王燕，孫國(guó)祥

（1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理671000；2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽(yáng)110016）

紫外聯(lián)合紅外光譜指紋圖譜整合評(píng)價(jià)三黃片質(zhì)量

王燕1,2，孫國(guó)祥2*

（1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理671000；2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽(yáng)110016）

目的：整合評(píng)價(jià)不同來(lái)源的30批三黃片樣品質(zhì)量。方法：建立三黃片紫外指紋圖譜和紅外指紋圖譜檢測(cè)方法，將兩種分析方法結(jié)果取均值整合后評(píng)價(jià)樣品質(zhì)量。結(jié)果：整合后的大部分樣品質(zhì)量等級(jí)均在合格范圍內(nèi)（質(zhì)量等級(jí)≤5）。結(jié)論：任何一種檢測(cè)方式都具有單一片面性，不能全面表征樣品真實(shí)質(zhì)量，需采用多種分析方法并用、全方位整合的技術(shù)手段才能客觀綜合地對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，為中藥在其復(fù)雜組分未完全分離的情況下，提供了一種簡(jiǎn)捷快速、全面客觀的定性定量質(zhì)控研究方法。

三黃片；紫外指紋圖譜；紅外指紋圖譜

三黃片由醫(yī)圣張仲景《金匱要略》中經(jīng)典名方“三黃瀉心湯”衍化而來(lái)，收載于歷版《中國(guó)藥典》。組方由大黃、黃芩浸膏和鹽酸小檗堿組成，主要成分為蒽醌類、黃酮類和生物堿類化合物，具備抗炎、抑菌、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理活性，擁有瀉火通便、清熱解毒等功效，因用于治療咽喉腫痛、口鼻生瘡、尿黃便秘、牙齦腫痛〔1〕等癥而被臨床廣泛應(yīng)用。目前，對(duì)其質(zhì)量控制的文獻(xiàn)報(bào)道主要集中在某一個(gè)或某幾個(gè)成分的定量分析以及定性指紋圖譜研究方面〔2-11〕，眾所周知，僅采用單一或少數(shù)幾個(gè)指標(biāo)成分進(jìn)行檢測(cè)不足以表征中藥尤其是復(fù)方制劑整體質(zhì)量。隨著科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展和現(xiàn)代分析技術(shù)手段的不斷提高，許多專家學(xué)者指出，中藥質(zhì)量應(yīng)以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)思想，以中藥整體觀為基礎(chǔ)，體現(xiàn)多種分析技術(shù)檢測(cè)相結(jié)合的控制模式。

中藥指紋圖譜分析方法大多數(shù)以色譜指紋圖譜為主，而光譜指紋圖譜，如紫外指紋圖譜和紅外指紋圖譜因樣品前處理簡(jiǎn)單、分析時(shí)間較短，檢測(cè)成本低廉等特點(diǎn)受到廣大分析工作者的日益關(guān)注。紫外光譜反映樣品中不飽和化學(xué)鍵（如雙鍵、三鍵、共軛體系及雜原子成分）的特征規(guī)律信息，常用于植物種類的分類判別、相似度評(píng)價(jià)或質(zhì)量一致性研究等，紅外光譜反映的是樣品中化學(xué)鍵振動(dòng)轉(zhuǎn)動(dòng)而產(chǎn)生的特征信息，具備信息量豐富且具有特征性和指紋性等特點(diǎn)，因此光譜指紋圖譜可以輔助色譜指紋圖譜從整體上實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥質(zhì)量的控制。

綜上考慮，筆者從多種分析方法聯(lián)合、多維信息獲取、全方位整合、優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)的角度出發(fā)，建立三黃片樣品紫外指紋圖譜和紅外指紋圖譜，將兩種分析方法結(jié)果平均整合后，評(píng)價(jià)30批樣品質(zhì)量，力求簡(jiǎn)捷準(zhǔn)確地反映其化學(xué)物質(zhì)的整體含量特征，為該中藥制劑的質(zhì)量分析提供一種全面合理的檢測(cè)手段。

1 材料

1.1 儀器Agilent1100型液相色譜儀（配有DAD檢測(cè)器，低壓四元梯度泵，在線脫氣裝置，自動(dòng)進(jìn)樣器）；Chemstation工作站（Agilent科技有限公司）；Sarturius-BS110S分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；BRUKER IFS55型紅外分光光度儀（瑞士布魯克公司）；AG285電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.2 試藥來(lái)自19個(gè)廠家的30批三黃片樣品均購(gòu)自沈陽(yáng)各藥店（編號(hào)S1～S30），樣品信息見(jiàn)表1；色譜級(jí)甲醇購(gòu)于山東禹王實(shí)業(yè)有限公司；其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

表1 30批三黃片樣品來(lái)源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件

2.1.1 紫外指紋圖譜分析聚四氟乙烯管（650 mm× 0.12 mm），柱溫：（30.0±0.15）℃，流動(dòng)相：甲醇，流速：0.8 mL∕min，進(jìn)樣量：0.2μL。檢測(cè)波長(zhǎng)：190～400 nm（DAD檢測(cè)器）。

2.1.2 紅外指紋圖譜分析Bruker IFS-55型傅立葉紅外分光光度儀；DTGS型檢測(cè)器；波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1；升溫速度為2℃∕min；掃描速度為20次∕s；分辨率為8 cm-1。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 紫外指紋圖譜分析取本品數(shù)片，除去包衣，研細(xì)（過(guò)三號(hào)篩），取約0.3 g，精密稱定，加95%乙醇20 mL回流提取2次，每次各1 h，合并濾液，減壓濃縮至約20 mL，用95%乙醇定容至25 mL，搖勻，即得供試品溶液。

2.2.2 紅外指紋圖譜分析取本品1片，除去包衣并研磨成極細(xì)粉（過(guò)200目篩），取約1 mg，置瑪瑙研缽中，加入干燥的KBr極細(xì)粉約200 mg，充分研磨混勻，轉(zhuǎn)移至模具中，使平鋪均勻，制成透明供試片后置于樣品光路中，扣除用同法制成的空白KBr片的背景干擾，記錄相應(yīng)光譜圖。

2.3 線性定量指紋法原理在色譜條件固定的前提下，色譜峰面積在一定程度上與樣品組分含量呈線性關(guān)系〔12〕，故中藥復(fù)雜化學(xué)體系定量研究具有線性屬性關(guān)系。線性定性相似度SL見(jiàn)公式1。用以表征樣品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜所含化學(xué)成分在整體指紋數(shù)量和分布比例上的相似程度，其中r和r′分別為線性回歸方程中正向相關(guān)系數(shù)和反向相關(guān)系數(shù)；線性定量相似度ML見(jiàn)公式2。用以表征樣品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜所含化學(xué)成分整體含量的相似程度，其中b為線性回歸方程中的斜率，a為誤差項(xiàng)，另外，指紋均化性變異系數(shù)α見(jiàn)公式3，也用來(lái)表征樣品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的信號(hào)分布均一程度。因此，采用SL、ML和α相結(jié)合綜合評(píng)價(jià)中藥及其制劑整體質(zhì)量水平的方法稱為線性定量指紋法，據(jù)此可將中藥質(zhì)量等級(jí)劃分為8級(jí)。等級(jí)越高的樣品，其質(zhì)量越差。見(jiàn)表2。

2.4 三黃片紫外指紋圖譜的建立和評(píng)價(jià)

2.4.1 方法學(xué)考察精密度試驗(yàn)：取S2樣品，按“2.2.1”制備1份，按“2.1.1”檢測(cè)條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以254 nm非分離色譜圖考察精密度，計(jì)算保留時(shí)間和峰面積RSD均分別小于1.0%和3.0%，表明檢測(cè)系統(tǒng)穩(wěn)定，精密度良好。

表2 線性定量指紋法質(zhì)量等級(jí)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取S2樣品，按“2.2.1”制備1份，分別在樣品制備后0、2、4、8、12和24 h，按“2.1.1”檢測(cè)條件進(jìn)樣測(cè)定，以254 nm非分離色譜圖考察穩(wěn)定性，計(jì)算保留時(shí)間和峰面積RSD均分別小于1.0%和3.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)較穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取S2樣品，按“2.2.1”制備6份，按“2.1.1”檢測(cè)條件進(jìn)樣測(cè)定，以254 nm非分離色譜圖考察重復(fù)性，計(jì)算保留時(shí)間和峰面積RSD均分別小于1.0%和3.0%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.2 紫外指紋圖譜的建立將30批三黃片樣品依次進(jìn)樣檢測(cè)，記錄190～400 nm在線紫外光譜圖，見(jiàn)圖1A，在210～230 nm，260～300 nm紫外吸收信號(hào)較強(qiáng)，提示黃酮及其苷類，蒽醌類的紫外光譜特征。將樣品信號(hào)導(dǎo)入自主研發(fā)的“中藥光譜指紋圖譜超信息特征數(shù)字化評(píng)價(jià)系統(tǒng)3.0”軟件，以各數(shù)據(jù)點(diǎn)為計(jì)量單元按均值法生成對(duì)照指紋圖譜并根據(jù)線性定量指紋法計(jì)算各樣品SUV、MUV和αUV值，所得質(zhì)量結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4.3 線性定量指紋法評(píng)價(jià)三黃片紫外指紋圖譜整體質(zhì)量由表3可知，8個(gè)質(zhì)量等級(jí)都分配給了所有樣品，可見(jiàn)來(lái)自19個(gè)廠家的30批樣品質(zhì)量差異顯著，例如S23為1級(jí)屬最優(yōu)產(chǎn)品，相反，S8、S17、S18、S28和S30均為8級(jí)屬最次產(chǎn)品。所有樣品SUV≥0.90，46.3%≤MUV≤253.8%，說(shuō)明30批樣品紫外指紋數(shù)量和分布比例較為相似，但整體含量存在明顯差別。其中11批產(chǎn)品質(zhì)量等級(jí)＞5級(jí)，歸其原因主要為定量相似度MUV值的顯著差異，如S8、S12、S18、S20、S28和S30因MUV值過(guò)高（145%～253%）致使質(zhì)量等級(jí)≥6級(jí)；S17、S21、S22、S25和S27因MUV值過(guò)低（46%～67%）導(dǎo)致質(zhì)量等級(jí)≥6級(jí)。另外，來(lái)自同一生產(chǎn)廠家的藥品質(zhì)量一致性也略有差別，例如，S1和S2（購(gòu)自于百善唐威藥業(yè)有限公司）擁有相同或相似的質(zhì)量等級(jí)，分別為2級(jí)和3級(jí)；而S25、S26和S27（購(gòu)自于亞寶藥業(yè)）卻擁有不同的質(zhì)量等級(jí)，分別為6級(jí)、4級(jí)和7級(jí)。

2.5 三黃片紅外指紋圖譜的建立和評(píng)價(jià)

2.5.1 方法學(xué)考察精密度試驗(yàn)：取S2樣品，按“2.2.2”制備1份，按“2.1.2”檢測(cè)條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄光譜圖，導(dǎo)入“中藥光譜指紋圖譜評(píng)價(jià)系統(tǒng)3.0”軟件，計(jì)算SIR≥0.995且RSD為0.13%，表明精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取S2樣品，按“2.2.2”制備1份，分別在樣品制備后0、1、2、3、4和6 h，按“2.1.2”檢測(cè)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄光譜圖，導(dǎo)入軟件，計(jì)算SIR≥0.990且RSD為0.26%，表明樣品在6 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取S2樣品，按“2.2.2”平行制備6份，按“2.1.2”檢測(cè)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄光譜圖，導(dǎo)入軟件，計(jì)算SIR≥0.990且RSD為0.58%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.5.2 紅外指紋圖譜的建立將30批三黃片樣品依次壓片檢測(cè)，記錄光譜圖，見(jiàn)圖1B，3 600～3 000 cm-1大寬峰為黃酮類或酚酸類羥基伸縮振動(dòng)引起；2 900 cm-1附件的吸收峰為亞甲基反對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起；1 800～1 500 cm-1的吸收峰為羧酸類或酯類羰基伸縮振動(dòng)引起；將樣品信號(hào)導(dǎo)入“中藥光譜指紋圖譜評(píng)價(jià)系統(tǒng)3.0”軟件，按均值法生成對(duì)照指紋圖譜并根據(jù)線性定量指紋法計(jì)算各樣品SIR、MIR和αIR值，所得質(zhì)量結(jié)果見(jiàn)表3。

2.5.3 線性定量指紋法評(píng)價(jià)三黃片紅外指紋圖譜整體質(zhì)量由表3可知，樣品質(zhì)量差異較大，2批樣品（S17和S28）為1級(jí)；5批（S4、S7～S9和S27）為4級(jí)；5批（S14、S16、S22和S29、S30）為5級(jí)；4批（S10、S20和S23、S24）為6級(jí)；3批（S1、S2和S26）為7級(jí)；S3為8級(jí)；其余10批為3級(jí)。所有樣品SIR≥0.94，但65.6%≤MIR≤168.8%，說(shuō)明30批樣品紅外指紋數(shù)量和分布比例較為相似，但指紋整體含量存在明顯差別。S1、S2、S3和S26因MIR值過(guò)高（＞140%）未達(dá)到質(zhì)量等級(jí)≤5為合格樣品的要求；而S10、S20、S23和S24則因MIR值過(guò)低（＜70%）。

表3 30批三黃片紫外指紋圖譜和紅外指紋圖譜相似度測(cè)定結(jié)果

2.6 整合兩種分析方法評(píng)價(jià)三黃片的質(zhì)量為避免單一方法評(píng)價(jià)的片面性，實(shí)現(xiàn)從多維角度、多方位整合評(píng)價(jià)中藥整體質(zhì)量，根據(jù)公式4～6對(duì)紫外指紋圖譜和紅外指紋圖譜分析結(jié)果進(jìn)行整合，由表3可知，整合后的各樣品等級(jí)差異有所縮小，除S8和S18為8級(jí)，S22、S27和S28為6級(jí)外，其余樣品等級(jí)均在5級(jí)以內(nèi)且以1級(jí)、2級(jí)和3級(jí)居多。

圖1 30批三黃片樣品紫外（A）和紅外（B）光譜圖

圖2 不同評(píng)價(jià)方法得到的樣品質(zhì)量等級(jí)

2.7 不同分析方法的評(píng)價(jià)結(jié)果比較圖2描繪了三黃片在不同分析方法下的質(zhì)量等級(jí)情況，采用不同檢測(cè)方法得到的樣品等級(jí)不同，如S7在紫外指紋圖譜、紅外指紋圖譜和整合法時(shí)質(zhì)量等級(jí)分別為5、4和1級(jí)，差異較大，更進(jìn)一步說(shuō)明任何一種檢測(cè)方式因檢測(cè)原理不同都具有單一片面性，不能全面表征樣品真實(shí)質(zhì)量，需采用多種分析方法并用、全方位整合的方式才能客觀綜合地對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。鑒于同一檢測(cè)方式的各批樣品質(zhì)量差異主要來(lái)源于定量相似度這一現(xiàn)象，對(duì)上述不同分析方法得到的定量相似度作圖。見(jiàn)圖3。

3 討論

本文采用紫外指紋圖譜聯(lián)合紅外指紋圖譜共同評(píng)價(jià)三黃片質(zhì)量，運(yùn)用多種分析技術(shù)共同監(jiān)測(cè)樣品中飽和、不飽和鍵的化學(xué)成分信息，試圖揭示各類化學(xué)組分的整體含量特征，從多角度展現(xiàn)中藥質(zhì)量全貌，為中藥在其復(fù)雜組分未完全分離的情況下，提供了一種簡(jiǎn)捷快速全面客觀的定性定量質(zhì)控研究方法。

圖3 不同評(píng)價(jià)方法得到的樣品定量相似度結(jié)果

指紋圖譜表征中藥化學(xué)成分整體概況，但無(wú)法獲取相關(guān)藥效活性信息，指紋圖譜表征的成分是否代表藥效活性成分，與藥效相關(guān)程度如何，樣品質(zhì)量等級(jí)差異是否與藥效活性成分含量數(shù)量有直接相關(guān)關(guān)系目前尚未闡明，而且未經(jīng)藥效學(xué)驗(yàn)證的化學(xué)指紋也有可能為無(wú)效成分。因此，構(gòu)建化學(xué)組分與生物活性之間關(guān)聯(lián)度的譜效關(guān)系模型將在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究中開(kāi)展并進(jìn)行報(bào)導(dǎo)。

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The Integrated Use of Ultraviolet Spectrum Fingerprint Coupled with Infrared Spectrum Fingerprint to Comprehensively Assess the Quality Grades of San-huang Tablets

Wang Yan1,2，Sun Guoxiang2*
（1.College ofPharmacy and Chemistry,DaliUniversity,Dali,Yunnan 671000,China；2.College ofPharmacy,Shenyang PharmaceuticalUniversity,Shenyang 110016,China）

Objective:To comprehensively evaluate the quality grades of 30 batches of San-huang tablets from diverse commercial brands.Methods:Ultraviolet spectrum fingerprint and infrared spectrum fingerprint were developed for the measurement of Sanhuang tablets.To evaluate the quality of the drug samples,SL,MLandαvalues were computed for each analytical method,and the integrated SL,MLandαvalues were also calculated by taking the average value of the above-established method.Results:Mostofthe samples were qualified（quality grade≤5）after the use of integrated method.Conclusion:Any detection method is single and onesided,and could notoverallcharacterize the tested samples,which reminds us thatitis essentialto adoptmulti-approaches to disclose the quality information oftraditional Chinese medicine and herbalpreparations.The strategy proposed in this study provides a simple, fast,comprehensive and objective approach for the quality control of traditional Chinese medicine and herbal preparations from both the qualitative and quantitative aspects,in the case thatcomplex components are notyetcompletely separated.

San-huang tablets;ultravioletspectrum fingerprint;infrared spectrum fingerprint

O657

A

2096-2266（2017）06-0031-06

10.3969∕j.issn.2096-2266.2017.06.008

（責(zé)任編輯李楊）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81560695）；大理大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目（KYBS201512）

2016-10-18

2016-12-01

王燕，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，博士，主要從事中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和體內(nèi)藥物分析研究.

*通信作者：孫國(guó)祥，教授，博士.