郭延華，張譯元，王立民，唐紅，李迎利，周平

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綿羊體細(xì)胞核移植去核前程序的優(yōu)化

郭延華1，張譯元1，王立民1，唐紅1，李迎利2，周平1

1 省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆石河子 832000 2 石河子市獸醫(yī)衛(wèi)生檢疫所，新疆石河子 832000

郭延華, 張譯元, 王立民, 等. 綿羊體細(xì)胞核移植去核前程序的優(yōu)化. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(5): 730–742.Guo YH, Zhang YY, Wang LM, et al. Program optimization before enucleation on ovine somatic cell nuclear transfer. Chin J Biotech, 2017, 33(5): 730–742.

目前綿羊體細(xì)胞克隆效率仍然很低，本研究擬對(duì)去核前的操作環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化。主要為卵巢保存時(shí)間 (3 h和3–5 h)、卵母細(xì)胞體外成熟時(shí)間 (18 h和24 h)、供核細(xì)胞貼壁率 (10%和30%) 和盲吸法去核時(shí)間 (16 hpm和18 hpm) 等4個(gè)方面優(yōu)化。以成熟率、融合率和重構(gòu)胚胎發(fā)育能力作為評(píng)價(jià)參數(shù)。結(jié)果表明：在卵巢保存方面，卵巢保存3 h組卵母細(xì)胞成熟率顯著高于3–5 h組卵母細(xì)胞成熟率 (60.18% vs 52.50%) (<0.05)，重構(gòu)胚胎發(fā)育力差異不顯著 (>0.05)；在體外成熟時(shí)間方面，體外成熟18 h組和24 h組卵母細(xì)胞成熟率差異極顯著 (53.81% vs 89.06%) (<0.01)，胚胎發(fā)育力差異不顯著 (>0.05)；在融合率方面，貼壁率30%組極顯著高于貼壁率10%組 (80.85% vs 57.69%) (<0.01)，在克隆胚胎發(fā)育率方面沒(méi)有顯著差異 (>0.05)，具有貼比率差異性的細(xì)胞在細(xì)胞生長(zhǎng)平臺(tái)期表現(xiàn)出差異性；在去核時(shí)間方面，16 hpm組和18 hpm組胚胎卵裂率差異顯著，囊胚發(fā)育力差異不顯著 (>0.05)，16 hpm組獲得一只克隆羊，重復(fù)16 hpm獲得4只妊娠克隆羊。組織微衛(wèi)星序列經(jīng)SDS-PAGE分析，DNA指紋與供體細(xì)胞相同。結(jié)論：去核前程序的優(yōu)化保證了材料的質(zhì)量，為提高克隆胚胎數(shù)量和質(zhì)量奠定基礎(chǔ)，可以獲得體細(xì)胞克隆羊。

核移植，卵巢保存時(shí)間，貼壁率，去核時(shí)間，克隆羊

綿羊體細(xì)胞克隆胚胎的成功重構(gòu)是提高克隆效率的重要步驟，在重構(gòu)前期，材料的選擇、處理與優(yōu)化直接決定了重構(gòu)質(zhì)量，對(duì)后期胚胎發(fā)育也會(huì)產(chǎn)生間接的影響，因此控制材料質(zhì)量對(duì)提高克隆效率具有重要意義。自從首例克隆羊多莉誕生以來(lái)[1]，已有16種克隆動(dòng)物相繼出世[2]，然而克隆效率仍然較低。研究人員從重構(gòu)胚胎的方法、去核與注核、融合、激活等方面進(jìn)行了大量的探索，同時(shí)運(yùn)用比較學(xué)在胚胎形態(tài)、遺傳學(xué)、基因表達(dá)和表觀遺傳學(xué)方面[3]也進(jìn)行了深入的研究，以提高克隆效率，但關(guān)于體細(xì)胞核移植去核時(shí)間各不相同，對(duì)供核細(xì)胞和受體卵母細(xì)胞質(zhì)量快速控制方面并無(wú)較明確的觀點(diǎn)。首先，在離體卵巢控制方面，早期的研究中多為關(guān)于卵巢的保存溫度研究[4-5]，僅關(guān)注保存溫度而忽視保存時(shí)間是不夠的，且關(guān)于卵巢保存時(shí)間的準(zhǔn)確界定也較少。卵巢在牛羊屠宰后會(huì)隨胴體降到室溫，卵巢完成采集與運(yùn)輸后，卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體獲取時(shí)間的長(zhǎng)短即卵巢保存時(shí)間就成為影響卵母細(xì)胞體外成熟的主要因素。其次，卵母細(xì)胞的體外成熟時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)后續(xù)胚胎發(fā)育也有間接影響[4-5]，但卵母細(xì)胞不同成熟時(shí)間制作的克隆胚胎發(fā)育潛力，除了在成熟18 hpm和更長(zhǎng)時(shí)間具有比較之外[6-7]，更早時(shí)間進(jìn)行處理尚無(wú)數(shù)據(jù)予以支持，且獲取的卵母細(xì)胞在卵泡內(nèi)成熟度具有差異[8]，因此體外成熟時(shí)間存在差異性，需要對(duì)制作克隆胚胎的卵母細(xì)胞成熟時(shí)間進(jìn)行細(xì)致劃分。再次，成熟卵母細(xì)胞去核時(shí)間和方法的選擇也極為重要，目前多數(shù)文獻(xiàn)關(guān)于去核時(shí)間多為18 h或者無(wú)準(zhǔn)確的時(shí)間控制，因?yàn)槿ズ藭r(shí)間的選擇不僅與去核方法有聯(lián)系[9-12]，而且對(duì)后期胚胎發(fā)育也有間接的影響[13]。最后，供體細(xì)胞的生理狀態(tài)直接決定重構(gòu)胚的融合效率[14]，即供核細(xì)胞的細(xì)胞膜特性，是影響重構(gòu)胚基礎(chǔ)數(shù)量的重要因素。因此本研究以核移植去核前程序的優(yōu)化為切入點(diǎn)，提供一種快速控制方法從源頭上以提高克隆胚胎重構(gòu)數(shù)量和質(zhì)量，提高克隆效率。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試劑除特別說(shuō)明外，均為日本和光藥業(yè)株式會(huì)社藥品。M199 (GIBCO)，DMEM (GIBCO)，F(xiàn)CS (Hyclone)，胰酶 (Gbico)，四孔板 (NUNC)，60 mm培養(yǎng)皿(NUNC)，顯微操作針，石蠟油(Sigma M8410)，體式顯微鏡(Nikon SMZ800)，拉針儀(NARISHIGE PN-30)，磨針儀(NARISHIGE EG-400)，煅燒儀(NARISHIGE MF-900)，顯微操作儀(Eppendorf Transferman NK2)，CO2培養(yǎng)箱(New Branswick Galaxy 170S)，融合儀 (Voltain EP-1 Australia)，0.5 mm融合槽 (BTX)。

1.2 卵母細(xì)胞的采集

從新疆石河子市活畜屠宰場(chǎng)收集綿羊卵巢，投入生理鹽水中，用0.4 L保溫壺收集卵巢后運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。室溫平衡30 min后，清洗1次后剪去輸卵管連接部及多余的結(jié)締組織，用生理鹽水再清洗3–4次，供采卵用。刺剖法采集[8]：簡(jiǎn)述如下，卵巢瀝干放入加好采卵液 (M199+ 0.1% BSA+0.1 mg/mL肝素+0.1 mg/mL慶大霉素) 的100 mm培養(yǎng)皿中，左手持尖頭眼科鑷子將卵巢固定在采卵液中，右手持手術(shù)刀片將突出卵巢皮質(zhì)、明亮的卵泡刺破并多剖數(shù)刀使其進(jìn)入采卵液中，采完的卵巢在采卵液中輕輕晃動(dòng)防止黏附。沉淀數(shù)分鐘后棄去上清液，用手拉巴氏管在體式顯微鏡下選取形態(tài)正常、胞質(zhì)均勻的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體 (Cumulus-oocyte complexs，COCs) 進(jìn)行成熟。卵巢保存時(shí)間以運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室記時(shí)開(kāi)始，至卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體采集結(jié)束。將保存時(shí)間劃分為≤3 h和3–5 h組。牛羊屠宰車間屠宰活畜，卵巢溫度通常會(huì)隨胴體體溫緩慢下降，采集卵巢離體到結(jié)束通常需要一段時(shí)間，我們?cè)O(shè)定為2 h，溫度變化為28–33 ℃ (資料記錄)。

1.3 卵母細(xì)胞的成熟與處理

將采集到的COCs用采卵液清洗2–3遍，然后用成熟液清洗1–2遍，放入預(yù)平衡2 h的四孔板成熟液中(M199+15% FBS+0.1 IU/mL FSH+ 0.2 IU/mL LH+1.0 μg/mL雌二醇)，培養(yǎng)密度 80枚/mL，培養(yǎng)條件為38.5 ℃、5% CO2、飽和濕度。體外成熟18 h后，將擴(kuò)散的顆粒細(xì)胞用移液器吹打除去，0.1%透明質(zhì)酸酶消化1 min后繼續(xù)吹打以除盡顆粒細(xì)胞，用成熟液清洗2–3次，移入預(yù)先平衡于60 mm平皿的成熟培養(yǎng)滴中，在體式顯微鏡下挑出排有第一極體的成熟卵母細(xì)胞以備用。

1.4 供體細(xì)胞的處理

用刀片剔除3歲齡薩?？斯蚨窟吘壍慕q毛，75%酒精棉球擦洗耳組織2–3次，消毒30 s后，用取樣鉗夾取耳組織投入生理鹽水 (含雙抗)中帶回實(shí)驗(yàn)室，移入超凈臺(tái)用眼科剪和鑷子剔除軟骨組織，生理鹽水清洗4–5次，再投入75%酒精中浸15–20 s，移入30 mm平皿中剪碎耳部皮膚組織，組織塊法培養(yǎng)，培養(yǎng)液為DMEM加15% FCS。原代培養(yǎng)3–5 d后觀察組織塊貼壁和成纖維細(xì)胞遷出情況，每隔2 d換液1次。待原代成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)至80%–90%連成片后，用胰酶消化3 min，用含15% FBS的DMEM培養(yǎng)液 (含EGF 10 ng/mL，IGF 10 ng/mL) 進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每2 d換液1次，傳3–5代之后凍存。供體細(xì)胞使用前3 d解凍到24孔板培養(yǎng)，使用前PBS清洗1–2次，胰酶消化，2 500 r/mim離心收集至1.5 mL EP管，100 μL培養(yǎng)液重懸浮供體細(xì)胞以備用。

1.5 供體細(xì)胞貼壁率計(jì)算

在核移植前，將收集的供體細(xì)胞吸取微量置于操作液中停留15 min，觀察供體細(xì)胞的貼壁情況，細(xì)胞變扁平或有偽足貼在培養(yǎng)皿底部為貼壁細(xì)胞，將未貼壁的細(xì)胞移入另一培養(yǎng)皿，兩組細(xì)胞用10 μgmL hoechst33342染色分別在顯微鏡下計(jì)數(shù)。貼壁率=貼壁細(xì)胞/(未貼壁細(xì)胞+貼壁細(xì)胞)×100%，以細(xì)胞貼壁率作為提高重構(gòu)胚胎融合效果的早期判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

消化培養(yǎng)的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后用培養(yǎng)液稀釋，將濃度調(diào)整至大約4×104個(gè)/mL，接種培養(yǎng)于24孔板，每孔0.5 mL，之后每12 h消化收取4孔的細(xì)胞用于計(jì)數(shù)，求取平均數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線。貼比率高的記為A細(xì)胞，貼比率低的記為B細(xì)胞。

1.7 卵母細(xì)胞與供核細(xì)胞的重構(gòu)

用60 mm培養(yǎng)皿制作操作液 (M199+ 25 mmol/L Hepes+20% FBS) 并覆蓋石蠟油，移入顯微操作臺(tái)將注射針與固定針移入操作視野內(nèi)。將受體卵母細(xì)胞用含7.5 μg/mL CB的成熟液培養(yǎng)10 min，用巴氏管將供體細(xì)胞和卵母細(xì)胞移入操作液中進(jìn)行盲吸去核，固定針吸住卵母細(xì)胞，第一極體指向12點(diǎn)方向，去核針刺入剜除極體及周圍少量細(xì)胞質(zhì)，吐出卵母細(xì)胞質(zhì)，吸取供體細(xì)胞放入11點(diǎn)方向。

1.8 融合、激活與培養(yǎng)

將重構(gòu)的卵母細(xì)胞-供核細(xì)胞復(fù)合體放入成熟液中恢復(fù)30 min后，移入融合液中平衡2 min，然后把卵子放入覆蓋融合液 (0.3 mol/L甘露醇+0.5 mmol/L Hepes+0.1 mmol/L CaCl2+0.1 mmol/L MgCl2) 的融合槽電極之間，調(diào)整細(xì)胞膜的接觸面與電極平行，施加直流電脈沖，融合參數(shù)根據(jù)試驗(yàn)調(diào)整脈沖場(chǎng)強(qiáng)120 V，脈沖次數(shù)2次，脈沖時(shí)程20 μs。每批5–8枚/次，操作完后卵子/供核細(xì)胞復(fù)合體放入培養(yǎng)液，30–60 min后觀察融合情況，剔除沒(méi)有融合的復(fù)合體。放回培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，從重構(gòu)胚融合完計(jì)時(shí)2 h后進(jìn)行激活，激活液與激活時(shí)間分別為7%乙醇7 min、2 μmol/L 6-DMAP 4 h，激活完畢后移入SOFaa清洗3遍。38.5 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)，培養(yǎng)2 d和7 d后檢查卵裂率和囊胚率并統(tǒng)計(jì)。

1.9 孤雌胚胎的制作

將成熟的卵母細(xì)胞用7%乙醇7 min、2 μmol/L 6-DMAP 4 h進(jìn)行激活，完畢后移入SOFaa清洗3遍。38.5 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)，培養(yǎng)2 d和7 d后統(tǒng)計(jì)卵裂率和囊胚率。

1.10 胚胎移植

激活完畢后記時(shí)，將發(fā)育36 h以后的克隆胚胎，以手術(shù)法移植到同期發(fā)情的受體綿羊有黃體一側(cè)的子宮角前1/3處，移植后注意觀察受體母羊身體狀況，妊娠45–60 d B超檢查妊娠，對(duì)發(fā)生妊娠的受體母羊進(jìn)行分群護(hù)理。

1.11 微衛(wèi)星鑒定

收集體細(xì)胞克隆羊過(guò)期妊娠胎兒、受體羊組織，將克隆羊胎兒組織分解分管冷凍，收集齊材料后備用，加700 μL組織裂解液(10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mol/L EDTA，20 μg/mL蛋白酶K，0.5% SDS)，50 ℃消化過(guò)夜后，酚仿抽提。收集適量的供核細(xì)胞系，PBS漂洗2次后加入700 μL組織裂解液，酚仿抽提，提取基因組1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。根據(jù)前人[15-16]研究結(jié)果，篩選出5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，引物名稱與序列見(jiàn)表1，引物由Invitrogen公司合成。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PAGE后，利用Quantity One軟件根據(jù)DNA Marker分析片段大小并進(jìn)行基因分型，計(jì)算親權(quán)指數(shù)和父子關(guān)系相對(duì)機(jī)會(huì)。

1.12 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用spass18.0進(jìn)行卡方 (2) 檢驗(yàn)，<0.01為差異極顯著；0.01<<0.05為差異顯著；>0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 卵巢體外保存時(shí)間對(duì)重構(gòu)胚體外發(fā)育的影響

結(jié)果如表2所示，卵巢保存時(shí)間3–5 h會(huì)降低卵母細(xì)胞成熟率，差異顯著 (60.52% vs 52.50%) (<0.05)，而融合率 (58.76% vs 55.78%)、卵裂率 (94.73% vs 91.51%) 和囊胚率 (6.79% vs 7.21%)差異不顯著 (>0.05)。結(jié)果表明在卵巢保存時(shí)間方面，3–5 h成熟組比≤3 h組的卵母細(xì)胞成熟率低，而重構(gòu)胚融合、發(fā)育方面差異不顯著。

2.2 卵母細(xì)胞體外成熟時(shí)間對(duì)卵母細(xì)胞成熟、胚胎發(fā)育的影響

選擇18 h和24 h作為卵母細(xì)胞的成熟時(shí)間，以此作為體細(xì)胞核移植的去核時(shí)間，比較卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量和后期胚胎發(fā)育力的材料質(zhì)量關(guān)系。結(jié)果如表3所示，18 h與24 h卵母細(xì)胞成熟率差異極顯著 (53.81 vs 89.06) (<0.01)，激活率 (86.28 vs 82.11)、卵裂率 (85.12 vs 88.89) 和囊胚率 (15.06 vs 15.86) 差異不顯著 (>0.05)。

表1 微衛(wèi)星位點(diǎn)引物名稱與序列

表2 卵巢保存時(shí)間對(duì)重構(gòu)胚體外發(fā)育的影響

Note: Values in the same column with different lowercase superscripts differ significantly (<0.05).

2.3 不同貼壁效率供體細(xì)胞對(duì)重構(gòu)胚體外發(fā)育的影響

結(jié)果如表4，供體細(xì)胞貼壁率10%組與30% 組的融合率差異 (57.69% vs 80.85%) 極顯著 (<0.01)，而卵裂率 (89.16% vs 92.11%) 和囊胚率 (6.54% vs 5.71%) 差異不顯著 (>0.05)。以上結(jié)果表明，細(xì)胞貼壁率在30%以上的供體細(xì)胞可以極顯著提高重構(gòu)卵的融合率。

2.4 成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈“S”型，即潛伏期、指數(shù)期和平臺(tái)期3個(gè)過(guò)程，分別為0–24 h、24–48 h和48–72 h，結(jié)果見(jiàn)圖1。剛接種的供體細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，接種24 h后細(xì)胞開(kāi)始進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，倍增時(shí)間約在36 h以后，48 h后A細(xì)胞進(jìn)入平臺(tái)期，表現(xiàn)為緩慢的上升型，而B(niǎo)細(xì)胞進(jìn)入平臺(tái)期后表現(xiàn)為緩慢的下降型，兩株細(xì)胞的平臺(tái)期表現(xiàn)出差異性。

2.5 不同去核時(shí)間對(duì)綿羊卵母細(xì)胞去核率的影響

如表5所示，去核時(shí)間起點(diǎn)選至體外成熟時(shí)間的16 h和18 h進(jìn)行，16 hpm組的去核率與18 hpm組的去核率差異不顯著 (>0.05)，但有高于18 hpm組的趨勢(shì)。

2.6 去核時(shí)間對(duì)重構(gòu)胚發(fā)育的影響

因各文獻(xiàn)報(bào)道中，牛、羊卵母細(xì)胞的去核時(shí)間各不相同，因此將去核時(shí)間起點(diǎn) (Hour postonset of maturation，hpm) 選至體外成熟18 hpm和16 hpm進(jìn)行，時(shí)程均為4 h，比較不同去核時(shí)間對(duì)重構(gòu)胚的融合率、卵裂率、囊胚率和移植妊娠的影響。結(jié)果如表6所示，去核時(shí)間18 hpm組和16 hpm組在重構(gòu)胚融合率 (80.01% vs 77.96) 方面差異不顯著 (>0.05)，卵裂率 (97.51% vs 84.78%) 影響差異極顯著 (<0.01)，在早期發(fā)育階段，囊胚率差異不顯著 (12.31% vs 10.25%)，但18 hpm組高于16 hpm組；在移植受體后妊娠方面，18 hpm組和16 hpm有差異 (0 vs 0.05%)，再次重復(fù)16 h去核組，與18 h去核組相比，4只受體羊獲得妊娠，對(duì)妊娠有影響 (0.00% vs 25.00%)。

表3 成熟時(shí)間對(duì)孤雌胚胎體外發(fā)育的影響

Note: values in the same column with different capital superscripts differ significantly (<0.01).

表4 供體細(xì)胞貼壁率對(duì)重構(gòu)胚體外發(fā)育的影響

Note: values in the same column with different capital superscripts differ significantly (<0.01).

2.7 移植后胎兒出生情況

重構(gòu)胚體外培養(yǎng)36–48 h后，將卵裂的571枚重構(gòu)胚經(jīng)手術(shù)法移入同期發(fā)情的代孕母羊輸卵管中。共移植代孕母羊52只，移植后60 d B超檢查妊娠情況，對(duì)于發(fā)生妊娠的代孕母羊轉(zhuǎn)群加強(qiáng)護(hù)理。至出生時(shí)，由于克隆羊胎兒超過(guò)預(yù)產(chǎn)期 (150 d) 9 d，出生后表現(xiàn)出體表黃染、羊水量少、胎兒腹部腹圍增大，出生后呼吸微弱，30 min停止呼吸死亡。解剖后發(fā)現(xiàn)胎兒胃內(nèi)有大量羊水，其余組織正常。重復(fù)16 hpm組4只妊娠克隆胎兒在101、120、135、140 d相繼 流產(chǎn)。

2.8 過(guò)期妊娠胎兒的分子生物學(xué)檢測(cè)

如圖2所示，5個(gè)微衛(wèi)星BM1818、BM203、OarCP0049、NRA0005、McM0527標(biāo)記，在各樣本上有特異性PCR產(chǎn)物，克隆羊與供體細(xì)胞基因型一致，而與代孕母羊和對(duì)照組的基因型差異較大。由此判定克隆羊來(lái)自供體細(xì)胞。

3 討論

體細(xì)胞核移植技術(shù)重構(gòu)過(guò)程主要為卵母細(xì)胞去核、注核、融合和激活等幾個(gè)過(guò)程，而前期的處理主要指卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體的采集、卵母細(xì)胞體外成熟時(shí)間、供核細(xì)胞處理和核移植卵母細(xì)胞的去核準(zhǔn)備。卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體采集前，卵巢的正確處理能提高體細(xì)胞核移植的材料質(zhì)量，卵巢的處理主要分為保存溫度和離體時(shí)間。牛羊等活畜宰殺后，卵巢會(huì)隨胴體一同降溫。如果卵巢保存溫度過(guò)高會(huì)直接形成高溫外環(huán)境，Krishna等[4]將卵母細(xì)胞用不同溫度熱處理后發(fā)現(xiàn)這會(huì)嚴(yán)重影響卵母細(xì)胞的成熟效果，而后的胚胎發(fā)育基因表達(dá)也發(fā)生紊亂。Nakao等[17]研究認(rèn)為室溫 (20 ℃，3 h+5 h)處理下可以獲得理想的囊胚發(fā)育效果，采卵后39 ℃保存5 h進(jìn)行成熟，胚胎發(fā)育更為理想，但最好的發(fā)育效果卻是獲得卵巢后立即進(jìn)行體外成熟，成熟、發(fā)育效果也優(yōu)于以上組別。Kim等[5]將采卵溫度 (即保存溫度30–33 ℃，4 h) 過(guò)渡到室溫 (25 ℃，6 h) 后處理發(fā)現(xiàn)，雖然卵母細(xì)胞形態(tài)方面表現(xiàn)正常，與立即采卵成熟組囊胚率發(fā)育方面差異不顯著，但過(guò)長(zhǎng)的保存時(shí)間后，卵巢表現(xiàn)較高的自溶而影響卵母細(xì)胞的成熟。在卵巢保存時(shí)間方面，研究結(jié)果顯示，卵巢保存時(shí)間由≤3 h增加到3–5 h會(huì)顯著降低卵母細(xì)胞成熟率，這與Kim等的研究結(jié)果相同[5]。因此在卵巢溫度控制方面，我們認(rèn)為體溫和低溫不是理想的運(yùn)輸溫度，建議采用卵巢混合后的溫度，而卵巢保存時(shí)間控制方面我們認(rèn)為卵巢收集、保存至采集卵丘卵母細(xì)胞進(jìn)行成熟的總體時(shí)間不宜超過(guò)5 h，盡量做到運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室立即采卵收集用于體外成熟。

圖1 綿羊成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

表5 去核時(shí)間對(duì)綿羊卵母細(xì)胞去核率的影響

表6 核移植時(shí)程對(duì)重構(gòu)胚體外發(fā)育的影響

Note: values in the same column with different capital superscripts differ significantly (<0.01).

圖2 DNA水平上的鑒定(A：電泳檢測(cè)；B：微衛(wèi)星位點(diǎn)電泳. B1：樣品BM1818位點(diǎn)電泳圖；B2：樣品BM203位點(diǎn)電泳圖；B3：樣品OarCP0049位點(diǎn)電泳圖；B4：樣品McM0527位點(diǎn)電泳圖；B5：樣品NRA0005位點(diǎn)電泳圖；M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；DO：供體細(xì)胞；CL：克隆羊；SU：代孕母羊；CO：受體對(duì)照)

在體細(xì)胞核移植中，盲吸法是以能觀察到第一極體進(jìn)行去核的，而文獻(xiàn)報(bào)道中關(guān)于盲吸法進(jìn)行卵母細(xì)胞去核的時(shí)間各不相同(15–20 hpm)，若成熟至24 h后再構(gòu)建克隆胚，操作過(guò)程相對(duì)延長(zhǎng)了成熟時(shí)間，這不僅會(huì)引起卵母細(xì)胞的老化，同時(shí)也會(huì)引發(fā)部分卵母細(xì)胞的主動(dòng)孤雌激活而不利于克隆胚胎的重構(gòu)。在早期的研究中[7]，我們發(fā)現(xiàn)有腔卵泡中直徑較大的卵泡卵母細(xì)胞的成熟時(shí)間較早，24 h成熟比率也較高，而小腔卵泡卵母細(xì)胞的成熟過(guò)程較長(zhǎng)、較晚。在體細(xì)胞核移植中，所有卵母細(xì)胞的成熟過(guò)程并不是一個(gè)同步進(jìn)行的過(guò)程，因此在成熟率方面會(huì)隨著時(shí)間的推移而有上升的趨勢(shì)。我們將24 h組的卵母細(xì)胞在成熟18 h時(shí)除去顆粒細(xì)胞，之后繼續(xù)成熟至24 h，與18 h組比較成熟率和胚胎發(fā)育率，結(jié)果表明兩組成熟率差異顯著。我們觀察發(fā)現(xiàn)18 h組由于成熟時(shí)間的選擇，在形態(tài)和成熟質(zhì)量上都獲得了較好的卵母細(xì)胞。而24 h組卵母細(xì)胞在體外成熟18 h后，剩余未成熟的卵母細(xì)胞在成熟發(fā)生進(jìn)程中，雖然存在有細(xì)胞形態(tài)規(guī)則和不規(guī)則的、胞質(zhì)均勻和不均勻的，但是也能完成體外成熟而增加了成熟卵的數(shù)量。我們認(rèn)為形態(tài)不規(guī)則、胞質(zhì)不均勻的卵母細(xì)胞是由直徑相對(duì)較小的卵泡和采集機(jī)械損傷產(chǎn)生的，因此成熟時(shí)間較長(zhǎng)。在胚胎發(fā)育方面，兩組囊胚率差異不顯著，說(shuō)明體外成熟18 h開(kāi)始去核或者激活并不影響后期的發(fā)育。

在早期的研究中，研究人員認(rèn)為供體細(xì)胞核的周期是決定重構(gòu)胚染色體倍型的關(guān)鍵因素，研究發(fā)現(xiàn)不論血清饑餓還是接觸抑制法均可以達(dá)到細(xì)胞周期G0同期化[18]，以提高核移植成功率。然而，也有研究認(rèn)為供體細(xì)胞G0期并不是核移植成功的關(guān)鍵因素，利用生長(zhǎng)期旺盛的供體細(xì)胞同樣能獲得克隆動(dòng)物[19]，且效果并不比供體細(xì)胞饑餓得到的克隆動(dòng)物低[20]。但不論是接觸抑制、血清饑餓處理的供體細(xì)胞，還是生長(zhǎng)旺盛的供體細(xì)胞，在重構(gòu)胚電融合方面都是靠細(xì)胞膜的微孔相互融合而形成克隆胚的。多數(shù)研究報(bào)道認(rèn)為重構(gòu)胚的融合與融合液、融合電壓有關(guān)，而有關(guān)供體細(xì)胞對(duì)融合方面的影響，除了細(xì)胞類型、傳代次數(shù)[21]、細(xì)胞極端處理[22]之外，對(duì)供體細(xì)胞細(xì)胞膜生理狀態(tài)差異引起的融合率差異研究較少。匯合100%的供體細(xì)胞雖然會(huì)由于長(zhǎng)時(shí)間的接觸抑制降低胚胎發(fā)育潛力、增加胚胎細(xì)胞的凋亡[23]，但潘曉燕等[24]研究發(fā)現(xiàn)供體細(xì)胞70%–80%匯合時(shí)比匯合100%的供體細(xì)胞組在融合方面稍有優(yōu)勢(shì)。在早期的研究中我們認(rèn)為細(xì)胞膜的融合是關(guān)鍵所在，王二耀等[25]研究含有完整膜的卵丘細(xì)胞注入受體卵后的重構(gòu)胚卵裂不能進(jìn)一步發(fā)育，而去掉膜的供體細(xì)胞注入卵母細(xì)胞后，重構(gòu)胚卵裂可以進(jìn)一步發(fā)育，反之可以推測(cè)，完整的膜尤其是具有較高光澤性的細(xì)胞膜對(duì)胚胎融合具有重要的影響。在我們?cè)缙诘难芯恐?，通過(guò)對(duì)供體細(xì)胞進(jìn)行差速消化選擇后，發(fā)現(xiàn)重構(gòu)胚融合率有所提高，為了進(jìn)一步提高融合率，提高材料利用率，達(dá)到快速預(yù)知供體細(xì)胞的融合效果，我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)比較觀察了差速消化選擇的細(xì)胞在傳代2次后，對(duì)重構(gòu)胚的融合效果和胚胎發(fā)育潛力的影響。結(jié)果顯示貼壁率30%組與10%的融合率差異極顯著 (<0.01)，而卵裂率和囊胚率差異不顯著 (>0.05)。因此我們認(rèn)為一般生長(zhǎng)特性較好的供體細(xì)胞在傳代時(shí)貼壁較快，在做體細(xì)胞核移植融合前通過(guò)在操作液中移入供體細(xì)胞，停留15 min后觀察貼壁率，可以快速判定供體細(xì)胞是否可以用于融合，以避免較低的融合率造成克隆胚胎數(shù)量少的情況，做到對(duì)供體細(xì)胞的融合效果的提前預(yù)知。通過(guò)對(duì)2株不同貼比率細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線研究發(fā)現(xiàn)，2株細(xì)胞在細(xì)胞潛伏期和生長(zhǎng)期生長(zhǎng)曲線接近一致，而在平臺(tái)期貼比率高的A細(xì)胞仍在持續(xù)正向生長(zhǎng)，而貼比率低的B細(xì)胞表現(xiàn)出緩慢的負(fù)增長(zhǎng)，進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞在平臺(tái)期出現(xiàn)較多的懸浮細(xì)胞，且細(xì)胞光澤性較差，我們認(rèn)為這是細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不良形成的細(xì)胞脫落，最終引起總體細(xì)胞數(shù)量的下降。因此在同等卵母細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行核移植時(shí)，貼壁率較高的供體細(xì)胞能獲得更多數(shù)量的克隆胚胎，以降低工作量。以往在顯微操作時(shí)供核細(xì)胞的挑選依據(jù)是細(xì)胞膜光澤性高，這在實(shí)際操作中主要依靠操作人員的經(jīng)驗(yàn)而定，具有一定的局限性，通過(guò)該方法的提前預(yù)知能降低操作難度，提高效率。

卵母細(xì)胞在體外完成第一次減數(shù)分裂的成熟過(guò)程是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，成熟過(guò)程主要分為GV (Germinal vesicle)、GVBD (Germinal vesicle break dowm)、MI (Metaphase of MI)、AI (Anaphase of MI)、TI (Telophase of MI)、MII (Metaphase of MII) 等核期。微管蛋白tubulin聚合拉伸形成紡錘體將減數(shù)分裂的染色體分開(kāi)始于MI期，終于MII期，含有對(duì)半染色體的極體分離發(fā)生在AI期，TI期紡錘體牽拉的染色體距離進(jìn)一步拉伸，MII期紡錘體牽拉的染色體分離開(kāi)形成含有大量胞質(zhì)的次級(jí)卵母細(xì)胞和第一極體[26]，因此在早期去核方面，紡錘體成像儀作為去核工具更具有優(yōu)勢(shì)[11]，而hoechst33342染色在胞質(zhì)邊緣去核主要用于AI/TI期，隨著成熟時(shí)間的推移，胞質(zhì)染色體和極體染色體將會(huì)分離開(kāi)進(jìn)行到MII期，這就增加了極體與染色體之間的位移，為hoechst33342染色去核增加了困難，增加了去核細(xì)胞質(zhì)量，尤其是影響到盲吸法去核率，同時(shí)會(huì)影響MII期MPF和MAPK峰值，也影響供核細(xì)胞核膜破裂 (Nuclear envelope breakdown，NEBD) 和供體核染色體濃縮 (Premature chromosome condensation，PCC) 重編程的能力。相反，成熟晚期MII去核用脫羰秋水酰胺 (Demecolcine) 能100%成功去核[12,27]，但該方法除了成功應(yīng)用在小鼠，尚未見(jiàn)到大型克隆動(dòng)物的出生報(bào)道。Joon-Hee Lee等[28]通過(guò)比較AI-TI和MII期兩個(gè)階段的去核，測(cè)量去核胞質(zhì)量，在AI-TI期去核位移距離是 (15.8±2.4) μm，而MII期去核 (35.2±3.1) μm，位移距離差異顯著，去核胞質(zhì)量差異顯著，同時(shí)研究表明這種早期去核促進(jìn)了MPF和MAPK活性的保留以促進(jìn)供體核重編程。在早期的研究中我們積累了卵母細(xì)胞直徑的測(cè)量數(shù)據(jù)，與Lee等的測(cè)量結(jié)果基本一致[9]。通過(guò)提前核移植去核時(shí)間，我們發(fā)現(xiàn)16 hpm組和18 hpm 組在卵裂方面有差異，但卵裂率的顯著差異無(wú)法充分說(shuō)明問(wèn)題，因此增加囊胚發(fā)育率，結(jié)果表明16 hpm組和18 hpm組在囊胚發(fā)育結(jié)果方面無(wú)顯著差異。通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，16 hpm組獲得一只克隆羊，而18 hpm組未獲得克隆羊，該結(jié)果說(shuō)明盲吸法16 hpm組在去核成功率方面比18 hpm具有優(yōu)勢(shì)，僅1例成功具有偶然性，因此重復(fù)盲吸法16 hpm去核組，結(jié)果4只受體母羊發(fā)生妊娠。反究18 hpm和16 hpm組囊胚率的差異性，我們推斷，18 hpm囊胚率稍高的原因是去核成功率低，部分未去核干凈的克隆胚仍能發(fā)育到囊胚，即形成多倍體胚胎，而16 hpm組的去核率卻高于18 hpm組，去核更干凈。hoechst33342染色去核相比盲吸法去核雖然具有準(zhǔn)確性，但染色UV觀察去核也會(huì)造成DNA雙鏈的斷裂，尤其是線粒體DNA而影響后期胚胎發(fā)育潛力[13]，因而多采用盲吸法去核，之后染色觀察剔除未去核干凈的卵母細(xì)胞。因此綿羊的卵母細(xì)胞盲吸法去核時(shí)間提前到16 hpm或者是選擇卵母細(xì)胞的AI-TI期核型更容易獲得克隆羊。而hoechst33342染色去核則對(duì)AI-TI或MII去核均有效，但成熟時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)增加總體卵母細(xì)胞MII期的比率[29]，在去核方面會(huì)增加去核胞質(zhì)量，降低了重構(gòu)胚的質(zhì)量和發(fā)育潛力。

本研究選用新疆軍墾型美利奴細(xì)毛羊作為克隆胚胎移植受體，結(jié)果只有16 hpm組得到1只克隆羊。重復(fù)16 hpm組又獲得4只克隆羊。對(duì)獲得1只克隆羊組克隆羊觀察發(fā)現(xiàn)受體羊表現(xiàn)過(guò)期妊娠，超出預(yù)產(chǎn)期 (150 d) 9 d，胎兒出生時(shí)出現(xiàn)產(chǎn)力難產(chǎn)、骨盆開(kāi)張不全，經(jīng)過(guò)人工助產(chǎn)分娩后，出生胎兒僅表現(xiàn)出有限的呼吸，之后因?yàn)榭谇粌?nèi)存有大量的羊水而呼吸困難死亡。觀察發(fā)現(xiàn)腹圍增加，倒懸從口內(nèi)流出羊水，經(jīng)解剖后發(fā)現(xiàn)胃內(nèi)吸入大量的羊水，其余組織均正常。而重復(fù)16 hpm組獲得的4只克隆羊，在妊娠晚期相繼發(fā)生流產(chǎn)，組織均正常，樣本需要進(jìn)一步分析。在我們的肉羊胚胎移植出生日統(tǒng)計(jì)資料中顯示 (內(nèi)部資料)，肉羊出生日程為145–155 d，高峰期表現(xiàn)在151 d，而黑頭薩?？丝寺⊙蛟诔錾辗矫姹憩F(xiàn)出超過(guò)預(yù)產(chǎn)期9 d，胎盤(pán)內(nèi)羊水量少、胎兒腹圍增大，胃內(nèi)有大量羊水等跡象，這些癥狀表明克隆羊?yàn)檫^(guò)期妊娠胎兒。在動(dòng)物妊娠方面，妊娠足月的克隆牛[30]有些也表現(xiàn)出妊娠延期、推遲分娩的現(xiàn)象。在人類臨床中為了規(guī)避早產(chǎn)或過(guò)期妊娠情況的發(fā)生，通常會(huì)對(duì)孕婦的孕周、羊水量、胎盤(pán)成熟度進(jìn)行檢查，以適時(shí)終止妊娠，即給予外源性糖皮質(zhì)激素，這不僅可以促進(jìn)胎兒肺成熟，而且可以提高胎兒生存幾率和質(zhì)量，這已經(jīng)被廣泛證實(shí)和接受，但在克隆家畜上沿用該做法的情況除了少數(shù)報(bào)道之外[31-32]，并沒(méi)有引起廣泛的重視，同時(shí)對(duì)于過(guò)期妊娠克隆動(dòng)物直接進(jìn)行剖腹產(chǎn)會(huì)由于胎兒肺臟和腎臟的不成熟無(wú)法適應(yīng)外界環(huán)境而增加產(chǎn)后出生的死亡風(fēng)險(xiǎn)，因此對(duì)出生日期應(yīng)當(dāng)適時(shí)干預(yù)，以提高動(dòng)物生存質(zhì)量[33]。

利用微衛(wèi)星分析法對(duì)克隆動(dòng)物個(gè)體的遺傳物質(zhì)進(jìn)行鑒定來(lái)源于“Dolly”羊的出生[34]，這種檢測(cè)作為鑒別克隆動(dòng)物的做法已經(jīng)成為慣例。事實(shí)上新生克隆動(dòng)物 (Offspring) 并非真正意義上的“克隆”，它只是供體細(xì)胞基因組的拷貝復(fù)制，因?yàn)樗木€粒體mtDNA可能完全來(lái)源于受體卵[28]，也可能是受體卵和供體細(xì)胞線粒體的異質(zhì)復(fù)合體[35]。因此鑒定時(shí)多用微衛(wèi)星序列與供體細(xì)胞的遺傳信息進(jìn)行同型分析，以此作為檢測(cè)的主要手段，其次是對(duì)線粒體mtDNA進(jìn)行檢測(cè)。我們的研究結(jié)果說(shuō)明5個(gè)微衛(wèi)星與供體細(xì)胞基因型一致，而與代孕母羊基因型差異較大，結(jié)果表明薩?？丝寺⊙蛲耆珌?lái)自于供體細(xì)胞。

4 結(jié)論

通過(guò)上述步驟的優(yōu)化能提高克隆胚胎的重構(gòu)數(shù)量和發(fā)育質(zhì)量。即離體卵巢從運(yùn)輸?shù)绞占涯讣?xì)胞進(jìn)行體外成熟的離體時(shí)間越短越好，以供體細(xì)胞貼壁率作為提高融合效果的早期判斷具有實(shí)際指導(dǎo)意義，盲吸法去核時(shí)間提前到16 hpm，可以獲得體細(xì)胞克隆羊。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Program optimization before enucleation on ovine somatic cell nuclear transfer

Yanhua Guo1, Yiyuan Zhang1, Limin Wang1, Hong Tang1, Yingli Li2, and Ping Zhou1

1 Institute of Animal Husbandry and Veterinary, Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Sciences, State Key Laboratory of Sheep Genetic Improvement and Healthy Production, Shihezi 832000, Xinjiang, China 2 Animal and Medical Quarantine Station of Shihezi, Shihezi 832000, Xinjiang, China

Ovine somatic cell nuclear transfer (SCNT) efficiency remains lower. Therefore, we optimized the program before oocyte enucleation on ovine SCNT. Four experiments were done including exposure duration of ovaries (3 h or 3 to 5 h), duration of oocytes maturation (18 h and 24 h), rate of donor adherent and enucleation time of maturate oocyte. The maturation rates of oocyte, fusion rates and cleavation rates of cloned embryos were used to assess the efficiency of different procedures. The maturation rates of ovaries with 3 h exposure was higher than that of 3 to 5 h (60.18% vs 52.50%) (<0.05). Embryonic development competence had no significant difference (>0.05). The maturation rates were significantly different between group18 h and 24 h (53.81% vs 89.06%,<0.01). Embryonic development competence had no significant difference (>0.05); fusion rates of donor adherent 30% group was higher than that of 10% group. Embryonic development competence had no significant difference (>0.05). Different adherent donor characterizes the difference in plateau phase. The cleavation rates of 18 hpm group was higher than that of 16 hpm group. Embryonic development competence had no significant difference (>0.05), the enucleation of 16 hpm group obtained one clone fetus, we got four clone fetus to repeat the 16 hpm group. Five microsatellite was analyzed by PAGE, the bands indicated that fingerprint of cloned fetus were completely the same as those of donor cells. Our data therefore suggests program optimization before enucleation assurance quality of material which be able to improve the quantity and quality of clone embryos, and optimized scheme can obtain clone sheep offspring.

nuclear transfer, exposure duration of ovaries, adherent rate, enuclation time, clone sheep offspring

August 18, 2016; Accepted:March 17, 2017

Yanhua Guo. Tel: +86-993-6683627; E-mail: guoyanhuatlr@sohu.com Ping Zhou. Tel: +86-993-6683759; E-mail: zhpxqf@163.com

10.13345/j.cjb.160308

國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng) (No. 2016zx08008-001)，國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 31271597)，綿羊繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題 (No. 2013KLS05)，新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)院士基金專項(xiàng) (No. 2014BB023) 資助。

2017-04-12

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170412.1655.003.html

Supported by:National Major Special Projects on New Cultivation for Transgenic Organisms (No. 2016zx08008-001), National Natural Science Foundation of China (No. 31271597), Opening Foundation of Sheep Genetic Improvement and Healthy Production Laboratory (No. 2013KLS05), Foundation of Academician in Production and Construction of Xinjiang (No. 2014BB023).