王紅平 武志強(qiáng) 曾統(tǒng)英 宋英 劉莉 榮祖元△

(1.四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，四川 成都 610097；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610072)

蘇萸痛風(fēng)膠囊重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)研究
——對(duì)SD大鼠肝臟的影響*

王紅平1武志強(qiáng)1曾統(tǒng)英1宋英2劉莉2榮祖元1△

(1.四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，四川 成都 610097；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610072)

目的：分析蘇萸痛風(fēng)膠囊在重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)中對(duì)SD大鼠肝臟的影響，評(píng)價(jià)其安全性，為臨床應(yīng)用提供參考。方法：取健康SD大鼠120只，按性別、體重隨機(jī)分為溶劑對(duì)照組(0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液)和蘇萸痛風(fēng)膠囊高、中、低劑量組(3.732 g·kg-1、1.866 g·kg-1、0.933 g·kg-1)，每組30只，雌雄各半。連續(xù)給藥3個(gè)月，停藥恢復(fù)1個(gè)月，于給藥末期和恢復(fù)期，分別采用戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈采血，放血處死動(dòng)物，進(jìn)行血液生化學(xué)檢測(cè)和組織病理學(xué)等檢查。結(jié)果：給藥末期中、高劑量組動(dòng)物肝臟的臟體指數(shù)均有顯著性升高(P<0.01)，停藥后1個(gè)月基本恢復(fù)正常，病理結(jié)果提示：給藥末期高劑量組可能會(huì)引起大鼠肝細(xì)胞的彌漫性正常增生。結(jié)論：蘇萸痛風(fēng)膠囊在擬定的人體臨床應(yīng)用劑量范圍內(nèi)較安全，但長(zhǎng)期大劑量使用可能會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞的彌漫性正常增生，建議長(zhǎng)期用藥患者應(yīng)定期監(jiān)測(cè)肝功能指標(biāo)。

蘇萸痛風(fēng)膠囊；重復(fù)給藥毒性；肝臟

蘇萸痛風(fēng)膠囊內(nèi)容物為黃色粉末，由吳茱萸、木瓜、薏苡仁、肉桂四味中藥組成，有止痛、利濕、消腫的功效，臨床用于治療急慢性痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎。吳茱萸在方中所占比重最大，發(fā)揮主要功效，歷代文獻(xiàn)均有記載其“小毒”或“有毒”，近期有研究顯示[1-2]，肝臟可能為吳茱萸的毒性靶器官，故本次研究在進(jìn)行大鼠重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)時(shí)，重點(diǎn)關(guān)注與肝功能相關(guān)的血液生化指標(biāo)，結(jié)合臟器指數(shù)和組織病理學(xué)檢查綜合評(píng)價(jià)蘇萸痛風(fēng)膠囊安全性，為臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物

蘇萸痛風(fēng)膠囊，批號(hào)：20150701，由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供，臨床擬用劑量(生藥量)：7.5 g·d-1。

1.1.2 動(dòng)物

SD大鼠，SPF級(jí)，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：11400700119621。本研究嚴(yán)格遵循本單位有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)與使用的準(zhǔn)則。

1.1.3 儀器

c501全自動(dòng)生化分析儀，Roche；SORVAN ST16R高速冷凍離心機(jī)，Thermo；ASP300S全自動(dòng)真空組織脫水機(jī)，德國(guó)徠卡(Leica)儀器有限公司；EG1160包埋機(jī)，德國(guó)徠卡(Leica)儀器有限公司；RM2245組織切片機(jī)，德國(guó)徠卡(Leica)儀器有限公司；HI1210組織攤片機(jī)，德國(guó)徠卡(Leica)儀器有限公司；ST5010全自動(dòng)染色機(jī)，德國(guó)徠卡(Leica)儀器有限公司；DM2000顯微鏡，德國(guó)徠卡(Leica)儀器有限公司；TYMR-Ⅲ血液混勻器，姜堰市天儀電子儀器有限公司。

1.2 方法

取健康合格SD大鼠120只，按性別、體重隨機(jī)分為溶劑對(duì)照組(0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液)，蘇萸痛風(fēng)膠囊高、中、低劑量組(3.732 g·kg-1、1.866 g·kg-1、0.933 g·kg-1)，每組30只，雌雄各半。每周連續(xù)灌胃給藥6天，1次·d-1，給藥體積為15 ml·kg-1，連續(xù)3個(gè)月(按13周計(jì))，停藥恢復(fù)1個(gè)月(4周)。每天觀察動(dòng)物的外觀體征，給藥末期(第13周)和恢復(fù)期(第17周)采用戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈采血，放血處死動(dòng)物，進(jìn)行包括總蛋白(Total protein，TP)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspertate aminotransferase，AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)、白蛋白(Albumin，ALB)、總膽紅素(Total bilirubin，TBIL)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)等與肝功能密切相關(guān)的血液生化學(xué)指標(biāo)檢測(cè)和組織病理學(xué)等檢查[3-5]。

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果

2.1 相關(guān)血液生化學(xué)指標(biāo)

給藥末期結(jié)果顯示，與同期溶劑對(duì)照組比較，雌性大鼠低、中、高劑量組ALT(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)顯著性降低(P<0.01)，高劑量組AST(天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)顯著性降低(P<0.05)；雄性大鼠低、中、高劑量組ALT顯著性降低(P<0.01或P<0.05)，見表1。

恢復(fù)期結(jié)果顯示，與同期溶劑對(duì)照組比較，雌性大鼠低、中、高劑量組TBIL(血清總膽紅素)顯著性降低(P<0.01或P<0.05)，高劑量組ALT顯著性降低(P<0.01)，見表2。

2.2 肝臟臟器指數(shù)

表3、4結(jié)果顯示，給藥末期中、高劑量組動(dòng)物肝臟的臟體指數(shù)均顯著性升高(P<0.01)，恢復(fù)期高劑量組動(dòng)物肝臟臟體指數(shù)未見異常，中劑量組雄性動(dòng)物肝臟臟體指數(shù)仍見升高(P<0.01)，但肝臟與大腦的臟腦指數(shù)結(jié)果顯示：恢復(fù)期溶劑對(duì)照組與中劑量組相比較并無(wú)顯著性差異，說(shuō)明恢復(fù)期雄性大鼠中劑量組肝臟臟體指數(shù)的改變與動(dòng)物體重有關(guān)。

表1 連續(xù)3個(gè)月經(jīng)口灌服蘇萸痛風(fēng)膠囊對(duì)SD大鼠給藥末期血液生化學(xué)的影響( ±SD，n=10)

注：與溶劑對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

表1 連續(xù)3個(gè)月經(jīng)口灌服蘇萸痛風(fēng)膠囊對(duì)SD大鼠給藥末期血液生化學(xué)的影響( ±SD，n=10)(續(xù))

注：與溶劑對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

表2 連續(xù)3個(gè)月經(jīng)口灌服蘇萸痛風(fēng)膠囊對(duì)SD大鼠恢復(fù)期血液生化學(xué)的影響±SD，n=5)

注：與溶劑對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

表2 連續(xù)3個(gè)月經(jīng)口灌服蘇萸痛風(fēng)膠囊對(duì)SD大鼠恢復(fù)期血液生化學(xué)的影響±SD，n=5)(續(xù))

注：與溶劑對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 肝臟組織病理檢查結(jié)果

病理檢查結(jié)果表明，與溶劑對(duì)照組比較，高劑量組肝細(xì)胞平均直徑顯著性升高(P<0.01)，高劑量組肝細(xì)胞均數(shù)有升高的趨勢(shì)。以上結(jié)果提示高劑量組可能會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞彌漫性增生，但增生的肝細(xì)胞為正常肝細(xì)胞，停藥一個(gè)月后，能恢復(fù)正常，見表5。

表3 連續(xù)3個(gè)月經(jīng)口灌服蘇萸痛風(fēng)膠囊對(duì)SD大鼠給藥末期肝臟指數(shù)的影響±SD，n=10)

注：與溶劑對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

表4 連續(xù)3個(gè)月經(jīng)口灌服蘇萸痛風(fēng)膠囊對(duì)SD大鼠恢復(fù)期肝臟指數(shù)的影響±SD，n=5)

注：與溶劑對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

表5 肝細(xì)胞直徑統(tǒng)計(jì)結(jié)果表

注：與溶劑對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

溶劑對(duì)照組與高劑量組肝臟均出現(xiàn)空泡樣改變，見圖1。

3 討論

隨著社會(huì)的發(fā)展，人民生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)的不合理現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的患者也越來(lái)越多，西藥治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎多選用非甾類抗炎藥、秋水仙堿、糖皮質(zhì)激素、促進(jìn)尿酸排泄藥物等藥物。由于用藥時(shí)間久，且不能根治，給痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和心理負(fù)擔(dān)。因此越來(lái)越多的醫(yī)護(hù)人員把治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的目光投向傳統(tǒng)中醫(yī)藥[6]。蘇萸痛風(fēng)膠囊具有止痛、利濕、消腫的功效，臨床上主要用于治療急慢性痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎。方中木瓜主治關(guān)節(jié)腫痛、腳氣轉(zhuǎn)筋，薏苡仁有利水消腫、清熱排膿之功，肉桂具有散寒止痛之功，吳茱萸，除散寒止痛外，還具有疏肝下氣之功，能夠引諸藥直達(dá)病所，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：吳茱萸[7-8]具有抗炎鎮(zhèn)痛作用，可以迅速緩解痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者的疼痛。但高劑量的吳茱萸次堿及吳茱萸醇提物具有明顯的肝毒性：體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)吳茱萸次堿可升高肝細(xì)胞上清液中的AST、ALP、LDH，但光鏡下未見細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變[9]；SD大鼠經(jīng)口一次灌胃給予吳茱萸醇物，出現(xiàn)血清轉(zhuǎn)氨酶及肝臟系數(shù)增加，肝臟出現(xiàn)中央靜脈及小葉下靜脈周圍肝細(xì)胞疏松等病理性改變[1]；SD大鼠連續(xù)28天經(jīng)口重復(fù)給予吳茱萸醇提物，出現(xiàn)TBIL升高，肝臟肥大，肝腦比呈劑量依賴性升高，電鏡下肝細(xì)胞變性腫脹、炎細(xì)胞浸潤(rùn)，恢復(fù)期緩解[2]。

圖1 SD大鼠重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)典型肝臟組織病理照片注：A～B：肝臟，A： HE×100，B： HE×400，正常；C～D：給藥末期對(duì)照組肝臟，C： HE×100，D4： HE×400，肝細(xì)胞空泡樣變(黑色箭頭所示)；E～F：給藥末期高劑量組肝臟，E：HE×100，F(xiàn)：HE×400，肝細(xì)胞空泡樣變(黑色箭頭所示)

本研究依據(jù)前期急毒試驗(yàn)結(jié)果設(shè)定本次試驗(yàn)中各測(cè)試組的給藥劑量，分別為臨床劑量的60倍、30倍、15倍，結(jié)果顯示，給藥末期與同期溶劑對(duì)照組比較，雌性大鼠低、中、高劑量組ALT(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)顯著性降低，高劑量組AST(天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)顯著性降低，雄性大鼠低、中、高劑量組ALT顯著性降低?；謴?fù)期與同期溶劑對(duì)照組比較，雌性大鼠低、中、高劑量組TBIL(血清總膽紅素)顯著性降低，高劑量組ALT顯著性降低，其余生化指標(biāo)均無(wú)異常，說(shuō)明該樣品在本次試驗(yàn)條件下未對(duì)肝臟相關(guān)血液生化指標(biāo)產(chǎn)生影響。給藥末期中、高劑量組動(dòng)物肝臟臟體指數(shù)均有不同程度的升高，恢復(fù)期高劑量動(dòng)物肝臟臟體指數(shù)未見異常，中劑量組雄性動(dòng)物肝臟臟體指數(shù)仍見升高，但

恢復(fù)期溶劑對(duì)照組與中劑量組的肝臟臟腦指數(shù)比較并無(wú)顯著性差異，說(shuō)明恢復(fù)期雄性大鼠中劑量組肝臟臟體指數(shù)的改變與動(dòng)物體重有關(guān)。肝臟組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，本次試驗(yàn)動(dòng)物肝臟主要病變?yōu)楦渭?xì)胞的空泡樣變和肝細(xì)胞增生。肝細(xì)胞的空泡樣變?yōu)榇笫蟪Ｒ娮园l(fā)病，本次試驗(yàn)供試品低、中、高各劑量組與溶劑對(duì)照組比較，無(wú)論是病變程度或病變發(fā)生率均無(wú)顯著性差異，且各組別病變發(fā)生率均在本中心自發(fā)病變范圍內(nèi)，因此推測(cè)肝細(xì)胞空泡樣變?yōu)閯?dòng)物的自發(fā)病變。針對(duì)給藥末期中、高劑量組肝臟臟體指數(shù)的升高，而鏡下觀察肝臟結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)均正常，推測(cè)肝細(xì)胞可能有彌漫性增生，因此進(jìn)行了肝細(xì)胞直徑測(cè)量和數(shù)量計(jì)數(shù)。結(jié)果，高劑量組雌、雄動(dòng)物的肝細(xì)胞直徑比溶劑對(duì)照組大，且與溶劑對(duì)照組相比均出現(xiàn)極顯著性差異；各組肝細(xì)胞數(shù)量在400倍放大圖片中，均值在50～70個(gè)之間，且雌、雄統(tǒng)計(jì)結(jié)果相反，雌性大鼠低、中劑量組數(shù)量均值比溶劑對(duì)照組小，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高劑量組雌性均值較對(duì)照組大，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而雄性動(dòng)物數(shù)量均值高劑量組比溶劑對(duì)照組大，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此肝細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果表明高劑量組的雌、雄數(shù)量均比溶劑對(duì)照組高。綜合分析，高劑量出現(xiàn)的肝臟臟體指數(shù)的升高可能為肝細(xì)胞彌漫性增生引起，但增生的肝細(xì)胞為正常肝細(xì)胞，停藥1個(gè)月后，恢復(fù)正常。

本研究表明，長(zhǎng)期大劑量使用蘇萸痛風(fēng)膠囊可能會(huì)引起SD大鼠肝細(xì)胞彌漫性正常增生，具有可逆性，而與肝臟功能相關(guān)的血液生化指標(biāo)并無(wú)異常，故蘇萸痛風(fēng)膠囊在擬定的人體臨床應(yīng)用劑量范圍內(nèi)較安全，但肝腎功能異常者及長(zhǎng)期大劑量使用者應(yīng)監(jiān)測(cè)肝功能指標(biāo)。

1 李波,李莉,趙軍寧,等. 吳茱萸乙醇提取物對(duì)大鼠急性毒性及肝毒性的影響[J].中藥藥理與臨床, 2013, 29(2): 120-124.

2 劉穎,楊潤(rùn)芳,夏祺悅,等. 吳茱萸醇提物重復(fù)給藥的靶器官毒性研究[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué), 2015, 42(14): 2600-2644.

3 侯志勇,王立強(qiáng),韓靜,等. 腎茶膠囊對(duì)大鼠臟器長(zhǎng)期毒性的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)醫(yī)藥科學(xué), 2011, 1(12): 16-17.

4 張淑香,王萌影,劉學(xué)偉,等. 復(fù)方靈芝降糖膠囊大鼠給藥長(zhǎng)期毒性研究[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2015, 21(17): 146-151.

5 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局. 藥物重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則[S]. 2014.

6 王新宇. 中醫(yī)治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的近況研究[J]. 內(nèi)蒙古中醫(yī)藥, 2014, 33(13): 109-110.

7 張璐,馮育林,王躍生,等. 吳茱萸現(xiàn)代研究狀況[J]. 江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2010, 22(2): 78-82.

8 宋英,盛蓉,李涓,等. 吳茱萸堿治療痛風(fēng)的藥效學(xué)研究[J]. 中藥藥理與臨床, 2011, 27(6): 17-18.

9 張茜,周綺,金若敏,等. 吳茱萸次堿對(duì)肝腎毒性的初步研究[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2011, 17(8): 221-224.

Repeated dose toxicity test of Su Yu gout capsule——influence of it on SD rat liver function

Wang Hong-ping1, Wu Zhi-qiang1, Zeng Tong-ying1, Song Ying2, Liu Li2, Rong Zu-yuan1△

(1.Sichuan Institute for Food and Drug Control, Sichuan Chengdu 610097;2.Affiliated Hospital of Chengdu University of TCM, Sichuan Chengdu 610072)

Objective：To study the effect of Su Yu gout capsule on SD rat liver function, to evaluate the safety of its repeated dose toxicity test, and hope the date can provide the evidence for the doses and parameters in clinical test. Methods:A total of 120 SD rats, half male and half female, were randomly divided into solvent control (0.5% sodium carboxymethyl cellulose solution) group and Su Yu(3.732 g·kg-1, 1.866 g·kg-1and 0.933 g·kg-1) treated group. All drugs were administered by intragastric administration (i.g.) for 3 months. After 4 weeks of recovery, the rats were sacrificed, blood samples were obtained from all rats for hematological and serum chemistry analysis and histopathologic examination were done for all rats. Results: Compared with the control group, relative organ weight of the liver was significantly higher in 3.732 g·kg-1and 1.866 g·kg-1treated group after administration (P<0.01). All of them were almost returned normal for 1 month. Histopathological examination showed the diffuse proliferation of liver cell in the Su Yu 3.732 g·kg-1group after administration. Conclusion:Su Yu gout capsule possesses a good opportunity for clinical use. However related with the period of using Su Yu may lead to diffuse proliferation of liver cell, we recommend that patients monitor hepatic function at regular intervals.

Su Yu gout capsule; Repeated dose toxicity; Liver

四川省科技廳科技支撐計(jì)劃(編號(hào)：2014SZ0140)

王紅平，女，主管中藥師，主要從事中藥藥理學(xué)研究，Email：54whpcn@163.com。

△通訊作者：榮祖元，男，研究員，主要從事藥理毒理學(xué)研究，Email：304240183@qq.com。

2017-2-24)