毛亮 程俊 黃文俊 譚曉秋 黨喜同 曾曉榮 楊艷

(西南醫(yī)科大學心血管醫(yī)學研究所 醫(yī)學電生理教育部重點實驗室，四川 瀘州 646000)

論 著

可誘導穩(wěn)定表達大電導鈣激活鉀通道的細胞系構建及蛋白質純化*

毛亮 程俊 黃文俊 譚曉秋 黨喜同 曾曉榮 楊艷△

(西南醫(yī)科大學心血管醫(yī)學研究所 醫(yī)學電生理教育部重點實驗室，四川 瀘州 646000)

目的：旨在構建穩(wěn)定表達人大電導鈣激活鉀通道(BKCa)的穩(wěn)定細胞系并對重組蛋白分離純化。方法：利用基因工程技術將人腸系膜動脈平滑肌BKCa編碼基因克隆到表達載體pcDNA5/FRT/TO/FLAG，并轉染Flp-InTMT-RExTM-293宿主細胞，用潮霉素B篩選建立穩(wěn)定表達的單克隆細胞系。BKCa-pcDNA5-293細胞系經四環(huán)素誘導后，用anti-FLAG抗體對表達的BKCa蛋白質進行純化。用western blot檢測BKCa通道蛋白質的表達，用單通道膜片鉗檢測通道的電生理特性。結果：BKCa-pcDNA5-293細胞系經四環(huán)素誘導后表達了高水平的BKCa-FLAG融合蛋白，BKCa通道電導值為213.39±9.52 pS(n=15，cell-attached)和225.72±10.61 pS(n=13，inside-out)，BKCa通道具有典型的大電導特性、電壓依賴性、Ca2+依賴性及IbTX敏感性，與在體的人腸系膜動脈平滑肌BKCa通道具有相同的特征。純化后的BKCa蛋白質條帶單一，純度約為89%。結論：成功構建BKCa-pcDNA5-293細胞系并獲得純化的BKCa蛋白質，為進一步深入研究通道功能及藥物篩選奠定了重要的基礎。

穩(wěn)定表達細胞系；BKCa重組蛋白質；膜片鉗

大電導鈣激活鉀通道(Large conductance potassium channels，BKCa)廣泛分布于血管平滑肌、心肌、腦、氣道平滑肌等組織，在調節(jié)平滑肌張力、神經遞質釋放和神經元興奮[1]及保護心肌[2]等方面發(fā)揮了重要作用。研究表明，多種藥物及化合物都通過激活BKCa通道發(fā)揮作用，BKCa通道已成為高血壓[3-7]、癲癇[8-10]、腦卒中[11, 12]、耳鳴[13]、哮喘[14]、膀胱活動過度癥[15, 16]等多種疾病治療及藥物篩選的重要靶點。體外重建BKCa通道是研究其作用機制及藥物篩選的重要手段。本文旨在用基因工程技術克隆人腸系膜動脈BKCa通道基因，構建穩(wěn)定表達的HEK293單克隆細胞系，并純化BKCa通道蛋白質，為BKCa通道的功能研究及其在人工脂質膜上的體外重建準備條件。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

人腸系膜動脈血管取自西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院手術廢棄的組織。表達載體pcDNA5/FRT/TO/FLAG、POG44及Flp-InTMT-RExTM-293細胞為西南醫(yī)科大學傅俊江教授贈送。Trizol試劑、逆轉錄試劑盒、DNA聚合酶、Lipofectamine 3000轉染試劑盒、DMEM高糖培養(yǎng)基、FBS、Hygromycin B購自Thermo公司，BamHI、KpnI內切酶、T4連接酶購自New England Biolabs 公司，ANTI-FLAG M2 Affinity Gel 購自Sigma公司，anti-BKCa抗體購自 Alomone Labs，貨號APC-107， HRP偶聯的山羊抗兔二抗購自上海生工生物工程有限公司，貨號D110058， ECL發(fā)光試劑購自北京英格恩生物技術有限公司，其他試劑為國產分析純。

1.2 基因克隆

用Trizol法提取人腸系膜動脈RNA，取1 μg RNA進行逆轉錄合成cDNA，取1 μL cDNA，用BKCa基因特異性引物進行PCR擴增，其中上游引物包含了KpnI酶切位點，上游引物序列：5′-TCGGTACCAAGATGGATGCGCTCATCA-3′，下游引物包含了BamHI酶切位點，下游引物序列：5′-AAGGATCCAAGCCGCTCTTCCTGCACGTA-3′。

1.3 質粒構建

將BKCaPCR產物及pcDNA5/FRT/TO/FLAG質粒分別經KpnI、BamHI雙酶切，用PCR產物純化試劑盒純化，取20 μg pcDNA5/FRT/TO/FLAG線性質粒和60 μg BKCaDNA，用T4連接酶室溫連接2 h，轉化DH5α感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆，進行DNA測序鑒定。

1.4 細胞系建立

Flp-InTMT-RExTM-293 細胞在含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在6孔板中接種0.8×106個細胞，24 h后加入BKCa-pcDNA5/FRT/TO/FLAG和pOG44 質粒共轉染，將pcDNA5/FRT/TO/FLAG空載體和pOG44 共轉染作為對照。轉染48 h后，細胞中加入200 μg·ml-1的潮霉素B篩選，并挑選單克隆細胞。

1.5 Western blot檢測

BKCa-pcDNA5-293單克隆細胞中加入0.1 μg·ml-1四環(huán)素(Tetracycline，TET)，誘導24 h后收取細胞，用RIPA裂解液裂解(碧云天)，取30 μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳(分離膠10%，濃縮膠5%)，并將蛋白質轉印到PVDF膜上，PVDF膜用5%脫脂牛奶室溫封閉1h，加入anti-BKCa抗體(1:1000)或anti-FLAG 抗體(1:5000)4℃孵育過夜，0.1% TBST清洗3次，加入HRP偶聯的山羊抗兔二抗(1:3000)室溫孵育1 h，0.1% TBST清洗3次，用ECL發(fā)光試劑顯影。

1.6 膜片鉗檢測

BKCa-pcDNA5-293單克隆細胞接種在蓋玻片上，培養(yǎng)基中加入0.1 μg·ml-1TET，誘導24 h后進行單通道膜片鉗檢測。室溫下(20℃～25℃)，將蓋玻片放入盛有1 ml浴液浴槽中。微管玻璃內注入電極液(尖端阻抗10 MΩ)并置于放大器探頭上，操作微電極操縱器使微管電極浸入浴液，并與細胞表面接觸，施負壓形成高阻封接(阻抗≥10 GΩ)，形成細胞貼附式模式(Cell-attached patch)。高阻封接形成后，將電極尖端輕輕地提出液面，空氣中暴露約3 s后放入浴槽中，即可形成內面向外式(Inside-out patch)模式。形成細胞貼附式膜片模式后，短促負壓抽吸形成全細胞(Whole-cell)模式。Outside-out模式需要在whole-cell模式形成后拖動玻璃微電極形成。

本實驗中主要使用了單通道膜片鉗技術的cell-attached、inside-out patch和outside-out模式記錄BKCa-pcDNA5-293單克隆細胞的BKCa單通道電活動情況。EPC-10膜片鉗放大器和 Pulse software(Heka elektronik, Lambrecht, Germany)放大采集和分析電流信號。

Cell-attached和inside-out模式實驗中浴液成分(mmol·L-1)：KCl 40，K-aspartate 100，EGTA 1，HEPES 10(pH 7.40)，CaCl2根據Ca2+終濃度需要加入[17]；電極液成分(mmol·L-1)：KCl 100，K-aspartate 40，HEPES 10，EGTA 2(pH 7.20)。全細胞模式浴液成分(mmol·L-1)：NaCl 134，CaCl21.8，MgCl21，KCl 6，Glucose 10，HEPES 10(pH 7.40)；電極液成分(mmol·L-1)：K-aspartate 110，KCl 30，NaCl 10，MgCl21，EGTA 0.05，HEPES 10；(pH 7.20)。全細胞模式形成后即可形成outside-out模式再進行IbTX實驗。

1.7 蛋白質純化

pcDNA5/FRT/TO/FLAG質粒經過改造，加入了FLAG標簽，可用anti-FLAG antibody純化目的蛋白。BKCa-pcDNA5-293細胞經0.1 μg·ml-1TET誘導24 h 后用裂解液(50 mmol·L-1Tris HCl，pH 7.4，150 mmol·L-1NaCl，1 mmol·L-1EDTA，1% Triton X-100，蛋白酶抑制劑)進行裂解。取1 mg總蛋白加入到40 μl Anti-flag M2 affinity gel beads，4℃溫和旋轉混合過夜，以8200 g的轉速4℃離心1 min，棄上清，沉淀用PBS洗滌3次，沉淀中加入100 μl 3×FLAG peptide(150 ng·ml-1)，4℃溫和旋轉混勻30 min，以8200 g的轉速 4℃離心1 min，轉移上清，上清液中即為純化的BKCa重組蛋白，用Western blot進行檢測。

1.8 統計學處理

實驗數據用SPSS19.0和Origin8.0軟件進行統計學分析。數據采用平均值±標準差(X±SD)表示，采用配對t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BKCa-pcDNA5/FRT/TO/FLAG質粒構建

BKCa-pcDNA5/FRT/TO/FLAG質粒經KpnI和BamHI雙酶切后呈現兩條帶，見圖1，一條為pcDNA5/FRT/TO/FLAG線狀載體，長度約6 kb，另一條為BKCa插入片段，長度約3.4 kb，與插入的BKCaPCR產物片段長度一致，經DNA測序鑒定，BKCaDNA成功插入到pcDNA5/FRT/TO/FLAG質粒的KpnI和BamHI兩個酶切位點之間，FLAG標簽編碼基因融合在BKCaDNA 3′末端，閱讀框正確。

2.2 可誘導的BKCa-pcDNA5-293單克隆細胞系構建

將BKCa-pcDNA5/FRT/TO/FLAG和pOG44 質粒共轉染Flp-InTMT-RExTM-293 細胞，用潮霉素篩選建立單克隆細胞系。用FLAG抗體進行western blot檢測，見圖2，經四環(huán)素誘導的BKCa-pcDNA5-293細胞裂解液呈現清晰的BKCa-FLAG蛋白條帶，分子量約120 kDa，與理論結果一致，經四環(huán)素誘導的pcDNA5-293細胞裂解液在120 kDa處無蛋白條帶出現，表明BKCa基因成功轉入到293細胞，并正常翻譯成BKCa-FLAG融合蛋白質。在未經四環(huán)素誘導的BKCa-pcDNA5-293細胞中未檢測到BKCa-FLAG蛋白條帶，表明四環(huán)素是BKCa基因表達的必須條件，可利用四環(huán)素這個分子開關準確的控制BKCa基因的表達。

圖1 BKCa-pcDNA5/FRT/TO/FLAG質粒雙酶切鑒定注：Marker表示DNA分子量標準，1表示BKCa-pcDNA5質粒條帶，2表示BKCa-pcDNA5質粒經KpnI和BamHI雙酶切后出現2條帶，3表示BKCa PCR產物條帶。

圖2 四環(huán)素誘導BKCa-pcDNA5-293穩(wěn)定細胞系的BKCa蛋白質表達注：Marker表示標準分子量蛋白質，(+)表示細胞經TET誘導，(-)表示細胞無TET誘導。

2.3 BKCa通道的基本特性

為驗證BKCa蛋白質是否具有正常的通道功能，本研究通過單通道膜片鉗實驗進行檢測，結果顯示，BKCa通道具有典型的電壓依賴性及大電導特性，具有明顯的Ca2+依賴性及IbTX敏感性。

2.3.1 BKCa的電壓依賴性及電導值

本實驗記錄BKCa在cell-attached和inside-out模式下的單通道活動，電極液和浴液含140 mM [K+]，浴液中游離Ca2+([Ca2+]free)為0.1 μM時，分別給予細胞不同的電壓刺激并記錄電流信號。圖3A和3B分別顯示了不同鉗制電壓下cell-attached patch 和inside-out模式下BKCa通道典型的電流圖。結果顯示在去極化狀態(tài)下，BKCa通道表現為隨機開放的外向電流活動，隨去極化電壓的升高，通道的電流幅度值和開放概率逐步增加。根據不同鉗制電壓下的通道電流幅度值和相應刺激電壓構建電流-電壓關系曲線(I-V曲線)見圖1C，用軟件Origin 8.0軟件對I-V曲線進行回歸，表明電流電壓呈線性關系，反轉電位接近0 mV，其斜率即為BKCa的電導值，分別為213.39 ± 9.52 pS(n=15，cell-attached)和225.72 ± 10.61 pS(n=13，inside-out)。表明此通道具電壓依賴性及大電導特性。

圖3 BKCa單通道電流的電壓依賴性注：cell-attached (A)和inside-out (B) 模式下在0-60 mV電壓下記錄到代表性的BKCa電流，箭頭指示基線。C. BKCa通道的電流-電壓關系曲線。

2.3.2 BKCa通道Ca2+依賴性

在inside-out模式下，當浴液中[Ca2+]free=0 μM時，無論超極化或去極化狀態(tài)下均較少見到BKCa的通道活動，但當浴液中[Ca2+]free增高時，則通道活動明顯增加。圖4A顯示了膜電位為+40 mV時，當[Ca2+]由0 μM增加到1.0 μM時通道開放情況，表明該BKCa通道具有明顯的Ca2+依賴性。

圖4 BKCa通道的Ca2+敏感性注：溶液和電極液中[ K+]均為140 mM([K+]0:[ K+]i = 140:140 mM)，Vm=+40 mV，箭頭指示基線。

2.3.3 BKCa通道的IbTX敏感性

在outside-out模式下，BKCa-pcDNA5-293單克隆細胞的BKCa通道對其特異性阻斷劑iberiotoxin(IbTX)敏感。圖5為典型電流記錄圖，表明200 nM IbTX明顯抑制通道活動。

圖5 BKCa通道的IbTX敏感性注：200 nM IbTX基本阻斷通道活動，Vm= +40 mV，箭頭指示基線。

2.4 BKCa融合蛋白純化

純化的BKCa-FLAG融合蛋白經SDS-PAGE電泳檢測，圖6A顯示，在120 kDa處呈現明顯的蛋白條帶，經灰度掃描計算，純度約89%。隨后，用BKCa特異性一抗進行western blot檢測，圖6B結果顯示BKCa-FLAG融合蛋白能夠與BKCa抗體特異性結合，表明蛋白質純化成功，純度較高。

圖6 BKCa-FLAG蛋白質純化注：A圖為BKCa-FLAG蛋白質SDS-PAGE 電泳結果，B圖為BKCa-FLAG蛋白質western blot 結果，Marker表示蛋白質分子量標準。

3 討論

BKCa通道對調節(jié)多種生理過程發(fā)揮重要的作用，應用異源表達技術在工具細胞中重建BKCa通道是深入研究通道結構功能的重要方法。本研究在HEK293細胞中建立的BKCa通道具有典型的大電導特征、電壓依賴性、鈣離子依賴性及IbTX敏感性，與在體的人腸系膜動脈血管平滑肌細胞中記錄到的BKCa通道電生理特性一致[18, 19]，表明BKCa通道重建成功，可作為后續(xù)功能研究的理想工具。為保證細胞系的穩(wěn)定性，本研究采用了誘導表達系統，可利用四環(huán)素作為分子開關嚴格控制BKCa基因的表達。將能夠有效的避免BKCa基因持續(xù)表達可能對宿主細胞造成的損傷，有利于保證BKCa通道表達的穩(wěn)定性。

近年來，BKCa通道的調控位點、藥物作用靶點的研究備受關注，本實驗室在前期工作基礎上，一直在探索將BKCa蛋白純化后在人工平面脂質膜上重建BKCa通道，將能可控性的排除其他蛋白質及胞內外信號轉導通路對通道的影響，可以更加精確的研究通道動力學特征，藥物作用靶點及各個亞基間的相互作用。本研究構建的細胞系為BKCa蛋白質純化提供了有利的條件，表達載體pcDNA5/FRT/TO/FLAG經改造后，在多克隆位點的3′端插入了2×FLAG編碼基因，因此BKCa-pcDNA5-293細胞表達的BKCa蛋白質的胞內C末端融合了2×FLAG短肽，而且2×FLAG并沒有影響B(tài)KCa通道典型的電生理特征。插入FLAG 的好處在于針對標簽的抗體特異性和親和力要比針對通道本身的抗體高很多，為BKCa通道蛋白純化提供了新的思路。ANTI-FLAG M2 Affinity Gel beads是偶聯有FLAG抗體的商業(yè)化的瓊脂糖凝膠，可與BKCa-FLAG蛋白質中的FLAG肽特異性結合，從而實現對BKCa蛋白質的富集，再用商業(yè)化的FLAG肽進行洗脫，即可實現BKCa蛋白質純化，為BKCa通道的人工脂質膜重建準備了必需的條件。

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Establishment of inducible BKCacell line and purification of the recombinant protein*

Mao Liang, Cheng Jun, Huang Wen-jun, Tan Xiao-qiu,Dang Xi-tong,Zeng Xiao-rong, Yang Yan△

(Key Laboratory of Medical Electrophysiology, Ministry of Education, Institute of Cardiovascular Research,Southwest Medical University, Sichuan Luzhou 646000)

Objective：To construct an inducible BKCa-pcDNA5-293 stable cell line and purify the BKCa-Flag fusion protein. Methods: The BKCaORF amplified from human mesenteric vascular smooth muscle cells was cloned into pcDNA5/FRT/TO/FLAG expression vector, which was transiently transfected intoFlp-InTMT-RExTM-293 cells and positive clones were selected using hygromycin B. The recombinant protein was induced by tetracycline and purified using anti-Flag affinity chromatography. The authenticity of the recombinant BKCachannel was confirmed by Western blot and its electrophysiological features were characterized by single channel patch clamp. Results: The BKCa-pcDNA5-293cell line expressed abundant BKCa-Flag fusion protein after induction with tetracycline. The conductance values of single BKCachannel current were 213.39 ± 9.52 pS (n=15, cell-attached) and 225.72 ± 10.61 pS (n=13, inside-out), which are typical features of BKCachannels observed in human mesenteric artery smooth muscle cells, such as large conductance, voltage dependence, calcium sensitivity and IbTX sensitivity. The recombinant BKCawas also extracted and purified to about 89%.Conclusion: A tetracycline-inducibleBKCa-pcDNA5-293stable cell line was successfully established, and the recombinant BKCachannels were functional. The stable cell line can be used for further characterizing the functions of BKCachannels and lead drug screening.

Stable cell line; Recombinant BKCaprotein; Patch clamp

國家自然科學基金項目(編號：81173661)，四川省教育廳項目(編號：11ZB224)，四川省衛(wèi)生和計劃生育委員會(編號：130277)，瀘州市科技局項目(編號：2014-S-44 (6/8))，瀘州醫(yī)學院院級課題資助。

毛亮，男，助理研究員，主要從事心血管分子生物學研究，Email：maoliang@scmu.edu.cn。

△通訊作者：楊艷，女，教授，主要從事心血管藥理學研究，Email：wyangyan@scmu.edu.cn。

2017-2-24)