倪善紅，湯道權(quán)，董 潔，，肖冰心，劉 云，李艷麗，孫增先#（.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港醫(yī)院/連云港市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇連云港 00；.徐州醫(yī)科大學(xué)藥物分析教研室，江蘇徐州 004）

UPLC-MS/MS法同時測定糖尿病模型大鼠血漿中沙格列汀及其代謝產(chǎn)物5-羥基沙格列汀濃度

倪善紅1，2＊，湯道權(quán)2，董 潔1，2，肖冰心1，劉 云1，李艷麗1，孫增先1#（1.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港醫(yī)院/連云港市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇連云港 222002；2.徐州醫(yī)科大學(xué)藥物分析教研室，江蘇徐州 221004）

目的：建立同時測定糖尿病模型大鼠體內(nèi)沙格列汀及其代謝產(chǎn)物5-羥基沙格列汀血藥濃度的方法。方法：采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。色譜柱為Waters BEH Shield RP18，流動相為10mmol/L乙酸銨-乙腈（70∶30，V/V），流速為0.3m L/m in，柱溫為30，進(jìn)樣量為10μL；掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測，正離子模式，各離子對為m/z 316.2→180.2（沙格列?。/z332.3→196.2（5-羥基沙格列?。/z304.2→153.9（維格列汀，內(nèi)標(biāo)）。取6只SD大鼠，復(fù)制糖尿病模型后，ig沙格列汀0.53mg/kg，于給藥前及給藥后0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0 h經(jīng)眼眶取血0.25m L，測定血漿中沙格列汀及其代謝物5-羥基沙格列汀的濃度，采用Win Nonlin 6.1軟件計算藥動學(xué)參數(shù)。結(jié)果：沙格列汀和5-羥基沙格列汀的質(zhì)量濃度線性范圍為0.1～100（r＝0.997 2）、0.2～200 ng/m L（r＝0.996 5），定量限分別為0.1、0.2 ng/m L，日內(nèi)（n＝5）、日間（n＝3）RSD均小于12%，準(zhǔn)確度為94.1%～105.4%、91.0%～103.6%，提取回收率分別為72.4%～87.3%、107.0%～115.3%（RSD均小于13.6%，n＝6），基質(zhì)效應(yīng)分別為105.9%～107.8%、83.5%～88.2%（RSD均小于10.3%，n＝6），穩(wěn)定性的RSD≤11.0%（n＝5）；藥動學(xué)參數(shù)cmax分別為（49.97±11.14）、（16.87±7.35）ng/m L，t1/2分別為（2.88±0.21）、（4.21±0.95）h，AUC0-24h分別為（90.95±7.06）、（49.13±5.33）ng·h/m L（n＝6）。結(jié)論：本方法簡便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，適用于沙格列汀及其代謝物5-羥基沙格列汀在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)研究。

沙格列汀；5-羥基沙格列?。谎帩舛?；藥動學(xué)；大鼠；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

圖1 二級碎片全掃描質(zhì)譜圖Fig 1 Full scanning production spectra of the secondary fragments

2.3 混合血漿樣品和質(zhì)控樣品的制備

精密吸取沙格列汀及5-羥基沙格列汀標(biāo)準(zhǔn)工作液各10μL，加入空白血漿80μL，渦旋混勻30 s，制成含沙格列汀質(zhì)量濃度為0.1、1、5、10、20、40、50、80、100 ng/m L及5-羥基沙格列汀質(zhì)量濃度為0.2、2、10、20、40、80、100、160、200 ng/m L的系列混合血漿樣品。

同法制備含沙格列汀低、中、高（0.4、25、75 ng/m L）及含5-羥基沙格列汀低、中、高（0.8、50、150 ng/m L）3個質(zhì)量濃度的混合質(zhì)控樣品。

取100μL血漿樣品于1.5m L離心管中，分別加入50 ng/m L內(nèi)標(biāo)溶液50μL、乙腈500μL，渦旋2min，以13 500 r/m in離心10m in；移取上清至1.5m L離心管中，室溫下氮氣吹干，殘留物用200μL 10%甲醇復(fù)溶，渦旋1m in，以13 500 r/m in離心5min，取上清液10μL，進(jìn)樣測定。

2.5 專屬性考察

分別取6只大鼠空白血漿樣品（不加內(nèi)標(biāo)）、空白血漿加入沙格列汀和5-羥基沙格列汀、大鼠給藥0.5 h后收集的血漿樣品，均按“2.4”項下方法處理后，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果，沙格列汀、5-羥基沙格列汀及內(nèi)標(biāo)的保留時間分別為1.29、1.09、1.15m in；在保留時間0.74min處，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性物質(zhì)峰，但不干擾沙格列汀、5-羥基沙格列汀及內(nèi)標(biāo)的測定，為了盡量減少內(nèi)源性物質(zhì)對儀器的污染，0.8min之前的組分切到質(zhì)譜外，色譜圖見圖2。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限考察

圖2 超高效液相色譜圖Fig 2 UPLC chromatogram s

取“2.3”項下系列混合血漿樣品，按照“2.4”項下方法處理后，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，以待測物質(zhì)量濃度（ng/m L）為橫坐標(biāo)（x）、待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果，沙格列汀、5-羥基沙格列汀的回歸方程分別為y＝4.7×10－3x－5.63×10－5（r＝0.997 2）、y＝1.06×10－3x+5.53×10－（7r＝0.996 5），線性范圍分別為0.1～100、0.2～200 ng/m L，定量下限分別為0.1、0.2 ng/m L。

2.7 精密度、準(zhǔn)確度、提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)與穩(wěn)定性試驗

按照相關(guān)要求進(jìn)行操作。結(jié)果，沙格列汀和5-羥基沙格列汀的日內(nèi)（n＝5）、日間（n＝3）精密度試驗峰面積的RSD均小于12%；準(zhǔn)確度為94.1%～105.4%、91.0%～ 103.6%；提取回收率分別為72.4%～87.3%、107.0%～115.3%（RSD均小于13.6%，n＝6）；基質(zhì)效應(yīng)分別為105.9%～107.8%、83.5%～88.2%（RSD均小于10.3%，n＝6）；穩(wěn)定性試驗（室溫放置24 h、－80和室溫下反復(fù)凍融3次、－80凍存90 d及吹干后殘渣在室溫放置24 h）峰面積的RSD≤11.0%（n＝5）。

2.8 藥動學(xué)研究

賈榮林[31]根據(jù)PID算法原理設(shè)計了空氣源熱泵熱水器中電子膨脹閥的控制測試系統(tǒng)，并取得了良好的控制效果，極好地解決了系統(tǒng)的適應(yīng)性和運(yùn)行的節(jié)能性，從應(yīng)用的角度證明了電子膨脹閥在空氣源熱泵熱水器系統(tǒng)中的優(yōu)越性。

取6只大鼠，高脂飼料喂養(yǎng)1個月后，ip鏈脲佐菌素誘導(dǎo)T2DM模型。造模前禁食、自由飲水12 h。按臨床上沙格列汀給藥劑量進(jìn)行換算，ig 0.53mg/kg沙格列汀溶液，分別于給藥前和給藥后0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0 h經(jīng)大鼠眼眶靜脈叢取血0.25m L，置于經(jīng)抗凝處理的離心管中，3 500 r/m in離心5m in，分離血漿，置于－80冰箱保存，備用。采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法測定不同時間點的沙格列汀和5-羥基沙格列汀的血藥濃度，藥-時曲線見圖3。采用Win Nolin 6.1軟件按照非房室模型進(jìn)行處理，計算藥動學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表1。

圖3 沙格列汀與5-羥基沙格列汀在糖尿病模型大鼠體內(nèi)的藥-時曲線Fig 3 Concentration-time curvesof saxagliptin and 5-hydroxy saxagliptin in diabeticmodel rats in vivo

表1 沙格列汀與5-羥基沙格列汀在糖尿病模型大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）Tab 1 Pharm cokinetic parameters of saxagliptin and 5-hydroxy saxagliptin in diabeticmodel rats in vivo（±s，n＝6）

表1 沙格列汀與5-羥基沙格列汀在糖尿病模型大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）Tab 1 Pharm cokinetic parameters of saxagliptin and 5-hydroxy saxagliptin in diabeticmodel rats in vivo（±s，n＝6）

藥動學(xué)參數(shù)t1/2，h tmax，h cmax，ng/mL AUC0-24h，ng·h/mL AUC0-∞，ng·h/mL沙格列汀2.88±0.21 0.25±0.01 49.97±11.14 90.95±7.06 91.72±7.57 5-羥基沙格列汀4.21±0.95 0.54±0.10 16.87±7.35 49.13±5.33 51.85±4.85

3 討論

本文建立了穩(wěn)定性好、通用性強(qiáng)、可靈敏快速測定大鼠血漿中沙格列汀及其代謝物5-羥基沙格列汀血藥濃度的方法，并成功地應(yīng)用于大鼠藥動學(xué)研究。本實驗起初采用BEH C18色譜柱，使用甲醇作為流動相，結(jié)果5-羥基沙格列汀的定量下限達(dá)不到檢測要求；在流動相中添加乙腈后5-羥基沙格列汀的響應(yīng)值提高，但檢測物峰形變差。使用Waters BEH Shield RP18色譜柱摸索方法時流動相水相嘗試過0.1%甲酸、0.1%甲酸-5mmol/L甲酸銨，但是隨著水相比例的增加檢測物的峰形變差且分叉成雙峰，故選擇不添加甲酸，且試驗發(fā)現(xiàn)添加乙酸銨比添加甲酸銨靈敏度高、響應(yīng)好，故最終選擇10mmol/L乙酸銨-乙腈作為流動相體系。

樣品處理時考慮到沙格列汀游離堿在水中微溶，在二氯甲烷及乙酸乙酯中溶解，但5-羥基沙格列汀的水溶性好，用乙酸乙酯、二氯甲烷基本無法提取，因此液液萃取同時提取兩者比較困難，常規(guī)的液液萃取處理方法不適合該血漿樣品的處理。而乙腈蛋白質(zhì)沉淀法處理血漿樣品的基質(zhì)效應(yīng)及提取回收率均滿足相關(guān)的要求[11]，故最終采用乙腈蛋白質(zhì)沉淀法預(yù)處理。

綜上所述，本研究建立的方法簡便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，適用于沙格列汀及其代謝產(chǎn)物5-羥基沙格列汀在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)研究。

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[11] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：363-368.

（編輯：劉明偉）

Simultaneous Concentration Determ ination of Saxagliptin and Its M etabolite 5-hydroxy Saxagliptin in Plasma of Diabetic M odel Rats by UPLC-MS/M S

NIShanhong1，2，TANG Daoquan2，DONG Jie1，2，XIAO Bingxin1，LIU Yun1，LIYanli1，SUN Zengxian1（1.Dept.of Pharmacy，Lianyungang Hospital Affiliated to Xuzhou Medical University/the First People’s Hospital of Lianyungang City，Jiangsu Lianyungang 222002，China；2.Teaching and Research Section of Drug Analysis，Xuzhou Medical University，Jiangsu Xuzhou 221004，China）

OBJECTIVE：To establish amethod for the simultaneous concentration determ ination of saxagliptin and itsmetabolite 5-hydroxy saxagliptin in diabetic model rats in vivo.METHODS：UPLC-MS/MSwas performed on the column of Waters BEH

沙格列汀（Saxagliptin，SAX）是一種強(qiáng)效、具有選擇性的二肽基肽酶4（DPP-4）抑制劑，用于治療2型糖尿?。═2DM）[1-2]。DPP-4可裂解腸促胰素，腸促胰素主要包括胰高血糖素樣肽1（GLP-1）和葡萄糖依賴的促胰島素分泌多肽（GIP），GLP-1具有葡萄糖依賴性促胰島素分泌的特性，可在血糖升高時發(fā)揮促胰島素分泌作用，在血糖恢復(fù)正常時消失；同時，GLP-1還可促進(jìn)胰島B細(xì)胞增殖，改善其功能[3]。體內(nèi)產(chǎn)生的GLP-1半衰期僅為1.5～2min，其氨基末端前2個氨基酸可被DPP-4快速裂解而失去促胰島素分泌活性，使GLP-1無法在體內(nèi)達(dá)到治療濃度[4]。DPP-4抑制劑通過競爭性結(jié)合DPP-4活化部位，降低酶的催化活性，抑制GLP-1降解，提升內(nèi)源性GLP-1的濃度，促進(jìn)餐后胰島素分泌，改善T2DM患者的血糖水平[5-6]。

沙格列汀在體內(nèi)經(jīng)細(xì)胞色素P4503A4/5代謝，主要代謝產(chǎn)物為5-羥基沙格列汀（5-hydroxy saxagliptin），其代謝產(chǎn)物也是一種選擇性DPP-4抑制劑，活性是沙格列汀的50%[7]。目前，同時檢測生物樣品中沙格列汀及其代謝產(chǎn)物5-羥基沙格列汀的文獻(xiàn)報道較少[8-10]。因此，本研究建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）同時測定沙格列汀和5-羥基沙格列汀在大鼠體內(nèi)的血藥濃度，計算相關(guān)藥動學(xué)參數(shù)，為其進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Eksigent Ekspert Ultra LC110 XL超高效液相色譜（UPLC）儀、AB Qtrap 4500質(zhì)譜儀（美國Applied Biosystems公司）；T1氮氣發(fā)生器（瑞士普利賽斯公司）；AE-240電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；Peqlab多功能高速離心機(jī)（德國Deutschland公司，離心半徑：8.4 cm）。

1.2 藥品與試劑

沙格列汀一水合物（以下簡稱沙格列?。φ掌罚ㄠ嵵萑A文化學(xué)品有限公司，批號：SG-31504001，純度：94.36%）；5-羥基沙格列汀對照品（批號：20160303，純度：95.6%）、維格列汀對照品（內(nèi)標(biāo)，批號：20151203，純度：99.5%）均購自江蘇豪森藥業(yè)有限公司；鏈脲佐菌素（美國Sigma公司，批號：B57426，純度：99.89%）；乙腈為色譜純；乙酸銨為分析純。

1.3 動物

SPF級SD大鼠，♂，體質(zhì)量為80～120 g，由徐州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司（實驗動物許可證號：SCXK[滬]2013-0016）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與質(zhì)譜條件

色譜柱：Waters BEH Shield RP1（8100mm×2.1mm，1.7μm）；流動相：10 mmol/L乙酸銨-乙腈（70∶30，V/ V）；流速：0.3m L/m in；柱溫：30；進(jìn)樣量：10μL。

采用電噴霧電離源（ESI），以多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式掃描，正離子方式檢測。離子化電壓：5 500 V；溫度：550；噴霧氣（N2）壓力：50 psi（1 psi＝6.859×10－3MPa）；輔助加熱氣（N2）壓力：60 psi；氣簾氣體（N2）壓力：35 psi；碰撞氣模式：Medium；掃描時間：100ms。用于定量分析的離子對為：m/z 316.2→180.2（沙格列?。?、m/z 332.3→196.2（5-羥基沙格列?。?、m/z 304.2→153.9（內(nèi)標(biāo)），取“2.2”項下標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)樣測定，質(zhì)譜圖見圖1。

2.2 溶液的制備

精密稱取沙格列汀對照品、5-羥基沙格列汀對照品各適量，用50%乙腈溶解并稀釋，制成質(zhì)量濃度均為1 mg/m L的對照品貯備液，置于4冰箱保存。對照品貯備液用10%甲醇稀釋成相應(yīng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，備用。

精密稱取維格列汀（內(nèi)標(biāo)）對照品適量，用50%乙腈溶解并稀釋，制成質(zhì)量濃度為1mg/m L的內(nèi)標(biāo)貯備液。內(nèi)標(biāo)貯備液用10%甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為50 ng/m L的 Shield RP18w ith mobile phase of 10 mmol/L ammonium acetate-acetonitrile（70∶30，V/V）at a flow rate of 0.3 m L/m in，column temperature was 30，and injection volume was 10μL.Scanning mode was multi-reactive monitoring w ith positive ion mode，and each ion pair was m/z 316.2→180.2（saxagliptin），m/z 332.3→196.2（5-hydroxy saxagliptin）and m/z 304.2→153.9（vildagliptin，internal standard）.6 SD rats were selected and intragastric adm inistred saxagliptin 0.53 mg/kg after inducing diabetic models.Blood sample 0.25 m L was taken from eyes before administration and after 0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，2.0，4.0，6.0，8.0，12.0，24.0 h of adm inistration.Plasma concentration of saxagliptin and itsmetabolite 5-hydroxy saxagliptin were determ ined，and Win Nonlin 6.1 software was used to calculate the pharmacokinetic parameters.RESULTS：The mass concentration of saxagliptin and 5-hydroxy saxagliptin ranged in 0.1-100，0.2-200 ng/m L（r＝0.997 2，0.996 5）；lim its of quantitation were 0.1，0.2 ng/m L；inter-day and intra-day RSDs were less than 12%（n＝5，3）；accuracy was 94.1%-105.4%，91.0%-103.6%；extraction recoveries were 72.4%-87.3%，107.0%-115.3%（RSD＜13.6%，n＝6）；matrix effects were 105.9%-107.8%，83.5%-88.2%（RSD＜10.3%，n＝6）；RSD of stability was less than 11.0%（n＝5），respectively；and pharmacokinetic parameters as cmaxwere（49.97± 11.14），（16.87±7.35）ng/m L，t1/2were（2.88±0.21），（4.21±0.95）h，AUC0-24hwere（90.95±7.06），（49.13±5.33）ng·h/m L（n＝6）.CONCLUSIONS：Themethod is simple，accurate，specific，and suitable for the pharmacokinetics research of saxagliptin and itsmetabolite 5-hydroxy saxagliptin in diabetic rats in vivo.

Saxagliptin；5-hydroxy saxagliptin；Plasma concentration；Pharmacokinetics；Rat；UPLC-MS/MS內(nèi)標(biāo)溶液，置于4冰箱保存，備用。

R917

A

1001-0408（2017）16-2201-04

2016-12-29

2017-04-13）

＊碩士研究生。研究方向：體內(nèi)藥物分析。電話：0518-85605518。E-mail：nshwp@126.com

#通信作者：主任藥師，博士。研究方向：體內(nèi)藥物分析。電話：0518-85605518。E-mail：sunzx715@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.16.11