蘇安梅， 余姝軼， 覃 秀， 沈彥伶， 鐘青梅， 王益林

(廣西大學化學化工學院 廣西生物煉制重點實驗室， 廣西 南寧 530004)

基于碳量子點熒光恢復的三聚氰胺測定方法

蘇安梅， 余姝軼， 覃 秀， 沈彥伶， 鐘青梅， 王益林*

(廣西大學化學化工學院 廣西生物煉制重點實驗室， 廣西 南寧 530004)

在碳量子點溶液中加入汞離子，量子點的熒光被猝滅，加入三聚氰胺后熒光恢復。據(jù)此，建立了基于碳量子點熒光恢復測定三聚氰胺的新方法并應用于實際樣品的分析。研究結(jié)果表明，在汞離子和碳量子點濃度之比為15∶10000且碳量子點濃度為4.0 g/L、pH值為7.5的實驗條件下，方法的線性范圍為3.0～60.0 mg/L，檢出限(3σ/k)為2.2 mg/L。方法應用于實際樣品測定時，其回收率為95%～103%。

碳量子點； 熒光恢復； 測定； 三聚氰胺

1 引 言

三聚氰胺是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機化合物。作為一種化工原料，最常見的用途是和甲醛作用生成耐高溫的樹脂材料[1]。但因含氮量高(66.6%)，白色無味，所以沒有簡單的檢測方法。在不法分子眼中，三聚氰胺是理想的食品和飼料中蛋白質(zhì)的冒充物。然而，三聚氰胺進入體內(nèi)后不能被代謝，而是從尿液中排出。動物實驗也表明，長期食用三聚氰胺會產(chǎn)生以三聚氰胺為主要成分的腎結(jié)石和膀胱結(jié)石，因此，三聚氰胺對身體有害，不可用于食品添加物。自2008年以來，人們開始關注食品和動物飼料中三聚氰胺含量的檢測，其主要方法有氣質(zhì)聯(lián)用法[2]、酶聯(lián)免疫法[3]、拉曼光譜法[4]、電化學法[5]、紅外光譜法[6]和熒光光譜法[7]等。

碳量子點是一種新型熒光納米材料[8]，基于碳量子點的熒光猝滅分析法已應用于無機金屬離子[9-14]和有機物[15-16]的定量測定。此外，碳量子點具有低的細胞毒性和良好的生物相容性，近年來，基于碳量子點熒光恢復的分析方法已應用于葡萄糖[17]、抗壞血酸[18]、多巴胺[19]、半胱氨酸[20]、堿性磷酸酶[21]和去鐵鐵蛋白[22]等的分析檢測。本文以檸檬酸為碳源合成碳量子點，在合成的碳量子點中加入Hg2+使其熒光猝滅，再在體系中加入三聚氰胺溶液，碳量子點的熒光恢復，且三聚氰胺的濃度越高，熒光恢復程度越強。據(jù)此我們建立了一種基于碳量子點熒光恢復的三聚氰胺測定新方法。

2 實 驗

2.1 主要試劑與儀器

三聚氰胺(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；氯化高汞(分析純，貴州省銅仁汞礦化學試劑廠)；檸檬酸(分析純，廣州化學試劑廠)；磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、三氯乙酸、乙腈(分析純，廣東光華科技股份有限公司)；氫氧化鈉(分析純，成都市科龍化工試劑廠)。

RF-5301熒光分光光度計(日本島津)；DHG-9146A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；KQ-50DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；78-1磁力加熱攪拌器(金壇市雙捷實驗儀器廠)； H1850離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)。

2.2 實驗方法

2.2.1 碳量子點的制備

碳量子點的制備參照文獻[23]方法進行：稱取4.0 g的檸檬酸于燒杯中，并放入已升溫至200 ℃的干燥箱中加熱20 min，取出后用1.0 mol/L NaOH溶液將其pH值調(diào)至7.0，然后轉(zhuǎn)移到200 mL容量瓶中并定容，得到20 g/L的碳量子點溶液(按檸檬酸計算)。

2.2.2 三聚氰胺的測定

在系列10 mL比色管中依次加入5.0 mL磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH=7.5)、2.0 mL碳量子點、48 μL Hg2+離子標準溶液(濃度為1.25 g/L)和不同體積的三聚氰胺標準溶液(濃度為3.0 g/L)，充分混勻后用去離子水定容至刻度，用RF-5301型熒光分光光度計測熒光強度(F)。同時做三聚氰胺試劑空白(F0)。測定時，激發(fā)波長選用370 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫都設置為5.0 nm。

3 結(jié)果與討論

3.1 測定原理

汞離子結(jié)合于碳量子點表面后，直接從光激發(fā)的碳量子點的導帶吸收電子，從而導致激發(fā)態(tài)電子不能有效回到價帶，即發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移而使碳量子點熒光猝滅[12]。若能使汞離子脫離碳量子點表面，則導帶中的激發(fā)態(tài)電子能有效返回到價帶，其熒光即可恢復(圖1)。

圖1 測定原理示意圖

由軟硬酸堿理論可知，三聚氰胺分子中的氨基能與汞離子形成較強的配位鍵，可將結(jié)合于碳量子點表面的汞離子“拉”下來。圖2數(shù)據(jù)表明，在370 nm光的激發(fā)下，碳量子點在460 nm處有強熒光；加入汞離子后，量子點熒光發(fā)生猝滅；繼續(xù)加入三聚氰胺，碳量子點的熒光又恢復。據(jù)此，可以建立一種碳量子點熒光恢復測定三聚氰胺的分析方法。

圖2 碳量子點-汞離子-三聚氰胺體系的熒光光譜

3.2 測定條件的選擇

圖3是Hg2+離子濃度對碳量子點的熒光光譜的影響。在pH值為8.0的緩沖溶液中，在1.0 g/L的碳量子點溶液中加入Hg2+后，量子點的熒光發(fā)生猝滅，并且熒光猝滅程度隨Hg2+離子濃度的增大而增強。當Hg2+濃度為2.5 mg/L時，碳量子點的熒光猝滅程度為86.8%。進一步研究表明，Hg2+濃度較高時，體系對三聚氰胺檢測的靈敏度較低，故本實驗選取猝滅程度為71.4%時的Hg2+濃度(1.5 mg/L)，即Hg2+濃度和碳量子點濃度之比為15∶10000為實驗條件。

圖3 碳量子點在不同濃度Hg2+溶液中(0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.2, 1.3, 1.5, 1.8, 2.5, 3.0 mg/L)的熒光光譜

Fig.3 Fluorescence emission spectra of the CQDs in aqueous solution upon addition of various concentrations of Hg2+(0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.2, 1.3, 1.5, 1.8, 2.5, 3.0 mg/L)

圖4是不同pH值條件下，碳量子點-Hg2+以及碳量子點-Hg2+-三聚氰胺體系的熒光強度，其中碳量子點濃度為1.0 g/L，Hg2+濃度為1.5 mg/L，三聚氰胺濃度為60.0 mg/L?？梢钥闯?，隨著pH值的升高，二者的熒光強度整體呈上升趨勢。當pH為7.5時，二者的熒光響應較強，且熒光恢復程度大。后續(xù)實驗選擇在pH=7.5的緩沖體系中進行。

圖4 不同pH值下碳量子點的熒光強度

圖5是碳量子點濃度對熒光恢復的影響。在選定的Hg2+濃度和碳量子點濃度之比條件下，在pH=7.5的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液中改變碳量子點的濃度，加入相同的濃度為16.0 mg/L的三聚氰胺。實驗表明，當碳量子點濃度增加時，碳量子點-Hg2+、碳量子點-Hg2+-三聚氰胺體系的熒光均有所增強，且在碳量子點濃度為4.0 g/L時熒光恢復程度最大。故后續(xù)實驗選取碳量子點濃度為4.0 g/L。

圖5 碳量子點的濃度對熒光響應的影響

Fig.5 Fluorescence intensity of CQDs with different concentrations

圖6是碳量子點-Hg2+以及碳量子點-Hg2+-三聚氰胺體系在不同時間的熒光強度，其中碳量子點的濃度為4.0 g/L，Hg2+濃度為6.0 mg/L，三聚氰胺濃度為16.0 mg/L，pH值為7.5。數(shù)據(jù)表明，在20～60 min內(nèi)，二者的熒光強度值保持穩(wěn)定。故后續(xù)實驗選擇在混勻20 min后進行熒光測定，并在60 min內(nèi)完成全部測定。

圖6 反應時間對熒光強度的影響

3.3 三聚氰胺的測定

3.3.1 標準曲線和檢出限

在選定的實驗條件下，改變?nèi)矍璋窐藴嗜芤旱臐舛?，對碳量子點-Hg2+-三聚氰胺體系進行熒光測定。結(jié)果表明，隨著三聚氰胺的加入，碳量子點的最大熒光發(fā)射波長不變，但熒光強度隨三聚氰胺濃度的增加而增大。進一步研究表明，碳量子點的熒光恢復程度((F-F0)/F0)與三聚氰胺濃度在3.0～60.0 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關系(圖7)，線性回歸方程為(F-F0)/F0=0.0287C+0.0456 (C為三聚氰胺的濃度，單位：mg/L)，相關系數(shù)為0.994，方法檢出限(3σ/k)為2.2 mg/L。

圖7 碳量子點的熒光強度隨三聚氰胺濃度(0, 3.0, 6.0, 12.0, 15.0, 21.0, 27.0, 30.0, 36.0, 42.0, 60.0 mg/L)的變化。插圖：(F-F0)/F0與三聚氰胺的濃度在3.0～60.0 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關系。

Fig.7 Dependence of FL intensity on the concentration of melamine(0, 3.0, 6.0, 12.0, 15.0, 21.0, 27.0, 30.0, 36.0, 42.0, 60.0 mg/L). Inset shows the linear relationship between (F-F0)/F0and melamine concentration within the range of 3.0-60.0 mg/L.

3.3.2 共存物的影響

實驗進行了在實際樣品測定中可能出現(xiàn)的干擾物對三聚氰胺測定結(jié)果的影響。當三聚氰胺的濃度為60.0 mg/L時，考察了10倍濃度的共存物對被測物分析結(jié)果的影響，這些共存物分別為：K+、Mg2+、Na+、Ca2+、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asn)、色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)、蘇氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、精氨酸(Arg)、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、葡萄糖(Glu)和乳糖(Lac)。圖8數(shù)據(jù)表明，在加入共存物后，碳量子點-Hg2+-三聚氰胺體系的熒光強度值沒有發(fā)生明顯的變化，測定結(jié)果相對誤差均在±5%的范圍內(nèi)，表明該方法的選擇性好。

圖8 以三聚氰胺體系熒光值作為對照，加入各干擾體系后熒光響應的相應柱狀圖。

Fig.8 Corresponding bar chart of the fluorescence responses of adding interference system obtained with the use of a sensor for melamine (control)

3.3.3 分析應用

稱取2.50 g純牛奶4份，分別加入不同量的三聚氰胺(0, 5.0, 20.0, 50.0 mg)、15 mL三氯乙酸(10.0 g/L)及5 mL乙腈。然后，對樣品依次進行如下處理：15 min的超聲、10 min的振蕩、10 min的離心(轉(zhuǎn)速：9 500 r/min)。將上清液透過0.45 μm的濾膜后，用NaOH溶液調(diào)其pH值至7.0，轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶中并定容。取2.00 mL定容后的溶液按實驗方法進行測定。同時作工作曲線，根據(jù)工作曲線求得各試液中三聚氰胺的濃度，并進一步計算回收率，具體數(shù)據(jù)見表1。結(jié)果表明，所測樣品中沒有檢測到三聚氰胺，加標回收率在95%～103%范圍內(nèi)，說明該方法的準確度較高，可應用于實際樣品的測定。

表1 純牛奶中三聚氰胺的測定結(jié)果

4 結(jié) 論

以檸檬酸為碳源合成水溶性碳量子點。Hg2+離子結(jié)合于碳量子點表面后能猝滅其熒光，而三聚氰胺中氨基與Hg2+離子形成更穩(wěn)定的配位鍵，將Hg2+離子帶離碳量子點表面從而使熒光恢復。據(jù)此，建立了一種基于碳量子點熒光恢復測定三聚氰胺的分析方法，并應用于實際樣品中的測定，方法的各項分析性能滿足微量分析的要求。

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蘇安梅(1992-)，女，廣西百色人，碩士研究生，2015年于廣西大學獲得學士學位，主要從事量子點熒光材料的合成與應用的研究。

E-mail: 962240842@qq.com

王益林(1968-)，男，湖南邵陽人，博士，副教授，2010年于廣西大學獲得博士學位，主要從事量子點熒光材料的合成與應用的研究。

E-mail: theanalyst@163.com

Determination of Melamine Based on Fluorescence Recovery of Carbon Quantum Dots

SU An-mei, YU Shu-yi, QIN Xiu, SHEN Yan-ling, ZHONG Qing-mei, WANG Yi-lin*

(Guangxi Key Laboratory of Biorefinery, School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University, Nanning 530004, China)

*Corresponding Author, E-mail: theanalyst@163.com

We report a method for determination of melamine based on fluorescence recovery of carbon quantum dots (CQDs). It was found that the fluorescence intensity of CQDs can be efficiently quenched by Hg2+. And a turn-on fluorescence signal can be observed if melamine was added. The results showed when the concentration ratio of mercury ions to carbon quantum dots was 15∶10000, the concentration of carbon quantum dots was 4.0 g/L and the pH value was 7.5, the response was linearly proportional to the concentration of melamine within the range of 3.0-60 mg/L, the limit of detection (3σ/k) was 2.2 mg/L. The method was successfully applied to the determination of melamine in real sample with satisfactory recoveries (95%-103%)

carbon quantum dots; fluorescence recovery; determination; melamine

1000-7032(2017)07-0967-06

2016-12-13；

2017-02-10

廣西自然科學基金(2014GXNSFAA118328)； 廣西生物煉制重點實驗室開放基金(GXKLB-2)； 廣西大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃(201610593162)資助項目 Supported by Natural Science Foundation of Guangxi(2014GXNSFAA118328); Opening Project of Guangxi Key Laboratory of Biorefinery(GXKLB-2); Foundation of College Student Experimental Skills and Innovation Ability Training of Guangxi University(201610593162)

O611.4

A

10.3788/fgxb20173807.0967