吳親芳, 陳 宇, 王志綱, 蘇 雯, 許春娣

(1. 上海市瑞金醫(yī)院 兒科, 上海, 200000; 2. 上海市江灣醫(yī)院 兒科, 上海, 200000;3. 上海市控江醫(yī)院 兒科, 上海, 200000)

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兒童過敏性鼻炎和支氣管哮喘中周圍Th17和調(diào)節(jié)性T細胞的失衡

吳親芳1,3, 陳 宇2, 王志綱2, 蘇 雯1, 許春娣1

(1. 上海市瑞金醫(yī)院 兒科, 上海, 200000; 2. 上海市江灣醫(yī)院 兒科, 上海, 200000;3. 上海市控江醫(yī)院 兒科, 上海, 200000)

目的 探討周圍Th17細胞(Th17)和調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)在兒童過敏性鼻炎(AR)與支氣管哮喘(BA)中的失衡及臨床意義。方法 選取單純過敏性鼻炎(AR組)、單純支氣管哮喘(BA組)及過敏性鼻炎合并支氣管哮喘兒童(AR+BA組)為研究對象，每組25例。以同期入院體檢的25例健康兒童為對照組。比較4組外周血Th17細胞、Treg細胞水平，對比4組免疫球蛋白E(IgE)、轉化生長因子β1(TGF-β1)、第1秒用力呼氣容積占預計值百分比(FEV1%)及血清白介素IL-6、IL-17、IL-23、IL-10水平，并分析AR合并BA患兒IgE、FEV1%與Th17、Treg、TGF-β1、IL-17的相關性。結果 AR組、BA組、AR+BA組外周血Th17細胞、Treg細胞、IgE、TGF-β1、FEV1%與對照組比較均有顯著差異(P<0.05); AR組、BA組、AR+BA組IL-6、IL-17、IL-23均顯著高于對照組(P<0.05), 且AR+BA組IL-17顯著高于AR組、BA組(P<0.05); 相關分析顯示IgE與Th17、IL-17水平呈正相關，與Treg、TGF-β1水平呈負相關(P<0.05)。結論 兒童過敏性鼻炎和支氣管哮喘中Th17與Treg細胞存在失衡，且其表達與IgE、FEV1%均存在一定相關性。

兒童; 過敏性鼻炎; 支氣管哮喘; Th17; Treg; 失衡

過敏性疾病包括過敏性鼻炎(AR)和支氣管哮喘(BA)等慢性炎癥性疾病，是抗原異常免疫反應，其中BA是兒童較常見的慢性呼吸道疾病，該病可導致氣道慢性炎癥反應、氣道痙攣及氣道反應性增加，從而出現(xiàn)反復喘息、咳嗽、氣促及胸悶癥狀。研究[1-2]表明BA不僅發(fā)病率在增加，其中部分BA患者伴隨AR, AR可繼發(fā)BA而使BA病情難以控制和管理，嚴重影響患兒健康及生長發(fā)育。AR與BA的發(fā)病機制均屬于IgE介導的Ⅰ型變態(tài)反應，主要是局部免疫應答，共同特征為氣道高反應性。研究[3-4]顯示BA患兒外周血中T細胞亞群含量紊亂與氣道重塑及炎性細胞浸潤程度有關，其中Th17及IL-17過量表達可引起調(diào)節(jié)性T細胞功能缺陷或Treg細胞數(shù)量降低，促進過敏性疾病發(fā)展，而Th17及Treg細胞失衡在AR合并BA的意義在臨床研究較少。本文選取本院收治的單純AR、單純BA、AR合并BA兒童及健康體檢兒童各25例為研究對象，分析AR合并BA患兒外周血Th17、Treg的失衡及其臨床意義，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年7月—2017年2月本院收治的單純過敏性鼻炎(AR組)、單純支氣管哮喘(BA組)及過敏性鼻炎合并支氣管哮喘兒童(AR+BA組)為研究對象，每組25例。AR患兒符合《兒童變應性鼻炎診斷和治療的專家共識(2010年，重慶)》[5]中AR診斷標準: ① 出現(xiàn)清水樣鼻涕、鼻癢、鼻塞、噴嚏等癥狀2項及以上，每天癥狀持續(xù)或累計約1 h以上，伴眼癢、結膜充血等眼部癥狀，癥狀嚴重患兒可見手掌或手指向上揉鼻; ②皮膚點刺試驗及血清特異性IgE檢測試驗中任何一項為陽性。BA患兒符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)》[6]中BA診斷標準: ① 反復喘息、咳嗽、氣促、胸悶，發(fā)作時雙肺可聞及散在或彌漫性以呼氣相為主的哮鳴音，呼氣相延長; ② 癥狀不典型，但具備支氣管舒張試驗陽性、抗感染治療后肺通氣功能改善、支氣管激發(fā)試驗陽性、最大呼氣峰流量日間變異率≥13%中至少一項。AR合并BA診斷標準參照上述診斷標準。排除標準: ① 心、肝、腎等嚴重疾病患兒或非首發(fā)患兒; ② 入組前1周接受過糖皮質激素及支氣管舒張類藥物患兒; ③ 家屬及其監(jiān)護人不同意本研究或不配合醫(yī)師進行相關檢查者。另以同期入院體檢的健康兒童25例為對照組，排除合并嚴重心肝腎等重要臟器功能不全者。AR組中男13例，女12例; 年齡6～10歲，平均 (8.10±0.43)歲; BA組中男12例，女13例; 年齡5～11歲，平均(8.11±0.41)歲; AR+BA組中男12例，女13例; 年齡7～10歲，平均(8.09±0.44)歲; 對照組中男14例，女11例; 年齡6～11歲，平均(8.12±0.41)歲, 4組一般資料比較無顯著差異(P>0.05), 具有可比性。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會批準通過，且患兒家屬知情同意本研究并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標本采集：采用5 mL肝素鈉抗凝負壓真空采血管采集患兒晨空腹靜脈血4 mL, 在4h內(nèi)進行標本處理，取300 μL全血做流式細胞分析，剩余全血300 G/min離心10 min后，將上層血漿用于檢測血漿細胞因子水平，沉淀部分用于分離PBMC, 標本置于-80 ℃保存。

1.2.2 檢測方法: ① 流式細胞技術檢測外周血CD4+Th17+細胞、CD4+Foxp3+細胞：采用Ficoll密度梯度離心法分離PBMC, 以PBC洗2次后，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸，以臺盼藍染色并檢測活性，在24孔板中培養(yǎng)，細胞計數(shù)2×109/L，每孔培養(yǎng)基中加入至濃度PMA為50 μg/L，離子霉素為750 μg/L, 高爾基體阻斷劑莫能星2.0 μmol/L, 混勻后在37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h, 將細胞懸液轉移至1.5 mL EP管中，以 2 000 r/min離心8 min, 棄去上清液，用PBS洗2次，取流式細胞儀專用試管，分別標記抗體管、同型對照管，在各管中加入經(jīng)刺激的PBMC后分別加入10 ψ CD4-FITC，低速混勻后于室溫避光15～20 min，加固定/破膜稀釋液，低速渦旋混勻后4℃避光30 min，在抗體管中加入10 ψ免疫熒光Foxp3-PE單克隆抗體，在對照組管中加入IgG抗體，低速渦旋混勻后4 ℃避光30 min, 應用流式細胞儀(美國Beckman公司, Epics-XL)測定CD4+Th17細胞比例及CD4+Foxp3細胞比例，檢測結果用EXPRO32 ADC軟件進行分析。② 應用肺功能檢測儀測定FEV1%, 正常值為83%。③ 應用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定血漿IgE、TGF-β1、IL-6、IL-17、IL-23、IL-10水平，采用美國TSZ公司原裝進口試劑，上海MK3型酶標儀, 450 nm波長，測定OD值，設定空白對照，線性折線擬合格標準曲線。

1.3 觀察指標

① 比較4組外周血Th17細胞(以CD4+Th17細胞表示)、Treg細胞(以CD4+Foxp3表示)水平; ② 分析4組IgE、TGF-β1、FEV1%水平，F(xiàn)EV1%正常值≥83%; ③ 測定4組血IL-6、IL-17、IL-23、IL-10水平; ④ 分析AR合并BA患兒IgE、FEV1%與Th17、Treg、TGF-β1、IL-17的相關性,r>0.95為顯著性相關,r≥0.8為高度相關,r≥0.5～<0.8為中度相關,r≥0.3～<0.5為低度相關,r<0.3為不相關。

2 結 果

2.1 4組患兒外周血Th17、Treg細胞水平比較

AR組、BA組、AR+BA組外周血Th17細胞均顯著高于對照組(P<0.05), AR組、BA組、AR+BA組Treg細胞均顯著低于對照組(P<0.05), 且AR+BA組外周血Th17細胞較AR組、BA組高(P<0.05), AR+BA組Treg細胞低于AR組、BA組(P<0.05), AR組、BA組上述指標比較無顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1 4組患兒外周血Th17、Treg細胞水平比較 %

與對照組比較, *P<0.05; 與AR+BA組比較, #P<0.05。

2.2 4組患兒血IgE、TGF-β1及FEV1%水平比較

AR組、BA組、AR+BA組外周血IgE顯著高于對照組, AR組、BA組、AR+BA組 TGF-β1、FEV1%較對照組低，且AR+BA組IgE較AR組、BA組高, TGF-β1、FEV1%較AR組、BA組低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), AR組、BA組上述指標比較無顯著差異(P>0.05)。見表2。

表2 4組患兒血IgE、TGF-β1及FEV1%水平比較

與對照組比較, *P<0.05; 與AR+BA組比較, #P<0.05。

2.3 4組患兒血漿細胞因子水平比較

AR組、BA組、AR+BA組血漿IL-6、IL-17、IL-23均顯著高于對照組(P<0.05), IL-10無顯著差異(P>0.05), 且AR+BA組IL-17較AR組、BA組高(P<0.05), AR組、BA組上述指標比較無顯著差異(P>0.05)。見表3。

表3 4組患兒血漿細胞因子水平比較 pg/mL

與對照組比較, *P<0.05; 與AR+BA組比較, #P<0.05。

2.4 AR+BA患兒血IgE、FEV1%與Th17、Treg、TGF-β1、IL-17的相關性分析

相關分析顯示IgE與Th17、IL-17水平呈正相關(r=0.705、0.777,P<0.01), 與Treg、TGF-β1水平呈負相關(r=-0.629、-0.224,P<0.01), FEV1%則與Th17、IL-17水平呈負相關 (r=-0.801、-0.764,P<0.01), 與Treg、TGF-β1水平呈正相關(r=0.721、0.811,P<0.01)。見表4。

表4 AR+BA患兒血IgE、FEV1%與Th17、Treg、TGF-β1、IL-17的相關性分析

3 討 論

兒童支氣管哮喘(BA)以氣流受限、氣道重塑為主要特征，是由中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、T淋巴細胞等多種炎性細胞及黏附分子、細胞因子共同參與的氣道慢性炎癥性疾病，而過敏性鼻炎(AR)又稱為變應性鼻炎，兒童BA與AR除病變部位及臨床表現(xiàn)不同外，兩者病因學、發(fā)病機制及黏膜慢性炎癥病理改變極為相似，很多患兒同時或先后并存AR、BA兩種疾病, AR可加重BA癥狀，使哮喘治療更加困難，因此分析AR合并BA患兒的發(fā)病機制對疾病診斷及治療有重要意義[7-9]。AR、BA發(fā)病機制均屬于IgE介導的Ⅰ型變態(tài)反應，病理改變在于機體受到變應原刺激后多種免疫活性細胞參與疾病過程，當發(fā)生Ⅰ型變態(tài)反應時, IgE發(fā)揮其與肥大細胞、嗜酸性粒細胞結合的免疫功能，直接從免疫根源阻斷過敏生物鏈，直擊免疫T細胞，增強免疫T細胞調(diào)控能力，因此外周血中檢測到IgE水平升高時提示過敏性疾病可能[10-12]。在AR及BA發(fā)病時，患兒肺功能明顯受損，應用肺功能檢測儀檢測時可見其FEV1%下降，同時有研究顯示動態(tài)檢測TGF-β1水平對支氣管哮喘早期診斷及治療監(jiān)測有較廣闊應用前景, TGF-β1具有促進間質細胞增殖、促細胞轉化與分化、促進血管生成及促細胞外基質合成等多種生物學功能，在肺纖維化變性中，其激活被認為是病程進展的標志點[13-14]。實驗和臨床數(shù)據(jù)表明Th1和Th2細胞平衡反應是過敏性氣道炎癥發(fā)病機制，近年來人們認識到Th1/Th2失衡并不能完全解釋哮喘病因，而Th17和調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)作為Th1和Th2 細胞的兩個不同亞群最近在T細胞群研究中逐漸深入, Th17及其效應性細胞因子IL-17在自身免疫性疾病和慢性炎癥發(fā)展中有促炎作用, Th17細胞分泌的IL-6、IL-17、IL-23、IL-10等細胞因子在集體動員、募集、活化中性粒細胞等方面起重要作用，而Treg在抑制炎癥及維持機體免疫穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用，與哮喘呼吸道炎癥密切相關，目前多項研究[15-17]表明Th17/Treg細胞的失衡在支氣管哮喘發(fā)病中發(fā)揮重要作用，可影響支氣管哮喘患者氣道炎性反應，而AR合并BA發(fā)病中是否存在Th17/Treg細胞失衡在臨床報道尚少。

夏治等[18]分析了支氣管哮喘患兒外周血Th17和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞變化及其活動狀態(tài)相關性，結果顯示觀察組患兒外周血Th17、CD4+CD25+Treg細胞較健康對照組明顯提高，且隨病情程度加重，患兒外周血Th17呈上升趨勢，而CD4+CD25+Treg細胞隨病情加重而降低，本研究結果顯示AR組、BA組、AR+BA組外周血Th17細胞均高于對照組, AR組、BA組、AR+BA組Treg細胞均低于對照組，這與上述研究結果相似。本研究中AR+BA組外周血Th17細胞較AR組、BA組高, Treg細胞于AR組、BA組，證實AR合并BA患兒存在Th17、Treg細胞的失衡, Th17、Treg細胞可能參與疾病進展，可作為治療新靶點。在 TGF-β1及細胞因子水平方面，田戈等[19]分析了支氣管哮喘患者外周血TH1、TH2、TH17及Treg細胞相關細胞因子的表達及意義，結果顯示與健康對照組相比，哮喘患者血清中TGF-β1、IL-1、I6、IL-17A呈明顯增高趨勢，而IL-10比較無顯著差異，推測與Th1、Th2、Th17及Treg細胞的失衡有關。本研究結果顯示, AR組、BA組、AR+BA組TGF-β1低于對照組, IL-6、IL-17、IL-23均較對照組高，這與上述研究結果相似，且AR+BA組TGF-β1與AR組、BA組比較顯著低, IL-17與AR組、BA組比較明顯較高。本研究結果亦顯示, AR+BA組IgE高于AR組、BA組, FEV1%低于AR組、BA組，因此AR合并BA患兒外周血IgE、TGF-β1及FEV1%、IL-6、IL-17、IL-23水平與單純AR或BA存在顯著差異，推測可能與Th17、Treg細胞的失衡有關。在IgE、FEV1%與Th17、Treg細胞水平相關性方面。研究[20]顯示，過敏性氣道疾病患兒中，其總IgE水平與Th17、血漿IL-17水平呈正相關，與Treg細胞、TGF-β1水平呈負相關，而FEV1%與Th17細胞、血漿IL-17水平呈負相關，與Treg細胞、TGF-β1水平呈正相關，本研究結果顯示對于AR合并BA患兒，其IgE與Th17、IL-17水平呈正相關，與Treg、TGF-β1水平呈負相關; 而FEV1%則與Th17、IL-17水平呈負相關，與Treg、TGF-β1水平呈負相關，這與上述報道結果相似，證實在AR合并BA患兒中存在Th17細胞、Treg細胞的失衡，其水平與AR或BA有關的檢測指標IgE及FEV1%存在一定相關性。

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Imbalance between peripheral Th17 and regulatory T cells in children with allergic rhinitis and bronchial asthma

WU Qinfang1,3, CHEN Yu2, WANG Zhigang2, SU Wen1, XU Chundi1

(1.DepartmentofPediatrics,ShanghaiRuijinHospital,Shanghai, 200000; 2.DepartmentofPediatrics,ShanghaiJiangwanHospital,Shanghai, 200000; 3.DepartmentofPediatrics,ShanghaiKongjiangHospital,Shanghai, 200000)

Objective To investigate the imbalance of peripheral Th17 cells (Th17) and regulatory T cells (Treg) in children with allergic rhinitis (AR) and bronchial asthma (BA) and its clinical significance. Methods A total of 25 children with simple AR (AR group), 25 children with simple BA (BA group) and 25 children with AR complicated with BA (AR+BA group) were selected. Another 25 healthy children were selected as control group at the same time. The levels of Th17 cells and Treg cells in peripheral blood, immunoglobulin E (IgE), transforming growth factor β1(TGF-β1), percentage of forced expiratory volume in one second in predicted value (FEV1%) and levels of serum IL-6, IL-17, IL-23 and IL-10 were compared among four groups. The correlations between IgE, FEV1% and Th17, Treg, TGF-β1, IL-17 in children with AR complicated with BA were analyzed. Results There were significant differences in peripheral blood Th17 cells, Treg cells, IgE, TGF-β1and FEV1% between AR group, BA group, AR+BA group and the control group (P<0.05). IL-17 level was significantly higher in AR+BA group than AR group and BA group (P<0.05). Correlation analysis showed that IgE was positively correlated with levels of Th17 and IL-17, and negatively correlated with Treg and TGF-β1(P<0.05). Conclusion There is imbalance of Th17 and Treg cells in children with AR and BA. Their expression are correlated with IgE and FEV1%.

children; allergic rhinitis; bronchial asthma; Th17; Treg; imbalance

2017-03-20

上海市自然科學基金項目(12ZR1425700 )

許春娣

R 765.21

A

1672-2353(2017)13-088-04

10.7619/jcmp.201713023