu)化得到的最佳工藝參數(shù)可靠性較高。

4 結論

帶魚內臟中含油量較高，酶解法提油具有提取率高、反應條件穩(wěn)定、有效成分損失少等優(yōu)點。本文采用響應面法優(yōu)化酶解提取帶魚內臟魚油，在篩選出最優(yōu)酶的基礎上，進行單因素和響應面優(yōu)化分析，胰蛋白酶酶解帶魚內臟提取魚油的效果最好，響應面法優(yōu)化得到的最佳工藝參數(shù)可靠性較高。

[1]謝超,鄧尚貴,夏松養(yǎng),等.帶魚下腳料蛋白水解物的營養(yǎng)成分分析[J].營養(yǎng)學報,2009,31(4):402-404.

[2]沈月新.水產食品學[M].北京:中國農業(yè)出版社,2001.

[3]黃鎮(zhèn)繁.帶魚下腳料蛋白質提取與分離研究[J].漁業(yè)現(xiàn)代化,2008,35(5):52-55.

[4]王曉龍.鮐魚魚油提取精制及抗氧化活性研究[D].舟山：浙江海洋學院,2014.

[5]楊小克.魷魚內臟的魚油提取工藝及綜合利用研究[D].青島：中國海洋大學，2012.

[6]郝淑賢,石紅,李來好.酶法提取鱘魚油工藝的研究[J].食品科學,2009,17(l):35-40.

[7]邵娜.劉學軍.胰蛋白酶法提取草魚內臟魚油工藝優(yōu)化[J].食品科學,2013,26(4):44-48.

[8]吳奎元.酶解帶魚內臟提取魚油及防止其氧化研究[D].福州：福建農林大學，2011.

Optimization of Enzyme Hydrolysis of Oil From Hairtail Viscera by Response Surface Method

QIU Xiao-ming1，XIE Jian-hua1,2

(1.Foods and Biology Engineering Department, Zhangzhou Institute of Technology, Zhangzhou Fujian 363000,China；2.The Applied Technical Engineering Center of Further Processing and Safety of Agricultural Products，Higher Education Institutions in Fujian Province， Zhangzhou Fujian 363000,China)

To optimize the extraction technique for oil from hairtail viscera by enzyme hydrolysis,based on the optimal enzyme, single factor and response surface method were used to optimize the enzymolysis conditions in the extraction process. The result showed that trypsin enzyme has the best effect on the extraction of hairtail viscera oil，and the optimal enzymolysis conditions was the amount of enzyme 2.08 %, enzymolysis temperature 38.34 ℃, the pH value 8.21, and the enzymolysis time 180 min. In actual operation, the optimal process conditions of hairtail viscera oil instead: the amount of enzyme 2.0 %, enzymolysis temperature 38 ℃, the pH value 8.20，the enzymolysis time 180 min，the oil extraction rate is 78.66 %, was consistent with the theoretical value. This suggested that the optimal enzymolysis conditions has high reliability.

response surface method; enzymolysis; hairtail; fish oil

2016-12-25

福建省自然科學基金項目“葡甘聚糖仿生膜的構建及性能研究”(2014J01378)；福建省中青年教師教育科研項目“采用魚加工下腳料為原料制備高純度魚膠原蛋白的研究”(JAT160870)。

邱小明(1979- )，男，講師，碩士，從事食品生物技術與生物化工研究。

Q503

A

2095-7602(2017)06-0070-07