伍正彬, 羅大林, 蔣東坡

(1. 重慶市東南醫(yī)院 ICU, 重慶, 401336; 2. 第三軍醫(yī)大學(xué)附屬第三醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科, 重慶, 400042)

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干擾表皮生長(zhǎng)因子受體表達(dá)對(duì)腦出血后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響及其機(jī)制

伍正彬1, 羅大林2, 蔣東坡2

(1. 重慶市東南醫(yī)院 ICU, 重慶, 401336; 2. 第三軍醫(yī)大學(xué)附屬第三醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科, 重慶, 400042)

目的 觀察干擾表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)表達(dá)對(duì)腦出血后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響。方法 注射Ⅶ型膠原酶制備腦出血模型大鼠，同時(shí)設(shè)置假手術(shù)組作為對(duì)照。術(shù)后7 d, 行神經(jīng)功能評(píng)分判斷造模成功與否。取腦出血模型大鼠和假手術(shù)大鼠，行SP免疫組化法檢測(cè)腦組織EGFR和神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達(dá)。分離新生大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞，體外培養(yǎng)。觀察干擾EGFR表達(dá)對(duì)細(xì)胞的影響，實(shí)驗(yàn)分4組: ① 對(duì)照組：不處理; ② 重組大鼠睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)組：加入20 μg/L CNTF; ③ 陰性組：加入20 μg/L CNTF, 并轉(zhuǎn)染EGFR siRNA陰性對(duì)照; ④ EGFR組：加入20 μg/L CNTF, 并轉(zhuǎn)染EGFR siRNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞EGFR、GFAP、磷酸化酪胺酸激酶JAK1(p-JAK1)、磷酸化信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(p-STAT3)的表達(dá)。結(jié)果 腦出血模型大鼠造模成功率89.5%(17/19)。腦出血模型大鼠腦組織EGFR和GFAP表達(dá)顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)。EGFR組EGFR mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組、CNTF組和陰性組(P<0.05)。CNTF組和陰性組GFAP mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和EGFR組(P<0.05), 而對(duì)照組和EGFR組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。 CNTF組和陰性組p-JAK1和p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和EGFR組(P<0.05), 而對(duì)照組和EGFR組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。結(jié)論 腦出血大鼠EGFR和GFAP表達(dá)升高，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化。干擾EGFR表達(dá)可抑制大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，其機(jī)制可能與阻滯JAK1和STAT3磷酸化有關(guān)。

表皮生長(zhǎng)因子; 神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白; 磷酸化酪胺酸激酶JAK1; 磷酸化信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3;星形膠質(zhì)細(xì)胞

腦出血是ICU常見(jiàn)的危急重癥之一，死亡率和致殘率極高，不僅嚴(yán)重影響患者生命健康和生活質(zhì)量，還給家庭和社會(huì)造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。腦出血后繼發(fā)的腦損傷是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的主要因素之一，這種繼發(fā)性損傷機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，眾多學(xué)者也做了大量研究，但其具體機(jī)制尚不十分明確。近年來(lái)有研究[2-3]認(rèn)為，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化在腦出血后繼發(fā)性腦損傷過(guò)程中扮演重要角色，是引起繼發(fā)性腦損傷的重要效應(yīng)細(xì)胞。有研究[4]發(fā)現(xiàn)，中風(fēng)、顱腦損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷患者，腦組織中表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)表達(dá)顯著增加，且大多表達(dá)在活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，推測(cè)EGFR可能在星形膠質(zhì)細(xì)胞活化過(guò)程中發(fā)揮作用。本研究通過(guò)構(gòu)建腦出血模型大鼠和體外培養(yǎng)大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞，觀察EGFR對(duì)腦出血后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

Sprague-Dawley健康大鼠40只, 3 d以內(nèi)的新生大鼠10只，均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院北京斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SCXK京2011-0012)。新生大鼠購(gòu)回次日即用于皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞分離，其他大鼠購(gòu)回后適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后再用于實(shí)驗(yàn)。SP免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。兔抗大鼠EGFR、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、磷酸化酪胺酸激酶JAK1(p-JAK1)、磷酸化信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(p-STAT3), 以及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素雙抗均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。EGFR siRNA及其陰性對(duì)照核苷酸序列均委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。EGFR siRNA上游: 5′-CCUUAGCAGUCUUAUCUAATDT-3'; 下游: 5′-dTdTGGAAUCGUCAGAAUAGAUU-3′。陰性對(duì)照上游: 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′; 下游: 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3′。重組大鼠睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司。Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、TRIzol總RNA提取試劑均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自美國(guó)ABI Applied Biosystems公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 腦出血模型大鼠制備：制備腦出血模型大鼠共20只。參照文獻(xiàn)[5]標(biāo)準(zhǔn), 10%水合氯醛(0.3 g/kg)腹腔注射麻醉，俯臥固定于鼠腦立體定向儀上。參照鼠腦立體定位儀圖譜，開(kāi)一骨窗，通過(guò)微量注射器注入2 μL的Ⅶ型膠原酶(0.20 U/μL), 逐層縫合傷口，抗生素預(yù)防感染，自然蘇醒后常規(guī)飼養(yǎng)。同時(shí)取20只大鼠行同樣的開(kāi)骨窗操作，注入等量生理鹽水，其余操作相同，作為假手術(shù)組。術(shù)后7 d, 采用Bederson評(píng)分法行神經(jīng)功能評(píng)分以判斷造模是否成功。0分：神經(jīng)功能無(wú)缺失; 1分：提尾倒掛時(shí)損傷對(duì)側(cè)前肢屈曲; 2分：前肢屈曲及對(duì)側(cè)抵抗推力下降; 3分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈; 4分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈及意識(shí)障礙。1～3分視為造模成功。

1.2.2 免疫組化檢測(cè)EGFR和GFAP表達(dá)：腦出血模型大鼠和假手術(shù)大鼠各10只，取腦組織, 10%中性甲醛固定，石蠟包埋, 4 μm連續(xù)切片。行SP免疫組化法檢測(cè)EGFR和GFAP表達(dá)。具體步驟: 4 μm組織切片, 60 ℃烤片2 h, 二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化; 37 ℃的3% H2O2溶液孵育10 min, 檸檬酸高壓抗原修復(fù)法修復(fù); PBS洗凈，加入兔抗大鼠一抗(抗GFAP、抗EGFR)工作液, 4 ℃孵育24 h; PBS洗凈，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗工作液, 37 ℃孵育30 min; 顯色劑顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇水化，二甲苯透明，最后封片。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞比例和染色程度行半定量分析[6]: 陽(yáng)性細(xì)胞比例<5%、5%～24%、25%～50%、51%～74%、>75%, 分別計(jì)為0、1、2、3、4分; 無(wú)、弱、中、強(qiáng)染色，分別計(jì)為0、1、2、3分。綜合兩項(xiàng)計(jì)分之和: 0分陰性(-), 1～2分弱陽(yáng)性(+), 3～5分中度陽(yáng)性(2+), 6～7分強(qiáng)陽(yáng)性(3+)。

1.2.3 大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng): 3 d以內(nèi)的新生大鼠5只，取大腦皮層組織，剪碎成小塊, 0.25%胰蛋白酶消化30 min, 胎牛血清終止消化, 1 000 r/min離心5 min, 棄去上層液體，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液, 100目篩網(wǎng)過(guò)濾，調(diào)整細(xì)胞密度至4×108個(gè)/L，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶, 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔3 d更換培養(yǎng)液，細(xì)胞生長(zhǎng)至85%融合時(shí), 0.25%胰酶消化、傳代。收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 EGFR siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分組與處理：處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的星形膠質(zhì)細(xì)胞接種于6孔板，實(shí)驗(yàn)分4組: ① 對(duì)照組：正常培養(yǎng)，不處理; ② CNTF組：加入20 μg/L的CNTF; ③ 陰性組：加入20 μg/L的CNTF, 并轉(zhuǎn)染EGFR siRNA陰性對(duì)照; ④ EGFR組：加入20 μg/L的CNTF, 并轉(zhuǎn)染EGFR siRNA。轉(zhuǎn)染方法: EP管中配置轉(zhuǎn)染A液(EGFR siRNA或其陰性對(duì)照各100 μL+無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基100 μL), 轉(zhuǎn)染B液(Lipofectamine 2000 5 μL+無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基100 μL)。混合A、B液，室溫靜置20 min。取出正常培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，棄去原培養(yǎng)液，加入A/B混合液。孵育6 h，棄去轉(zhuǎn)染液，更換為含10%胎牛血清的正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)：收集各組細(xì)胞, TRIzol法提取細(xì)胞總RNA, 核酸蛋白分析儀進(jìn)行RNA質(zhì)量評(píng)估，若A260/A280為1.8～2.0, 則滿足實(shí)驗(yàn)要求。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作反轉(zhuǎn)錄成合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。EGFR上游: 5′-AACACAGTGGAGCGAATTCCTTT-3′; 下游: 5′-GGAAGTCCATCGACATGTTGCT-3′。GFAP上游: 5′-TAATGACTATCGCCGCCAACTG-3′; 下游: 5′-TTCGCCCTCCGCAATTTC-3′。GAPDH 上游: 5′-GGAGCCAAACGGGTCATCATCTC-3′; 下游: 5′-ATGCCTGCTTCACCACCACCTTG -3′。擴(kuò)增條件: 94 ℃ 3 min, 94 ℃ 1 min, 61 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 共35個(gè)循環(huán), 72 ℃ 7 min。采用2-△△Ct計(jì)算目的基因相對(duì)含量(RQ), RQ=2-△△Ct。

1.2.6 蛋白印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)：收集各組細(xì)胞，冰浴下加RIPA細(xì)胞裂解液。裂解30 minG 轉(zhuǎn)移至離心管G 4 ℃下10 000 r/min離心5 min, 取上清蛋白液。BCA法測(cè)定蛋白濃度, -20 ℃保存?zhèn)溆谩?00μg蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜。TBST漂洗, 5%脫脂奶粉室溫封閉1 h, 兔抗大鼠一抗(抗EGFR、抗GFAP、抗p-JAK1、抗p-STAT3)工作液, 4 ℃孵育過(guò)夜。TBST漂洗，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗工作液, 37 ℃孵育1 h。TBST漂洗，暗室內(nèi)ECL顯色、曝光。Band Scan 5.0軟件分析條帶光密度值，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白光密度值/內(nèi)參β-actin光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析所有數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用One-way ANOVO單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。等級(jí)資料的比較采用秩和檢驗(yàn)。取雙側(cè)α<0.05為檢測(cè)水準(zhǔn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腦出血模型大鼠腦組織EGFR和GFAP表達(dá)

造模大鼠共20只，造模7 d后，因傷口感染死亡1只。剩余19只行神經(jīng)功能評(píng)分證實(shí)造模成功17只，造模成功率89.5%(17/19)。取腦出血模型大鼠和假手術(shù)大鼠各10只，行免疫組化檢測(cè)。腦出血模型大鼠腦組織膠質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)中，分布大量黃色至棕黃色的EGFR和GFAP陽(yáng)性顆粒(圖1-②, 圖1-④), 假手術(shù)組大鼠僅見(jiàn)少量表達(dá)(圖1-①, 圖1-③)。半定量分析結(jié)果表明，腦出血模型大鼠腦組織EGFR和GFAP表達(dá)顯著高于假手術(shù)組(P<0.05), 見(jiàn)表1。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，其表達(dá)增加說(shuō)明腦出血模型大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞活化。

①:假手術(shù)組大鼠腦組織EGFR表達(dá);②:腦出血模型大鼠腦組織EGFR表達(dá);③:假手術(shù)組大鼠腦組織GFAP表達(dá);④:腦出血模型大鼠腦組織GFAP表達(dá)圖1 免疫組化檢測(cè)假手術(shù)組和腦出血模型組大鼠EGFR和GFAP表達(dá)(200倍)

表1 手術(shù)組和腦出血模型組大鼠EGFR和GFAP表達(dá)

與假手術(shù)組比較, *P<0.05。

2.2 EGFR siRNA對(duì)EGFR表達(dá)的影響

與對(duì)照組、CNTF組和陰性組比較, EGFR組細(xì)胞EGFR mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量分別下降91%和87%, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 而對(duì)照組、CNTF組和陰性組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。說(shuō)明EGFR siRNA可顯著抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞EGFR表達(dá)，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。見(jiàn)圖2。

與對(duì)照組、CNTF組和陰性組, *P<0.05

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白印跡法檢測(cè)EGFR mRNA和蛋白表達(dá)

2.3 干擾EGFR表達(dá)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響

與對(duì)照組比較, CNTF組和陰性組細(xì)胞GFAP mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著增加(P<0.05), 而CNTF組和陰性組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。與CNTF組和陰性組比較, EGFR組細(xì)胞GFAP mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著減少(P<0.05), 且與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，其表達(dá)增加說(shuō)明CNTF可明顯活化星形膠質(zhì)細(xì)胞，而干擾EGFR表達(dá)可抑制CNTF引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化。見(jiàn)圖3。

與對(duì)照組比較, *P<0.05;與CNTF組和陰性組比較, #P<0.05

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白印跡法檢測(cè)GFAP mRNA和蛋白表達(dá)

2.4 干擾EGFR表達(dá)對(duì)p-JAK1和p-STAT3表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較, CNTF組和陰性組細(xì)胞p-JAK1和p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著增加(P<0.05), 而CNTF組和陰性組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。與CNTF組和陰性組比較, EGFR組細(xì)胞p-JAK1和p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著減少(P<0.05), 且與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。說(shuō)明星形膠質(zhì)細(xì)胞活化可能與JAK1和STAT3磷酸化有關(guān)，而干擾EGFR表達(dá)可阻滯JAK1和STAT3磷酸化。見(jiàn)圖4。

與對(duì)照組比較,*P<0.05;與CNTF組和陰性組比較,#P<0.05圖4 蛋白印跡法檢測(cè)p-JAK1和p-STAT3蛋白表達(dá)

3 討 論

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的細(xì)胞，對(duì)神經(jīng)元具有支持和滋養(yǎng)的作用。近年來(lái)，有關(guān)星形膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷或病變過(guò)程中的作用研究備受青睞。通常情況下星形膠質(zhì)細(xì)胞存在靜止和活化兩種細(xì)胞形態(tài)，而腦出血發(fā)生時(shí)，其迅速?gòu)撵o止態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨瘧B(tài)。一般認(rèn)為活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞具有雙重作用[7-8]: 一方面，腦出血損傷早期，通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，增強(qiáng)神經(jīng)元對(duì)缺血、缺氧的耐受能力，從而保護(hù)神經(jīng)元; 另一方面，過(guò)度增殖形成的膠質(zhì)瘢痕阻礙軸突的再生、延長(zhǎng)和融合; 膠質(zhì)瘢痕還可壓迫微血管，影響腦組織局部血液供應(yīng)，造成繼發(fā)性損傷。多數(shù)學(xué)者[9]認(rèn)為，腦出血后活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元的損傷作用大于其保護(hù)作用，被認(rèn)為是引起腦出血后繼發(fā)性腦損傷的關(guān)鍵因素之一。GFAP是一種僅見(jiàn)于星形膠質(zhì)細(xì)胞的Ⅲ型中間絲狀蛋白，參與細(xì)胞骨架的構(gòu)成。Gomes等[10]研究證實(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化伴隨著GFAP表達(dá)的顯著上調(diào)，可認(rèn)為GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的特異性標(biāo)志物。本研究也采用觀察GFAP表達(dá)的變化作為判斷星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的指標(biāo)，結(jié)果顯示，腦出血模型大鼠腦組織GFAP的表達(dá)顯著高于假手術(shù)組，這與肖霖等[11]和錢紅等[12]研究結(jié)果基本一致。說(shuō)明腦出血后靜態(tài)的星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞，而這種轉(zhuǎn)化在腦出血后繼發(fā)性腦損傷中發(fā)揮重要作用。

如何有效抑制腦損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，對(duì)于促進(jìn)腦損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)，減少繼發(fā)性腦損傷，改善患者預(yù)后，降低死亡率和致殘率等方面具有重要價(jià)值。研究[13]顯示, EGFR 及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在腦損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化中發(fā)揮作用。JAKs-STATs是 EGFR 常見(jiàn)的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑, EGFR與其配體結(jié)合后形成磷酸化的EGFR, 繼而誘導(dǎo)其下游JAKs 磷酸化，并進(jìn)一步誘導(dǎo)STATs磷酸化。磷酸化的STAT進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與靶基因結(jié)合，從而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。既往對(duì)于JAKs-STATs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究多著眼于腫瘤方面。如Thompson等[14]研究證實(shí), JAKs-STATs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑AG490能有效抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。Leung等[15]報(bào)道, JAKs-STATs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與了星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖、分化過(guò)程。Bright等[16]研究發(fā)現(xiàn), JAKs-STATs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與了星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，加劇了神經(jīng)元損傷，阻礙神經(jīng)功能恢復(fù)。

本研究采用EGFR siRNA干擾EGFR表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGFR表達(dá)顯著降低。本研究隨后用CNTF處理體外培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn), CNTF能顯著上調(diào)細(xì)胞GFAP表達(dá)，而EGFR siRNA完全抑制了CNTF誘導(dǎo)的GFAP表達(dá)。說(shuō)明CNTF可明顯活化星形膠質(zhì)細(xì)胞，而干擾EGFR表達(dá)可抑制CNTF引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化。為了進(jìn)一步探討EGFR抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的相關(guān)機(jī)制，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了各組細(xì)胞p-JAK1和p-STAT3的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn), CNTF在上調(diào)GFAP表達(dá)的同時(shí)顯著上調(diào)了JAK1和STAT3的表達(dá)，而EGFR siRNA可顯著抑制CNTF介導(dǎo)的JAK1和STAT3表達(dá)。說(shuō)明干擾EGFR表達(dá)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化可能與阻滯JAK1和STAT3磷酸化有關(guān)。

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Effects of EGFR interference on activation of astrocytes after intra-cerebral hemorrhage and its mechanism

WU Zhengbin1, LUO Dalin2, JIANG Dongpo2

(1.ICU,ChongqingSoutheastHospital,Chongqing, 401336; 2.DepartmentofCriticalCareMedicine,TheThirdHospitalAffiliatedtoTheThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing, 400042)

Objective To investigate the effects of epidermal growth factor receptor (EGFR) interference on activation of astrocytes after intra-cerebral hemorrhage and its mechanism. Methods Rat model of intra-cerebral hemorrhage was induced by injection of Ⅶ collagenase. Sham operation group was set as control. After 7 d, the neurological function score was used to judge whether the model was successful or not. The expression of EGFR and GFAP in brain tissue of rats in intra-cerebral hemorrhage group and sham operation group were detected by SP immunohistochemical method. Astrocytes were isolated from newborn rats' cerebral cortex and cultured in vivo. Effects of EGFR interference on activation of astrocytes were observed. The experimental rats were divided into 4 groups: ① control group was not handled. ② CNTF group was added with 20 μg/L CNTF. ③ Negative group was added with 20 μg/L CNTF, and EGFR siRNA negative control was transfected. ④ EGFR group was added with 20 μg/L CNTF, and EGFR siRNA was transfected. The expressions of EGFR, GFAP, p-JAK1, p-STAT3 were detected by real-time PCR and Western blot. Results The modeling success rate was 89.5%(17/19). The expressions of EGFR and GFAP in brain tissue of rats with intra-cerebral hemorrhage were significantly higher than those in sham operation group (P<0.05). The relative expressions of EGFR mRNA and protein in EGFR group were significantly lower than those in control group, CNTF group and negative group (P<0.05). The relative expressions of GFAP mRNA and protein in the CNTF group and the negative group were significantly higher than those in the controlgroup and the EGFR group (P<0.05), but there was no significant difference between the control group and the EGFR group (P>0.05). The relative expressions of p-JAK1 and p-STAT3 protein in the CNTF group and the negative group were significantly higher than those in the control group and the EGFR group (P<0.05), but there was no significant difference between the control group and the EGFR group (P>0.05). Conclusion The expressions of EGFR and GFAP significantly increase in the rats with intra-cerebral hemorrhage. Interference of EGFR expression can inhibit the activation of astrocytes in rats, which may be related with the inhibition of JAK1 and STAT3 phosphorylation.

epidermal growth factor; glial fibrillary acidic protein; phosphorylated tyrosine kinase JAK1; phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3; astrocytes

2016-12-20

重慶市科學(xué)技術(shù)廳項(xiàng)目(0800160365)

羅大林

R 743.34

A

1672-2353(2017)13-012-05

10.7619/jcmp.201713004