張玉瑋，李潔，袁勇，顧繼娟，陳鵬

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苦蕎籽粒蘆丁降解酶的純化、酶學(xué)性質(zhì)及部分一級結(jié)構(gòu)分析

張玉瑋，李潔，袁勇，顧繼娟，陳鵬

西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100

張玉瑋, 李潔, 袁勇, 等. 苦蕎籽粒蘆丁降解酶的純化、酶學(xué)性質(zhì)及部分一級結(jié)構(gòu)分析. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(5): 796–807.Zhang YW, Li J, Yuan Y, et al. Purification, characterization and partial primary structure analysis of rutin-degrading enzyme in tartary buckwheat seeds. Chin J Biotech, 2017, 33(5): 796–807.

蘆丁降解酶催化蘆丁降解為水溶性降低的槲皮素，是形成苦蕎苦味的主要因素。研究以榆6-21苦蕎籽粒粉為材料，通過硫酸銨分級沉淀、疏水層析、陽離子交換層析、凝膠過濾層析分離純化蘆丁降解 酶，SDS-PAGE顯示純化的蘆丁降解酶為分子量66 kDa的單一條帶。蘆丁降解酶的最適pH值為5.0，最適溫度為50 ℃。對其催化特性研究表明，該酶的m值為0.27 mmol/L，max值為39.68 U/mg。Cu2＋、Zn2＋、Mn2＋和EDTA對其有不同程度的抑制作用。純化的蘆丁降解酶可耐受50% (/) 的甲醇。Edman降解法測定其N端序列為TVSRSSFPDGFLFGL。MALDI-TOF-MS (基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜) 二級質(zhì)譜獲得了其15個內(nèi)肽序列。該研究為從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中確定蘆丁降解酶的候選基因及深入研究蘆丁降解酶的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

苦蕎,蘆丁降解酶,純化,特性

蕎麥，屬于蓼科(Polygnaceae) 蕎麥屬()。蕎麥中，尤其是苦蕎中含有蘆丁、槲皮素和蕎麥堿等重要的生理活性物質(zhì)?？嗍w中黃酮類化合物的含量比普通蕎麥高10–100倍[1]，蘆丁是苦蕎中重要的黃酮類化合物，具有降低毛細(xì)血管通透性和脆性、保持及恢復(fù)毛細(xì)血管的正常彈性等功能。在輔助治療高血壓、糖尿病、視網(wǎng)膜出血等疾病中發(fā)揮著重要作用。

蕎麥中存在的蘆丁降解酶極大限制了蘆丁的提取和加工，并且高活性的蘆丁降解酶成為高蘆丁蕎麥育種的重要障礙。目前對蘆丁降解酶的研究主要集中于對其進(jìn)行分離純化和部分催化特性的分析。Yasuda等[2]首次從苦蕎籽粒中分離純化出分子量約為70 kDa的蘆丁降解酶的兩種同工酶，其m值分別為0.12 mol/L和0.13 mol/L，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)20% (/) 的水溶性溶劑如乙醇、DMSO可提高蘆丁降解酶活性[3]。王改玲等[4]從苦蕎子粒中分離出蘆丁降解酶粗品，并證明是一種高活性天然β-糖甘酶，濃度高于40% (/) 的乙醇對其有明顯的抑制作用。唐宇等[5]從野生蕎麥籽粒中純化出約60 kDa的蘆丁降解酶，其最適pH和最適溫度分別為5.0和40 ℃。Cui等[6]從苦蕎籽粒中純化出70 kDa的蘆丁降解酶，可特異性水解蘆丁產(chǎn)生槲皮素，提出利用蘆丁降解酶酶解制備槲皮素的思路。本實(shí)驗(yàn)室Li等[7]建立了一種利用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測RDE同工酶的方法，并證明在苦蕎種子中至少存在5種RDE同工酶。前人建立的蘆丁降解酶純化方法中，多采用在硫酸銨分級沉淀之后采用透析除鹽再進(jìn)行后續(xù)層析分離純化的方式，造成蛋白透析中形成大量不可逆沉淀，影響目標(biāo)蛋白的回收。因此純化方法有待進(jìn)一步優(yōu)化。

作為苦蕎蘆丁分解代謝的關(guān)鍵酶，迄今為止未見蘆丁降解酶一級結(jié)構(gòu)研究的相關(guān)報(bào)道，因此優(yōu)化蘆丁降解酶的純化方法、分析其催化特性及部分一級結(jié)構(gòu)，將為克隆蘆丁降解酶的基因以及揭示蘆丁降解酶在次生代謝物積累過程中的生物學(xué)功能奠定重要的基礎(chǔ)，同時為體外條件下利用蘆丁降解酶的催化特性進(jìn)行生物催化研究提供基礎(chǔ)資料。本研究在引入疏水層析純化蘆丁降解酶并在分析其催化特性的基礎(chǔ)上，利用N端測序和質(zhì)譜技術(shù)，獲得其成熟蛋白N端序列及內(nèi)肽序列，以期為結(jié)合苦蕎籽粒發(fā)育期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)確定蘆丁降解酶的候選基因、深入研究蘆丁降解酶的生物學(xué)功能及培育高蘆丁含量的苦蕎品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 苦蕎

苦蕎粉，榆6-21，由陜西省榆林農(nóng)業(yè)學(xué)校提供，儲存于–20 ℃冰箱中。

1.1.2 主要試劑

蘆丁(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，BR)；槲皮素(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，BR)；硫酸銨(AR)；無水乙酸鈉(AR)；冰乙酸(AR)；甲醇(AR)；MnCl2(AR)；AlCl3(AR)；ZnCl2(AR)；CuSO4(AR)；EDTA (AR)；蔗糖(AR)。疏水層析介質(zhì)(Phenyl Sepharose CL-4B)、CM-纖維素、Sephadex G-150均為GE公司產(chǎn)品。

1.2 蘆丁降解酶的制備與純化

1.2.1 制備蘆丁降解酶粗酶液

脫脂苦蕎粉與15倍體積0.2 mol/L乙酸緩沖液(pH 4.0) 混勻，4 ℃提取過夜，11 500 r/min冷凍離心15 min，上清即為蘆丁降解酶粗酶液，測定其蛋白質(zhì)含量和蘆丁降解酶活力。

1.2.2 硫酸銨分級沉淀分離

粗酶液進(jìn)行硫酸銨分級沉淀，收集 60%–90%硫酸銨飽和度區(qū)段的沉淀蛋白，溶于含1.4 mol/L (NH4)2SO4的0.07 mol/L乙酸緩沖液(pH 4.0) 中，測定其蛋白質(zhì)含量和蘆丁降解酶活力。

1.2.3 疏水層析分離

硫酸銨沉淀的溶解液上樣于經(jīng)平衡液Ⅰ (1.2 mol/L (NH4)2SO4的pH 4.0、0.06 mol/L乙酸緩沖液) 平衡的Phenyl Sepharose CL-4B柱 (1.8 cm×11.5 cm)，用平衡液Ⅰ洗脫至280<0.02，蒸餾水洗脫結(jié)合蛋白，收集蘆丁降解酶活性洗脫峰，于透析液 (pH 4.0，0.02 mol/L乙酸緩沖液) 中透析過夜。測定其蛋白質(zhì)含量和蘆丁降解酶活力。

1.2.4 陽離子交換層析分離

疏水層析活性峰收集液稀釋2倍后上樣經(jīng)平衡液Ⅱ (pH 4.0，0.1 mol/L乙酸緩沖液) 平衡過的CM-纖維素柱(1.8 cm×12 cm)，平衡液Ⅱ洗脫至280<0.02，線性梯度 (NaCl濃度梯度為0.1–0.4 mol/L) 洗脫結(jié)合蛋白，收集活性洗脫峰。用PEG 10 000濃縮收集液，測定其蛋白質(zhì)含量和蘆丁降解酶活力。

1.2.5 凝膠過濾層析分離

平衡液Ⅲ (含0.4 mol/L NaCl的pH 4.0， 0.2 mol/L乙酸緩沖液) 充分平衡柱子，將經(jīng)濃縮的蛋白樣品上樣于Sephadex G-150層析柱，用平衡液Ⅲ洗脫并收集活性洗脫峰，經(jīng)PEG 10 000濃縮后獲得純化的蘆丁降解酶，測定其蛋白質(zhì)含量和酶活力，并于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 蛋白質(zhì)含量和酶活的測定

粗酶液和每一次層析柱的洗脫液均進(jìn)行蛋白含量和酶活性測定。蛋白質(zhì)含量測定采用Bradford法[8]，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。蘆丁降解酶活性測定參照Chen等[9]的等吸收波長分光光度法，酶活測定體系為：160 μL 0.1%的蘆丁溶液 (含80 mmol/L、pH 4.0的乙酸緩沖液，20%甲醇) 中加入40 μL酶液，迅速混勻，40 ℃準(zhǔn)確保溫3 min，立即加入800 μL甲醇終止反應(yīng)，再加入4倍體積測定稀釋液 (含20 mol/L、pH 4.0的乙酸緩沖液，80%甲醇)，混勻后測定372 nm和344.5 nm光吸收并計(jì)算差值Δ。對照組以等體積乙酸緩沖液 (pH 4.0、0.1 mol/L) 代替酶液。以3 min光吸收的差值Δ變化0.01定義為一個酶活力單位 (1 U)。酶的總活力 (Total activity) 及比活力 (Specific activity) 的計(jì)算參考劉國琴等[10]的方法。

1.4 蘆丁降解酶分子量的測定

參照Laemmli UK[11]的方法，將純化的蘆丁降解酶進(jìn)行SDS-PAGE。取純化的酶液加入等體積2×SDS-PAGE上樣緩沖液并沸水浴處理5 min，離心后取上清進(jìn)行SDS-PAGE分析，濃縮膠濃度為3.3%，分離膠濃度為12%。經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R-250染色后于脫色液中脫色至條帶清晰，拍照記錄結(jié)果。

1.5 Native-PAGE分析蘆丁降解酶

參照Li等[7]的方法進(jìn)行蘆丁降解酶的Native-PAGE分析和活性染色。純化的酶液中加入等體積含溴酚藍(lán)的40%蔗糖溶液，上樣于10%分離膠的Native-PAGE。電泳結(jié)束后分離膠置于0.1 mol/L乙酸緩沖液 (pH 4.0) 中平衡40 min，然后置于30 mL、0.1%蘆丁溶液 (含80 mmol/L、 pH 4.0的乙酸緩沖液，20%甲醇) 中50 ℃反應(yīng)至凝膠出現(xiàn)明顯的黃色條帶，傾去反應(yīng)液用蒸餾水洗滌凝膠數(shù)次，置紫外燈下觀察記錄結(jié)果。

1.6 蘆丁降解酶N端氨基酸測序

轉(zhuǎn)移SDS-PAGE凝膠中分離的蘆丁降解酶條帶于PVDF膜，送樣至北京大學(xué)利用EDMAN降解法 (Procise 491，Applied Biosystems)測定蘆丁降解酶N端15個氨基酸序列。

1.7 蘆丁降解酶質(zhì)譜分析

純化的蘆丁降解酶送至上海厚基生物科技有限公司進(jìn)行質(zhì)譜分析。蛋白質(zhì)樣品用胰蛋白酶水解后的產(chǎn)物通過MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀分析得到酶解多肽的肽指紋圖譜 (PMF)。選擇15個強(qiáng)度較高的肽離子作為母離子進(jìn)行MALDI-TOF-MS (基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜) 二級質(zhì)譜分析，獲得二級質(zhì)譜圖。

用ProFound (http://prowl.rockefeller.edu/prowl-cgi/profound.exe) 提交PMF數(shù)據(jù)，與NCBI nr 數(shù)據(jù)庫比對，并將二級質(zhì)譜圖進(jìn)行解析獲得內(nèi)肽序列。

1.8 蘆丁降解酶的催化特性分析

1.8.1 pH對蘆丁降解酶活性和穩(wěn)定性的影響

pH對蘆丁降解酶活性的影響：將純化的蘆丁降解酶分別用pH 3.0、pH 4.0、pH 5.0、pH 6.0、pH 7.0、pH 8.0的0.2 mol/L乙酸緩沖液4 ℃透析過夜，參照本文1.3的方法測定蘆丁降解酶的活性。各測定樣設(shè)置3次重復(fù)。

pH對蘆丁降解酶穩(wěn)定性的影響：將純化的蘆丁降解酶分別用pH 3.0、pH 4.0、pH 5.0、pH 6.0、pH 7.0和pH 8.0的0.2 mol/L乙酸緩沖液4 ℃透析過夜，于40 ℃水浴保溫2 h，參照本文1.3的方法測定蘆丁降解酶的活性。各測定樣設(shè)置3次重復(fù)。

1.8.2 溫度對蘆丁降解酶活性和穩(wěn)定性的影響

溫度對蘆丁降解酶活性的影響：參照本文1.3的方法分別在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃溫度條件下，測定蘆丁降解酶的活性。各測定樣設(shè)置3次重復(fù)。

溫度對蘆丁降解酶穩(wěn)定性的影響：將純化的蘆丁降解酶分別在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃水浴中保溫2 h后，參照本文1.3的方法測定蘆丁降解酶的活性。各測定樣設(shè)置3次重復(fù)。

1.8.3 測定蘆丁降解酶的m值和max值

采用雙倒數(shù)作圖法測定蘆丁降解酶的m值和max值分別在0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%的底物濃度條件下 (底物溶于80 mmol/L、pH 4.0的乙酸緩沖液，20%甲醇) 測定蘆丁降解酶的活性。每測定設(shè)置3次重復(fù)。

1.8.4 金屬離子及EDTA對蘆丁降解酶活性的影響

用pH 4.0、0.1 mol/L乙酸緩沖液分別配制1 mmol/L、10 mmol/L兩種濃度的MnCl2、ZnCl2、CuSO4和EDTA溶液。取50 μL純化的蘆丁降解酶于1 mL各溶液中50 ℃保溫2 h，參照本文1.3的方法測定處理前后各溶液中蘆丁降解酶的活性。每種測定樣設(shè)置3次重復(fù)。

1.8.5 甲醇對蘆丁降解酶活性的影響

向蘆丁降解酶液中加入預(yù)冷的甲醇，使甲醇終濃度分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%和70%。–20 ℃靜置1 h，10 000 r/min冷凍離心20 min，取上清測定蘆丁降解酶的活性。各測定樣設(shè)置3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁降解酶的純化

經(jīng)過硫酸銨分級沉淀、疏水層析、陽離子交換層析和凝膠過濾層析純化的蘆丁降解酶在SDS-PAGE上顯示單一條帶，分子量約為66 kDa (圖1)。純化過程中在硫酸銨分級沉淀之后引入疏水層析，有效克服了透析除鹽步驟導(dǎo)致的沉淀對純化的負(fù)面影響，酶的比活力由1.58 U/mg提高到20.84 U/mg，純化倍數(shù)達(dá)到13.19倍，回收率達(dá)到7.39% (表1)。比唐宇等[5]報(bào)道的純化方法的純化倍數(shù) (11.3倍) 和回收率 (3.5%) 有所提高。純化的蘆丁降解酶經(jīng)Native-PAGE分離及活性染色，借助于槲皮素的紫外吸收特性，可檢測到凝膠上單一的槲皮素沉積的條帶 (圖2)，證明純化的蛋白為蘆丁降解酶。

圖1 純化蘆丁降解酶的SDS-PAGE分析

圖2 Native-PAGE鑒定蘆丁降解酶的活性 (泳道1，2為重復(fù)樣品)

2.2 蘆丁降解酶N端氨基酸測序

將純化的蘆丁降解酶利用EDMAN降解法(Procise 491，Applied Biosystems) 測定其N端15個氨基酸序列，測序結(jié)果為：N-Thr Val Ser Arg Ser Ser Phe Pro Asp Gly Phe Leu Phe Gly Leu(TVSRSSFPDGFLFGL)。利用http://www.ncbi. nm.nih.gov/BLAST/在線分析，未發(fā)現(xiàn)報(bào)道的相似序列。

2.3 蘆丁降解酶質(zhì)譜分析

2.3.1 蘆丁降解酶肽指紋圖譜分析

對蘆丁降解酶進(jìn)行MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析，得到其肽指紋圖譜 (PMF) (圖3)。用在線分析軟件ProFound進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，未發(fā)現(xiàn)類似的蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

2.3.2 蘆丁降解酶二級質(zhì)譜分析

選擇蘆丁降解酶PMF質(zhì)荷比分別為1 751.82、937.5、1 658.8、1 675.864、1 170.643 3、1 227.67、1 732.89、1 085.66、2 207.728 9、1 453.616、 1 562.8、1 022.5、1 186.556、1 365.68和 999.656 3的15個肽段作為母離子進(jìn)行MALDI- TOF-MS (基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜)二級質(zhì)譜分析，并進(jìn)行測序，獲得的15段蘆丁降解酶內(nèi)肽序列為：ETGL(I)NTFR，MTPVVYGEYPESMR，NGFTFVDYDNNL(I)TR，L(I)TYHSGHL(I)DK，GL(I)TYHSGHL(I)DK，L(I)SYTTDNHATTSFFK，L(I)SGGL(I)NQL(I)GVK，ETYNNPAVVL(I)TENG，AL(I)PVVYGEY，VADDFYHR，QYEGAAFTDGK，QSYEQLAEKNR和SL(I)GL(I)FPPL(I)R。蘆丁降解酶一級結(jié)構(gòu)的信息至今尚無報(bào)道，本研究獲得的N端序列以及內(nèi)肽序列為借助于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)確定目標(biāo)基因奠定了基礎(chǔ)。

表1 蘆丁降解酶的分離純化

Different letters mean significant differences (<0.05) in each column.

圖3 蘆丁降解酶肽指紋圖譜

2.4 蘆丁降解酶酶學(xué)性質(zhì)研究

2.4.1 pH對蘆丁降解酶活性和穩(wěn)定性的影響

如圖4所示，pH對蘆丁降解酶活性有顯著的影響。在pH 3.0–8.0范圍內(nèi)蘆丁降解酶均有活性且活性呈先增高后降低的規(guī)律，在pH 5.0時酶活性最大。pH是影響酶儲存穩(wěn)定性的重要參數(shù)，將處于pH 3.0–8.0的緩沖液的蘆丁降解酶40 ℃保溫2 h后在最適催化條件下測定其殘余活性，發(fā)現(xiàn)pH對蘆丁降解酶穩(wěn)定性的影響與對其活性影響的趨勢一致。最適pH和最穩(wěn)定pH為蘆丁降解酶的分離純化、催化反應(yīng)及保存條件的選擇提供了基礎(chǔ)資料。本研究結(jié)果與唐宇等[5]和Bourbouze等[12]純化的蘆丁降解酶的最適pH值基本一致。

2.4.2 溫度對蘆丁降解酶活性和穩(wěn)定性的影響

溫度是影響酶活性的重要因素。如圖5所示，蘆丁降解酶在20–70 ℃溫度范圍內(nèi)均有活性，且活性呈先增高后降低的規(guī)律，在50 ℃時活性最高，高于50 ℃蘆丁降解酶活性急劇下降。穩(wěn)定性分析顯示，預(yù)保溫溫度在20–50 ℃范圍內(nèi)蘆丁降解酶的活性無明顯的變化，但當(dāng)溫度超過60 ℃時酶的穩(wěn)定性急劇下降，70 ℃預(yù)保溫2 h酶的活性僅殘留約45%。唐宇等[5]和Bourbouze等[12]從蕎麥籽粒中純化的蘆丁降解酶的最適溫度分別為40 ℃和30 ℃，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在較大的差異，很可能是由于研究對象屬于不同的蘆丁降解酶同工酶。

2.4.3 蘆丁降解酶的m值和max值

測定蘆丁降解酶在梯度底物濃度條件下的反應(yīng)速度，根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法計(jì)算其m值和max值分別為0.27 mmol/L和39.68 U/mg (圖6)。Baumgertel等[13]報(bào)道的蘆丁降解酶的m值和max值分別為0.561 μmol/L和44.69 U/mg，Yasuda等[2]從苦蕎籽粒中純化的兩種蘆丁降解酶同工酶的m值分別為0.12 mol/L和0.13 mol/L。該研究與前人報(bào)道的結(jié)果存在較大的差異，很可能是由于研究對象分別屬于不同的蘆丁降解酶同工酶。

2.4.4 金屬離子和EDTA對蘆丁降解酶活性的影響

金屬離子對蘆丁降解酶活性的影響與離子的種類和濃度有關(guān)(表2)。低濃度的金屬離子即可對蘆丁降解酶活性產(chǎn)生抑制，其中10 mmol/L ZnCl2對蘆丁降解酶的抑制作用最強(qiáng)，殘余酶活僅為54.36%±2.70%；1 mmol/L CuSO4對蘆丁降解酶的抑制作用最弱，殘余酶活為89.47%±3.60%。此外，EDTA對蘆丁降解酶也有抑制作用。

2.4.5 甲醇對蘆丁降解酶活性的影響

如圖7所示，甲醇終濃度在10%–50% (/) 范圍內(nèi)蘆丁降解酶的活性幾乎無明顯變化，當(dāng)甲醇終濃度大于50%時酶活性迅速下降，表明蘆丁降解酶能夠耐受50% (/) 的甲醇，對甲醇有良好的耐受性。與陳芳霞[14]研究的蘆丁降解酶對甲醇耐受性的結(jié)果相似。

圖4 pH對蘆丁降解酶活性和穩(wěn)定性的影響

圖5 溫度對蘆丁降解酶活性和穩(wěn)定性的影響

圖6 Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法測定蘆丁降解酶的Km和Vmax

表2 不同金屬離子和EDTA對蘆丁降解酶活性的影響

Analysis of significant difference between enzyme activity with T test. Control: the activity of untreated RDE.*: significant difference (<0.05); **: extremely significant difference (<0.01).

圖7 甲醇對蘆丁降解酶活性的影響

3 討論

蘆丁降解酶是蕎麥中重要的內(nèi)源性糖苷酶，其特異性水解蘆丁，是苦蕎苦味的重要來源之一。Yasuda等[15]首先報(bào)道苦蕎中的蘆丁降解酶主要分布在子葉和種皮中，苦蕎中蘆丁降解酶的活性較普通蕎麥高680倍。與蕎麥蘆丁代謝相關(guān)的酶的表達(dá)調(diào)控已有少量的文獻(xiàn)報(bào)道。Suzuki等對苦蕎中的3-黃酮醇-葡萄糖苷酶活性及黃酮類化合物的含量進(jìn)行了一系列研究，發(fā)現(xiàn)在苦蕎和普通蕎麥種子成熟過程中，3-蘆丁-葡萄糖苷酶和3-異槲皮苷-葡萄糖苷酶活性增大，在完全成熟的種子中活性略有降低。蘆丁和異槲皮苷濃度隨種子成熟而增加，蘆丁在完全成熟的種子中保持較高濃度[16]。UV-B輻射、干旱和低溫脅迫的苦蕎，其葉片中3-蘆丁-葡萄糖苷酶活性分別增加了363%、158%和190%，蘆丁含量變化分別為增加了122%、129%和無明顯變化[17]?？嗍w種子萌發(fā)后其子葉和種皮中的黃酮醇-3-葡萄糖苷酶活性下降，種子萌發(fā)12 d內(nèi)蘆丁含量逐漸增大，而槲皮素含量在種子萌發(fā)后立即增大，萌發(fā)后第4天達(dá)到峰值并在4–12 d基本保持不變[18]。國內(nèi)王改玲[19]研究表明，苦蕎籽粒萌發(fā)過程中蘆丁含量增高，蘆丁降解酶活性被抑制。陳鵬等[20]研究發(fā)現(xiàn)苦蕎籽粒萌發(fā)過程中總黃酮含量增加，籽粒萌發(fā) 3 d內(nèi)種胚中的蘆丁降解酶活性無明顯變化，從第4天開始迅速下降，至胚被子葉完全吸收其活性消失，內(nèi)種皮中的蘆丁降解酶則在籽粒萌發(fā)過程中一直保持較高活性。周小理等[21]用磁場影響苦蕎種子萌發(fā)，發(fā)現(xiàn)磁場處理3 d內(nèi)蘆丁降解酶的活性受磁場影響而增加，第4–7天其活性基本不受磁場影響，苦蕎籽粒中類黃酮的含量也隨磁場對蘆丁降解酶(RDE)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和查爾酮異構(gòu)酶(CHI)活性的影響而增加。以上研究顯示，蘆丁降解酶與苦蕎次生代謝物的累積有著密切的關(guān)系。

Yasuda等[2]首次從苦蕎種子中純化了分子量為70 kDa的蘆丁降解酶。國內(nèi)唐宇等[5]和 Cui等[6]從苦蕎種子中純化了分子量分別為60 kDa和70 kDa的蘆丁降解酶。本實(shí)驗(yàn)室采用非變性電泳結(jié)合Western blotting的方法證明在苦蕎種子中至少存在5種蘆丁降解酶的同工酶[7]。m和max以及溫度和pH是表征酶特征的重要參數(shù)。唐宇等[5]和Bourbouze等[12]純化的蘆丁降解酶最適pH值和最適溫度分別為pH 5.0、40 ℃和pH 4.8、30 ℃，且Baumgertel等[13]純化的蘆丁降解酶的m值和max值分別為0.561 μmol/L和44.69 U/mg。Yasuda等分離的蘆丁降解酶粗酶液在pH 3.0–7.0范圍內(nèi)有活性，并在溫度高于70 ℃時失活[15]，其純化的兩種蘆丁降解酶m值分別為0.12 mol/L和0.13 mol/L[2]。本研究純化的66 kDa蘆丁降解酶最適pH值和最適溫度分別為pH 5.0、50 ℃，在pH 3.0–8.0和20–70 ℃有活性，m值和max值分別為0.27 mmol/L、39.68 U/mg。

已有的蘆丁降解酶研究證明在苦蕎中存在蘆丁降解酶的同工酶形式，但研究并未獲得蘆丁降解酶的一級結(jié)構(gòu)信息。本研究在純化獲得蘆丁降解酶的基礎(chǔ)上，通過N端測序和質(zhì)譜分析獲得了蘆丁降解酶N端的氨基酸序列和15個內(nèi)肽段的序列，為克隆蘆丁降解酶的基因以及深入研究蘆丁降解酶的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)，也為通過分子手段培育高蘆丁蕎麥品種奠定了基礎(chǔ)。

有機(jī)溶劑特別是極性有機(jī)溶劑是酶的強(qiáng)變性劑。不同酶對有機(jī)溶劑的敏感性存在較大的差異。Yasuda等[3]研究表明20% (/) 的水溶性溶劑如乙醇、DMSO可提高蘆丁降解酶活性。徐寶才等[22]研究發(fā)現(xiàn)蘆丁降解酶在20%乙醇中活性最高。王改玲等[4]發(fā)現(xiàn)濃度高于40% (/) 的乙醇對蘆丁降解酶有明顯的抑制作用。陳芳霞[14]研究發(fā)現(xiàn)蘆丁降解酶在10%–40%的甲醇中活性變化不明顯，50% (/) 的甲醇使其活性降低。本研究純化獲得的蘆丁降解酶可以耐受50%的甲醇，這種對有機(jī)溶劑的耐受性在酶學(xué)研究中鮮有報(bào)道，對從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的角度深入探討蘆丁降解酶對有機(jī)溶劑耐受性的內(nèi)在機(jī)制有著重要的理論價值，同時為非水相體系中蘆丁降解酶的催化活性的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。非水酶學(xué)是酶學(xué)發(fā)展的重要分支，在非水相條件下一些酶可以完成水相條件下不能實(shí)現(xiàn)的催化反應(yīng)，并已展現(xiàn)出顯著的生物催化優(yōu)勢。夏詠梅等[23]研究發(fā)現(xiàn)無溶劑非水相中脂肪酶能夠高效催化葵酸偏甘油酯的合成，且操作性和經(jīng)濟(jì)性遠(yuǎn)高于其他類型的葵酸偏甘油酯合成反應(yīng)。Kansal等[24]研究維斯假絲酵母全細(xì)胞參與的轉(zhuǎn)化反應(yīng)時，發(fā)現(xiàn)加入異丙醇可使底物溶解度和轉(zhuǎn)化率增大，70 mmol/L底物反應(yīng)1 h，轉(zhuǎn)化率增加了81%。利用酶在微水有機(jī)溶劑、離子性液體和反膠束體系等非水相體系中催化生產(chǎn)食品添加劑，如酸酯、糖酯和維生素等，能夠簡化合成步驟，降低成本和分離純化的復(fù)雜性，促進(jìn)了食品添加劑的快速和可持續(xù)發(fā)展[25]。利用脂肪酶在有機(jī)溶劑中催化制備手性藥物中間體，可以完成在水相化學(xué)合成中難以進(jìn)行的反應(yīng)，并且反應(yīng)成本低、安全性好，產(chǎn)物收率高、有良好的化學(xué)性能[26]。非水相條件下生物催化劑的活性及穩(wěn)定性下降是酶的非水酶學(xué)應(yīng)用的最大障礙，篩選和提高耐有機(jī)溶劑的酶是非水相體系實(shí)踐應(yīng)用的重要前提[27]。本研究純化獲得的蘆丁降解酶對極性有機(jī)溶劑表現(xiàn)出優(yōu)異的耐受性，對其非水相條件下催化特性的深入分析，將有助于其在糖苷類次生代謝物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，特別是用于自然界稀有次生代謝物的轉(zhuǎn)化和合成。

本研究優(yōu)化建立了苦蕎籽粒66 kDa蘆丁降解酶的純化方法，其m值和max分別為0.27 mmol/L和39.68 U/mg，最適pH和最適溫度分別為pH 5.0和50 ℃。Cu2＋、Zn2＋、Mn2＋和EDTA對其有不同程度的抑制作用。純化的蘆丁降解酶可耐受50% (/) 的甲醇。獲得了蘆丁降解酶N端15個氨基酸序列和15個內(nèi)肽段序列。部分一級結(jié)構(gòu)的獲得為確定蘆丁降解酶的候選基因以及深入研究蘆丁降解酶的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

[1] Fabjan N, Rode J, Ko?ir IJ, et al. Tartary buckwheat (Gaertn.) as a source of dietary rutin and quercitrin. J Agric Food Chem, 2003, 51(22): 6452–6455.

[2] Yasuda T, Nakagawa H. Purification and characterization of the rutin-degrading enzymes in tartary buckwheat seeds. Phytochemistry, 1994, 37(1): 133–136.

[3] Yasuda T, Shinoyama H. The activity of rutin-degrading enzyme in the presence of water-soluble organic solvents. Nipp. Shok. Kaga Koga Kaishi , 1995, 42(12): 1012–1018.

[4] Wang GL, Zhou L, Liang R, et al. Effect of different extraction conditions on rutin hydrolysis of fagopyrum tataricum seeds. Acta Bot Boreal-Occident Sin, 2005, 25(5): 1035–1038 (in Chinese). 王改玲, 周樂, 梁冉, 等. 不同提取條件對苦蕎籽粒中蘆丁降解的影響. 西北植物學(xué)報(bào), 2005, 25(5): 1035–1038.

[5] Tang Y, Shao JR, Luo QL, et al. Purification of rutin degrading enzyme from wild buckwheat kernels. J Sichuan Agric Univ, 2011, 29(3): 391–396 (in Chinese). 唐宇, 邵繼榮, 羅慶林, 等. 野生蕎麥籽粒中蘆丁降解酶的分離純化. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 29(3): 391–396.

[6] Cui XD, Wang ZH. Preparation and properties of rutin-hydrolyzing enzyme from tartary buckwheat seeds. Food Chem, 2012, 132(1): 60–66.

[7] Li YP, Deng DD, Zhang XB, et al. Direct detection of rutin-degrading isozymes with polyacrylamide gel electrophoresis. Anal Biochem, 2013, 443(2): 240–242.

[8] Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 1976, 72(1/2): 248–254.

[9] Chen P, Gu JJ. A rapid measurement of rutin-degrading enzyme activity in extract of tartary buckwheat seeds. Food Bioprod Process, 2011, 89(1): 81–85.

[10] Liu GQ, Wu W, Chen P. Current Experimental Techniques for Protein. Beijing: China Agricultural University Press, 2011: 138–142 (in Chinese). 劉國琴, 吳瑋, 陳鵬. 現(xiàn)代蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)技術(shù). 北京: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社, 2011: 138–142.

[11] Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, 227(5259): 680–685.

[12] Bourbouze R, Pratviel-Sosa F, Percheron F. Purification, properities and specifity of heteroglycosidase from buckwheat granis. Biochimie, 1974, 56: 1305–1313.

[13] Baumgertel A, Grimm R, Eisenbei? W, et al. Purification and characterization of a flavonol 3-O-β-heterodisaccharidase from the dried herb ofMoench. Phytochemistry, 2003, 64(2):411–418.

[14] Chen FX. Gene polymorphisms, expression and characterization of rutin degrading enzyme from tatary buckwheat [D]. Xianyang: Northwest A&F University, 2016 (in Chinese). 陳芳霞. 苦蕎蘆丁降解酶基因多態(tài)性分析和蛋白重組表達(dá)及催化特性分析[D]. 咸陽: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2016.

[15] Yasuda T, Masaki K, Kashiwagi T. An enzyme degrading rutin in tartary buckwheat seeds. Nipp. Shok. Kaga Koga Kaishi, 1992, 39(11): 994–1000.

[16] Suzuki T, Honda Y, Funatsuki W, et al. Purification and characterization of flavonol 3-glucosidase, and its activity during ripening in tartary buckwheat seeds. Plant Sci, 2002, 163(3): 417–423.

[17] Suzuki T, Honda Y, Mukasa Y. Effects of UV-B radiation, cold and desiccation stress on rutin concentration and rutin glucosidase activity in tartary buckwheat () leaves. Plant Sci, 2005, 168(5): 1303–1307.

[18] Suzuki T, Kim SJ, Takigawa KS, et al. Changes in rutin concentration and flavonol-3-glucosidase activity during seedling growth in tartary buckwheat (Gaertn.). Can J Plant Sci, 2007, 87(1): 83–87.

[19] Wang GL. Study on rutin and rutin-degrading enzymes in the seed of buckwheat[D]. Yangling: Northwest A&F University, 2005 (in Chinese). 王改玲. 苦蕎籽粒中蘆丁及蘆丁降解酶的應(yīng)用研究[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2005.

[20] Chen P, Hou ZF. Metabolic profiles of rutin-degrading enzyme during seed germination process of tartary buckwheat. Acta Agric Boreal-Occident Sin, 2010, 19(7): 48–52 (in Chinese). 陳鵬, 侯智法. 苦蕎種子萌發(fā)過程蘆丁降解酶的代謝規(guī)律. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2010, 19(7): 48–52.

[21] Zhou XL, Fang X, Zhou YM, et al. Effect of magnetic field stimulation on flavonoid synthesis in tartary buckwheat (Gaertn.) sprouts. Food Sci, 2012, 33(21): 20–23 (in Chinese). 周小理, 方向, 周一鳴, 等. 磁場對苦蕎種子萌發(fā)過程中黃酮類物質(zhì)的誘導(dǎo)效應(yīng). 食品科學(xué), 2012, 33(21): 20–23.

[22] Xu BC, Ding XL. Study on the extraction process of flavonoids from tartary buckwheat shell. Sci Technol Food Ind, 2002, 23(8): 40–43 (in Chinese). 徐寶才, 丁霄霖. 苦蕎殼中黃酮提取工藝的研究. 食品工業(yè)科技, 2002, 23(8): 40–43.

[23] Xia YM, Fang Y, Zhang KC, et al. Synthesis of partial glycerol caprates by using lipase in nonaqueous media. Chin J Biotech, 2002, 18(6): 735–739 (in Chinese). 夏詠梅, 方云, 章克昌, 等. 非水相酶促合成癸酸偏甘油酯的研究. 生物工程學(xué)報(bào), 2002, 18(6): 735–739.

[24] Kansal H, Banerjee UC. Enhancing the biocatalytic potential of carbonyl reductase ofusing aqueous-organic solvent system. Bioresour Technol, 2009, 100(3): 1041–1047.

[25] Yu SL, Yu L, Yu B, et al. Advances in application of non-aqueous phase enzymatic catalysis in food additive production. Agric Sci Technol, 2013, 14(1): 169–175.

[26] Zhao SX. Research progress of nonaqueous phase lipase in preparing chiral drug intermediates. Chin Adhes, 2015, 24(10): 53–58 (in Chinese). 趙世霞. 非水相中脂肪酶制備手性藥物中間體的研究進(jìn)展. 中國膠粘劑, 2015, 24(10): 53–58.

[27] Yang ZY, Ni Y, Sun ZH. Recent trend of nonaqueous enzymology and biocatalysis in nonaqueous media. Chin J Biotech, 2009, 25(12): 1779–1783 (in Chinese). 楊仲毅, 倪曄, 孫志浩. 非水酶學(xué)和非水相生物催化研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2009, 25(12): 1779–1783.

(本文責(zé)編 郝麗芳)

Purification, characterization and partial primary structure analysis of rutin-degrading enzyme in tartary buckwheat seeds

Yuwei Zhang, Jie Li, Yong Yuan, Jijuan Gu, and Peng Chen

College of Life Sciences, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi, China

Rutin-degrading enzymes (RDE) can degrade rutin into poorly water soluble compound, quercetin, and cause the bitter taste in tartary buckwheat. In the present study RDE from Yu 6-21 tartary buckwheat seeds was purified by ammonium sulphate precipitation, followed by hydrophobic interaction chromatography on Phenyl Sepharose CL-4B, ion exchange chromatography on CM-Cellulose and gel filtration chromatography on Sephadex G-150. Purified RDE showed single band with molecular weight of 66 kDa on SDS-PAGE. The optimum pH and temperature of RDE were 5.0 and 50 ℃ respectively. Themwas 0.27 mmol/L, and themaxwas 39.68 U/mg. The RDE activity could be inhibited by Cu2+, Zn2+, Mn2+and EDTA, and showed tolerance to 50% methanol (/). The N terminal sequence (TVSRSSFPDGFLFGL) was obtained by Edman degradation method and 15 internal peptide sequences were determined by MALDI-TOF-MS (matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry). These results established the foundations for identification of the candidate gene of RDEtranscriptome data and further studying RDE biological function.

tartary buckwheat, rutin-degrading enzyme, purification, characterization

November 1, 2016; Accepted: January 20, 2017

Peng Chen. Tel/Fax: +86-29-87091637; E-mail: pengchen@nwsuaf.edu.cn

10.13345/j.cjb.160414

Supported by:National Natural Science Foundation of China (Nos. 30400282, 31171606).

國家自然科學(xué)基金(Nos. 30400282, 31171606)資助。

2017-02-13

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170213.1404.001.html