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(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

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大豆粕玉米黃粉發(fā)酵物對(duì)小鼠免疫功能的影響

黃姍芬,馬海樂(lè),楊雪,王禹程,李云亮*

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

目的:研究大豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對(duì)小鼠免疫功能的影響。方法:實(shí)驗(yàn)組以低、中、高劑量0.334、0.667和2 g/(kg·d)的大豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物灌胃小鼠,對(duì)照組以等體積純凈水灌胃,30 d后進(jìn)行二硝基氟苯誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)、ConA 誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)、抗體生成細(xì)胞檢測(cè)實(shí)驗(yàn)、血清溶血素測(cè)定實(shí)驗(yàn)、碳廓清實(shí)驗(yàn)和NK 細(xì)胞活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)。結(jié)果:大豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對(duì)小鼠的耳廓腫脹、脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、血清溶血素水平、吞噬指數(shù)a和NK細(xì)胞活性都有顯著影響(p<0.05),但是對(duì)小鼠脾抗體生成細(xì)胞量無(wú)顯著影響(p>0.05)。結(jié)論:大豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物具有增強(qiáng)免疫力的功能。

大豆粕,玉米黃粉,發(fā)酵物,枯草芽孢桿菌,增強(qiáng)免疫力

我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó),玉米和大豆資源豐富,玉米年產(chǎn)量1.25億噸,大豆年產(chǎn)量2千萬(wàn)噸。玉米黃粉是玉米加工淀粉時(shí)剩下的副產(chǎn)物,其中含有40%～60%的蛋白質(zhì)。大豆粕是大豆榨油后的副產(chǎn)物,其中蛋白含量43%～48%[1]。由于玉米蛋白中賴氨酸和色氨酸含量較低,導(dǎo)致其蛋白質(zhì)生物學(xué)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較低[2]。然而,大豆蛋白中含有較為豐富的賴氨酸和色氨酸,但是含硫氨基酸較少[3-4]。玉米蛋白的含硫氨基酸比較豐富[2]。不同食物來(lái)源的蛋白質(zhì)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不同(取決于該蛋白質(zhì)中必需氨基酸的含量與比值)。蛋白質(zhì)的互補(bǔ)作用是將幾種生物學(xué)價(jià)值較低的食物蛋白質(zhì)混合食用,則混合后蛋白質(zhì)的總體生物學(xué)價(jià)值就能大大提高。由于當(dāng)必需氨基酸的含量與比值接近人體組織蛋白質(zhì)氨基酸的組成和比值時(shí),其利用率高,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值就大。但是有些蛋白質(zhì),因一種或幾種必需氨基酸的含量過(guò)低或過(guò)高,比值與人體組織不接近,則利用率低,生物學(xué)價(jià)值低。

如果將大豆粕和玉米黃粉一起發(fā)酵,能有效克服氨基酸缺陷問(wèn)題。由于大豆粕中主要成分為大豆蛋白,玉米黃粉主要成分為玉米蛋白,其中大豆蛋白和玉米蛋白具有互補(bǔ)作用?；パa(bǔ)的蛋白質(zhì)氨基酸含量豐富且組成均衡,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,而且無(wú)論是其生物效價(jià)還是利用率都很高。王進(jìn)[5]等人發(fā)現(xiàn),玉米大豆復(fù)配肽比單一原料制備的肽的ACE抑制活性高。

近年來(lái),為促進(jìn)大豆粕和玉米黃粉的高值化利用,采用微生物發(fā)酵法制備功能性多肽已成為研究熱點(diǎn)問(wèn)題之一[6-9]。目前大量研究結(jié)果表明,大豆和玉米蛋白多肽都具有降血壓[10-15]、抗氧化[16-21]、提高免疫力[22-25]等功效。

對(duì)于大豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物增強(qiáng)免疫功能的研究,目前還未見(jiàn)報(bào)道,且大多文獻(xiàn)關(guān)于大豆和玉米蛋白多肽對(duì)免疫功能的影響的研究不透徹[22-25]。本文詳細(xì)探討了大豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對(duì)增強(qiáng)免疫功能的具體效果,為蛋白多肽高值化應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

枯草芽孢桿菌 本課題組實(shí)驗(yàn)室提供;大豆粕(蛋白含量42.53%) 中儲(chǔ)糧鎮(zhèn)江糧油有限公司;玉米黃粉(蛋白含量60.17%) 山東無(wú)棣天成生物科技有限公司;小牛血清、刀豆蛋白A(ConA)、四氮唑藍(lán)(MTT)、2-巰基乙醇(2-ME)、2,4-二硝基氟苯(DNFB) Sigma試劑公司;綿羊紅細(xì)胞(SRBC) 北京百奧萊博科技有限公司;18.0～22.0 g健康雌性清潔級(jí)ICR小鼠 動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(滬)2012-0002號(hào)，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

MSS全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 美國(guó)熱電·芬蘭雷勃(Thermo Labsystems Co);SPX-250B生化培養(yǎng)箱 常州國(guó)華電器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物的制備 樣品豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物的制備參考朱宏志[26]等的方法。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組和豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物劑量設(shè)計(jì)

1.2.2.1 動(dòng)物分組 分批按體重隨機(jī)各分為4組測(cè)定:二硝基氟苯誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn);ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn);抗體生成細(xì)胞檢測(cè)和血清溶血素測(cè)定;小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)和NK細(xì)胞活性測(cè)定。

1.2.2.2 劑量設(shè)計(jì) 成人(按60 kg體重計(jì))每日推薦攝入量為4 g,相當(dāng)于0.0667 g/(kg·d)。實(shí)驗(yàn)按低、中、高設(shè)置0.334、0.667和2 g/(kg·d)3個(gè)劑量組,分別相當(dāng)于人體推薦量的5、10和30倍。溶劑對(duì)照組以等體積純凈水灌胃。

1.2.2.3 受試物的前處理 稱取樣品大豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物3.34、6.67和20 g,分別加純凈水至200 mL制成各組受試液混勻后灌胃(存放于4 ℃冰箱,每?jī)商炫渲埔淮?。各組小鼠以20 mL/(kg·d)的灌胃容積,連續(xù)經(jīng)口灌胃30 d后測(cè)其各項(xiàng)免疫指標(biāo)。

1.2.3 細(xì)胞免疫功能實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 二硝基氟苯誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng) 參照葛飛[27]的方法略有改動(dòng)。采用1% DNFB丙酮麻油溶液涂抹受試動(dòng)物耳廓,使其致敏。

1.2.3.2 ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 采用MTT測(cè)定法[28],略有改動(dòng)。用于顯色測(cè)定受試動(dòng)物脾淋巴細(xì)胞的增殖細(xì)胞數(shù)量。

1.2.4 體液免疫功能實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 抗體生成細(xì)胞檢測(cè) 采用Jerne改良載片測(cè)定法[29]。通過(guò)對(duì)小鼠腹腔注射SRBC,刺激其脾細(xì)胞產(chǎn)生SRBC抗體,將該脾細(xì)胞與SRBC進(jìn)行溶血空斑實(shí)驗(yàn),并計(jì)算溶血空斑數(shù)。

1.2.4.2 血清溶血素測(cè)定 采用半數(shù)溶血值(HC50)測(cè)定法[27],略有改動(dòng),其中以SA緩沖液代替血清設(shè)為對(duì)照。通過(guò)對(duì)小鼠腹腔注射SRBC,使其血清產(chǎn)生SRBC抗體,其血清與SRBC發(fā)生溶血反應(yīng),并釋放血紅蛋白,檢測(cè)其半數(shù)溶血時(shí)的光密度值。

1.2.5 非特異性免疫功能實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 碳廓清實(shí)驗(yàn) 參照白玉[28]的方法略有改動(dòng),其中印度墨汁∶生理鹽水調(diào)整為1∶7(v/v)。在一定濃度范圍內(nèi),體內(nèi)碳顆粒被清除的速率與血碳濃度呈指數(shù)函數(shù)關(guān)系。從小鼠尾靜脈注射墨汁,2 min和10 min后分別測(cè)其血液的OD值。

1.2.5.2 NK細(xì)胞活性測(cè)定 參照白玉[28]的方法略有改動(dòng)。其中靶細(xì)胞最大釋放孔加2.5% Triton。通過(guò)脾細(xì)胞懸液與靶細(xì)胞反應(yīng),釋放乳酸脫氫酶,發(fā)生顯色反應(yīng),檢測(cè)其光密度值。

2 結(jié)果與分析

2.1豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對(duì)小鼠耳廓遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)的影響

豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對(duì)小鼠耳廓遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)的影響見(jiàn)表1。各劑量組小鼠耳廓腫脹程度均高于溶劑對(duì)照組,低、中、高劑量組小鼠耳廓腫脹程度與溶劑對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(p<0.05)。遲發(fā)型超敏反應(yīng)是以單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)和組織細(xì)胞損傷為主要特征的細(xì)胞免疫反應(yīng)[30],二硝基氟苯為抗原刺激T淋巴細(xì)胞增殖分化為致敏T細(xì)胞,產(chǎn)生細(xì)胞免疫。由此說(shuō)明低、中、高劑量豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對(duì)小鼠細(xì)胞免疫具有增強(qiáng)作用。

表1 豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對(duì)小鼠耳廓遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)的影響Table 1 Effect of soybean meal corn yellow powder fermentation of Bacillus subtilison mouse pinna delayed hypersensitivity

注:*與空白對(duì)照組比較,有顯著性差異(p<0.05);**與空白對(duì)照組比較,有極顯著性差異(p<0.01)，表2～表6同。

表2 豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響Table 2 Effect of soybean meal corn yellow powder fermentation of Bacillus subtilis on mouse spleen lymphocyte blastogenesis

2.2豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響

豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響見(jiàn)表2。各劑量組光密度差值均高于溶劑對(duì)照組,只有高劑量組小鼠光密度差值與溶劑對(duì)照組相比有極顯著性差異(p<0.01)。由此說(shuō)明高劑量豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞具有增殖作用。

2.3豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對(duì)小鼠脾抗體生成細(xì)胞量的影響

豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對(duì)小鼠脾抗體生成細(xì)胞量的影響見(jiàn)表3。與溶劑對(duì)照組相比,各劑量組小鼠的溶血空斑數(shù)均無(wú)顯著性差異(p>0.05)。成熟的B細(xì)胞定居于脾臟,B細(xì)胞在抗原刺激下分化為漿細(xì)胞,漿細(xì)胞合成和分泌抗體,主要執(zhí)行機(jī)體的體液免疫。由此說(shuō)明豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對(duì)小鼠的體液免疫(抗原直接作用B細(xì)胞產(chǎn)生抗體)無(wú)促進(jìn)作用。

表3 豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對(duì)小鼠脾抗體生成細(xì)胞量的影響Table 3 Effect of soybean meal corn yellow powder fermentation of Bacillus subtilison cells production of antibody of mouse spleen

2.4豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對(duì)小鼠血清溶血素水平的影響

豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對(duì)小鼠血清溶血素水平的影響見(jiàn)表4。各劑量組小鼠血清半數(shù)溶血值(HC50)均高于溶劑對(duì)照組,中、高劑量組小鼠血清半數(shù)溶血值(HC50)與溶劑對(duì)照組相比有顯著性差異(p<0.05)。SRBC刺激T細(xì)胞的活化增殖,在T細(xì)胞的輔助下,B細(xì)胞活化分泌抗體[31]。由此說(shuō)明豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對(duì)小鼠的體液免疫(抗原作用T細(xì)胞,刺激B細(xì)胞間接產(chǎn)生抗體)有促進(jìn)作用。

表4 豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對(duì)小鼠血清溶血素水平的影響Table 4 Effect of soybean meal corn yellow powder fermentation of Bacillus subtilison serum level of hemolysin

2.5豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對(duì)小鼠碳廓清的影響

豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對(duì)小鼠碳廓清的影響見(jiàn)表5。各劑量組小鼠吞噬指數(shù)a均高于溶劑對(duì)照組,中、高劑量組小鼠的吞噬指數(shù)a與溶劑對(duì)照組相比有極顯著性差異(p<0.01)。由血液中碳粒消失速度反映單核-巨噬細(xì)胞吞噬異物能力,是非特異性免疫。由此說(shuō)明中、高劑量豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對(duì)血液中的非特異性免疫具有促進(jìn)作用。

表5 豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對(duì)小鼠碳廓清的影響Table 5 Effect of soybean meal corn yellow powder fermentation of Bacillus subtilison mouse carbon clearance(±s)

2.6豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響

豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響見(jiàn)表6。高劑量組小鼠NK細(xì)胞活性與溶劑對(duì)照組相比有顯著性差異(p<0.05)。由此說(shuō)明高劑量豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對(duì)NK細(xì)胞的殺傷活性有促進(jìn)作用。

表6 豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響Table 6 Effect of soybean meal corn yellow powder fermentation of Bacillus subtilison mouse NK cell activity(±s)

3 結(jié)論與討論

本文通過(guò)對(duì)細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、非特異性免疫的研究,探索了豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對(duì)小鼠免疫功能的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,高劑量的豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能有顯著的增強(qiáng)作用,耳廓遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)和脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)可以作為機(jī)體細(xì)胞免疫功能的參考指標(biāo)。中、高劑量的豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對(duì)小鼠間接產(chǎn)生抗體的體液免疫功能有顯著的增強(qiáng)作用,但是對(duì)小鼠直接產(chǎn)生抗體的體液免疫功能無(wú)明顯作用。高劑量的豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對(duì)小鼠非特異性免疫功能有顯著的增強(qiáng)作用,碳廓清實(shí)驗(yàn)和NK細(xì)胞活性可以作為機(jī)體非特異性免疫功能的參考指標(biāo)。

目前豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物增強(qiáng)免疫力功能的研究未見(jiàn)報(bào)道,富校軼[23]等人研究發(fā)現(xiàn)超濾大豆蛋白肽具有增強(qiáng)免疫功能中體液免疫功能和單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能的作用,吳曉萌[24]發(fā)現(xiàn)玉米肽具有同樣的免疫功能,但是該研究對(duì)于蛋白多肽增強(qiáng)免疫力功能的影響機(jī)制研究不透徹。本文研究了豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能和非特異性免疫功能均有較好的增強(qiáng)作用,為探索將豆粕玉米黃粉枯草芽孢桿菌發(fā)酵物應(yīng)用于保健品領(lǐng)域,提供可靠的理論支撐。

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Effectofsoybeanmealcornyellowpowderfermentationonmouseimmunefunction

HUANGShan-fen,MAHai-le,YANGXue,WANGYu-cheng,LIYun-liang*

(School of Food and Biology Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China)

Objective:To study the effect of soybean meal and corn yellow powder fermentation ofBacillussubtilison immune function of mice. Methods:Low-,medium-and high-dosage group were fed with 0.334,0.667 and 2 g/(kg·d)soybean meal and corn yellow powder fermentation ofBacillussubtilis,respectively,equal volume of pure water as control group. 30 days later,the following experiments were conducted that DNFB induced mouse delayed type hypersensitivity,mouse spleen lymphocyte transformation capacity induced by ConA,antibody forming spleen cells,serum hemolysin,carbon clearance ability,NK cell activity. Results:Soybean meal and corn yellow powder fermentation ofBacillussubtilishas significant impact(p<0.05) on mouse carbon clearance ability,spleen lymphocyte transformation,serum hemolysin capacity,phagocytic index a and NK cell activity. However it had no significant effect on production of spleen cells formed by antibody(p>0.05). Conclusions:Soybean meal and corn yellow powder fermentation ofBacillussubtilishad effect on enhancing immunity.

soybean meal;corn yellow powder;fermentation;Bacillussubtilis;enhance immunity

2016-11-28

黃姍芬(1992-)，女，在讀碩士研究生,研究方向：多肽提取及功能評(píng)價(jià)，E-mail:839710769@qq.com。

*通訊作者:李云亮(1986-)，男，博士研究生,講師，主要從事功能食品、食品物理學(xué)加工方法及裝備的開(kāi)發(fā)方面的研究，E-mail:liyunliang1986@126.com。

國(guó)家863計(jì)劃-高生物利用度蛋白制備關(guān)鍵技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)(2013AA102203)；江蘇大學(xué)高級(jí)人才科研啟動(dòng)基金(16JDG049)。

TS201.4

:A

:1002-0306(2017)12-0319-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.059