謝佳倩，周穎，張俊梅，徐海旺，李鵬，趙迪，王蕾，易丹，侯永清

（動物營養(yǎng)與飼料安全湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢輕工大學(xué)動物科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，湖北武漢430023）

L-亮氨酸對豬流行性腹瀉病毒感染仔豬血液生化指標(biāo)和空腸免疫相關(guān)基因mRNA水平的影響

謝佳倩，周穎，張俊梅，徐海旺，李鵬，趙迪*，王蕾，易丹，侯永清

（動物營養(yǎng)與飼料安全湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢輕工大學(xué)動物科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，湖北武漢430023）

本試驗(yàn)旨在研究L-亮氨酸（Leu）對豬流行性腹瀉病毒（PEDV）感染幼齡仔豬血液指標(biāo)和空腸免疫相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響，探索Leu對PEDV感染仔豬應(yīng)激的緩解作用。選用30頭體重相近的7日齡PEDV陰性仔豬，隨機(jī)分為3個處理組：對照組、PEDV組和PEDV+Leu組，每個處理10個重復(fù)，每個重復(fù)一頭豬。試驗(yàn)期10 d（7日齡～16日齡）。從第0天開始對PEDV+Leu組按2.8 g/kg體重飼喂Leu，而對照組和PEDV組均按4.1 g/kg體重飼喂L-丙氨酸。第7天早上對PEDV組和PEDV+Leu組采用口服的方式接種106.5TCID50的PEDV，同時對照組采用口服的方式接種等劑量的生理鹽水，3 d后（16日齡）取血液和腸道樣品。結(jié)果表明：與對照組相比，PEDV組仔豬血液中總膽紅素（TBIL）水平、血小板分布寬度（PDW）及空腸黏膜CXCL11、REG3G mRNA表達(dá)量分別降低了20.92%、9.76%、56.00%、36.00%（P＜0.05），血液中白細(xì)胞（WBC）和淋巴細(xì)胞（LYM）數(shù)量、磷酸絲氨酸、酪氨酸和色氨酸濃度，及空腸粘膜GSTO2和HSPH1 mRNA水平分別提高了61.68%、27.66%、30.39%、50.54%、64.00%、75.00%、89.00%（P＜0.05）；與PEDV組相比，PEDV+Leu組仔豬血液中組氨酸、天冬酰胺、尿素氮（BUN）濃度分別升高了55.43%、32.58%、83.33%（P＜0.05），而二胺氧化酶（DAO）含量、單核細(xì)胞（MONO）、單核細(xì)胞比（Monocyte Ratio，MONOR）、磷酸絲氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、精氨酸、蘇氨酸及空腸黏膜MX1和GSTO2 mRNA水平分別降低了28.80%、47.13%、43.87%、10.53%、42.12%、29.48%、29.82%、33.50%、32.11%、28.00%（P＜0.05）。因此，日糧中添加Leu提高了PEDV感染仔豬的免疫功能，緩解了PEDV感染仔豬的應(yīng)激。

亮氨酸；仔豬；豬流行性腹瀉病毒；血液生化指標(biāo)；免疫

豬流行性腹瀉（PED）是由豬流行性腹瀉病毒引起的一種高度接觸性腸道傳染病，是養(yǎng)豬生產(chǎn)中危害很大的疾病之一。PEDV的感染可引起豬腸絨毛損傷、吸收功能紊亂，出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉、嘔吐、脫水甚至死亡。由于腸道受損嚴(yán)重，感染PEDV的豬生長性能顯著降低，極大地影響了養(yǎng)豬生產(chǎn)效率（楊德全等，2013）。亮氨酸（Leu）是支鏈氨基酸（BCAA）之一，BCAA包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸，哺乳動物自身不能合成，必須由日糧提供。BCAA是目前日糧必需氨基酸中數(shù)量最大的氨基酸，包括約35%肌肉蛋白的必需氨基酸和約40%哺乳動物的必需氨基酸。Leu的從頭合成限于植物和微生物中，在哺乳動物體內(nèi)不能從頭合成。Leu可以起到氧化供能、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和提高免疫的作用（王彬等，2012）。研究表明，Leu對單純皰疹病毒1型（HSV-1）導(dǎo)致的黏膜感染有保護(hù)作用，但對PEDV感染仔豬的作用效果鮮見報道。本試驗(yàn)以PEDV感染仔豬為對象，研究日糧中添加Leu是否對PEDV感染仔豬有保護(hù)作用，為其在防治豬流行性腹瀉中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料與基礎(chǔ)日糧L-Leu購置于Sigma公司（純度為98.5%～101%）。PEDV為云南野毒株第14代（YN F14）。試驗(yàn)日糧為人工奶粉，其營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗(yàn)日糧（人工乳）營養(yǎng)水平

1.2試驗(yàn)動物及設(shè)計(jì)選用30頭平均體重為（3.00±0.40）kg的7日齡PEDV陰性仔豬（杜洛克×長白×大白），隨機(jī)分為3個處理組，每個處理組10個重復(fù)，每個重復(fù)一頭豬。整個試驗(yàn)過程采用自由采食的方式飼喂人工奶粉（40～45℃溫開水沖泡，人工奶粉和水按照1∶4的比例混勻）。PEDV+ Leu組按每頭豬每千克體重一天飼喂2.8 g Leu，而對照組和PEDV組均飼喂4.1 g的L-丙氨酸（等氮對照）。試驗(yàn)期10 d。

1.3飼喂管理試驗(yàn)將豬舍、豬欄徹底打掃，熏蒸消毒。豬舍為全封閉式，屋頂以排氣扇通風(fēng)，塑料漏縫地板，舍溫保持在22～25℃。動物每日飼喂5次（8∶30、11∶30、15∶00、18∶00、21∶00），每次每個處理飼喂量為2500 mL，平均每頭豬每日飼喂量為250 g（根據(jù)NRC標(biāo)準(zhǔn)，每頭豬每天250 g營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)），每次喂食之前將料槽剩料倒掉，并消毒沖洗料盤。從第0天開始，將L-丙氨酸和Leu溶解在奶水中，飼喂仔豬；第7天早上對PEDV組和PEDV+Leu組采用口服的方式接種106.5TCID50的PEDV，對對照組采用口服的方式接種等劑量的生理鹽水。攻毒后連續(xù)觀察3 d，觀察是否出現(xiàn)水樣腹瀉、嘔吐癥狀。3 d后（16日齡），早上7點(diǎn)各組仔豬均灌服D-木糖（劑量為0.1 g/kg BW），1 h后前腔靜脈采血，并用50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉仔豬，屠宰取腸道樣本。

1.4樣品采集與處理于試驗(yàn)第10天前腔靜脈采血5 mL，室溫下傾斜放置30 min后，3000 r/min離心10 min，分離血漿。收集空腸黏膜，置于-80℃冰箱凍存待測。

1.5測定指標(biāo)及方法

1.5.1血漿生化指標(biāo)的測定采用日立7020全自動生化分析儀測定血漿生化指標(biāo)。

1.5.2血液常規(guī)指標(biāo)的測定使用全自動五分類STKS血球分析儀進(jìn)行檢測。

1.5.3血漿DAO活性采用紫外比色法，用南京建成生物工程研究所試劑盒測定（王蕾等，2010）。1.5.4血液游離氨基酸的檢測采用德國SYKAM S-433D型氨基酸分析儀檢測血漿中游離氨基酸。

1.5.5空腸功能相關(guān)基因表達(dá)量的測定檢測基因：Myxovirus Resistance 1（MX1）、熱休克蛋白（HSPH1）、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GSTO2）、絨毛蛋白（Villin）、胰島再生蛋白3 g（REG3G）。采用實(shí)時熒光定量PCR（RT-PCR）方法檢測，總RNA的提取和cDNA的合成均采用試劑盒法，主要試劑為RNAiso Plus（Total RNA提取試劑）、Prime-ScriPt ?RT reagent Kit with cDNA Eraser（cDNA合成試劑盒）、SYBR?Premix Ex TaqTM（real-time PCR試劑盒），試劑盒均購于寶生生物工程（大連）有限公司。RT-PCR擴(kuò)增的基因及內(nèi)參RPL4的引物序列見表2。各基因PCR數(shù)據(jù)的結(jié)果分析參照Fu等（2010）的方法。

表2 檢測基因?qū)?yīng)的上下游引物序列

1.6統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差（One-Way ANOVA）分析和Duncan’s多重比較檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2結(jié)果與分析

2.1Leu對PEDV攻毒仔豬血液生化指標(biāo)的影響由表3可知，與對照組相比，PEDV組仔豬血液中總膽紅素（TBIL）水平顯著降低了20.92%（P＜0.05）；與PEDV組相比，PEDV+Leu組仔豬的尿素氮（BUN）水平顯著提高了83.33%（P＜0.05）。2.2Leu對PEDV攻毒仔豬血液常規(guī)指標(biāo)的影響由表4可知，與對照組相比，PEDV組仔豬的白細(xì)胞（WBC）、淋巴細(xì)胞（LYM）數(shù)量分別提高了61.68%、27.66%（P＜0.05），但血小板分布寬度（PDW）顯著下降了9.76%（P＜0.05）；與PEDV組相比，PEDV+Leu組仔豬的單核細(xì)胞（MONO）和單核細(xì)胞比（MONOR）分別降低了47.13%、 43.87%（P＜0.05）。

2.3Leu對PEDV攻毒仔豬血漿DAO含量的影響由表5可知，與PEDV組相比，PEDV+Leu組仔豬的DAO含量顯著降低了28.80%（P＜0.05）。2.4Leu對PEDV攻毒仔豬血液游離氨基酸的影響由表6可知，與對照組相比，PEDV組仔豬血液的磷酸絲氨酸、酪氨酸、色氨酸濃度分別提高了30.39%、50.54%、64.00%（P＜0.05）；與PEDV組相比，PEDV+Leu組仔豬血液的磷酸絲氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、精氨酸、蘇氨酸濃度分別降低了10.53%、42.12%、29.48%、29.82%、33.50%（P＜0.05），尿素、組氨酸、天冬酰胺濃度顯著提高了83.33%、55.43%、32.58%（P＜0.05）。

表5 Leu對PEDV攻毒仔豬血漿DAO含量的影響

2.5Leu對PEDV攻毒仔豬空腸功能相關(guān)基因的影響由表7可知，與對照組相比，PEDV組仔豬空腸黏膜GSTO2、HSPH1 mRNA水平分別提高了75.00%、89.00%（P＜0.05），但CXCL11、REG3G mRNA水平顯著降低了56.00%、36.00%（P＜0.05）。與PEDV組相比，PEDV+Leu組仔豬空腸MX1、GSTO2 mRNA水平顯著降低了32.11%、28.00%（P＜0.05）。

3討論

3.1Leu對攻毒仔豬血液生化指標(biāo)的影響血液生化指標(biāo)的改變組織細(xì)胞通透性和機(jī)體新陳代謝機(jī)能。血漿尿素氮是動物體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝和日糧氨基酸平衡情況較為準(zhǔn)確的反映指標(biāo)，正常情況下，血漿尿素氮恒定在一定的范圍內(nèi)，并隨蛋白質(zhì)代謝程度的變化而變化，代謝平衡良好時尿素氮濃度下降（吳苗苗等，2013）。血清膽紅素是體內(nèi)衰老紅細(xì)胞裂解釋放出的血紅蛋白而產(chǎn)生的，主要由血紅蛋白在肝細(xì)胞內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化，為天然內(nèi)源性強(qiáng)抗氧化劑，具有抗脂質(zhì)過氧化、清除自由基等作用，可減少氧化低密度脂蛋白形成，防止動脈粥樣硬化（李慧華等，2016）。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組相比，PEDV組血液中TBIL水平顯著降低，說明仔豬受PEDV感染后腸道氧化應(yīng)激增加。與PEDV組相比，PEDV+Leu組血液中BUN水平顯著提高，表明Leu可能影響了機(jī)體的蛋白質(zhì)代謝，血液中的非蛋白氮升高。

表3 Leu對PEDV攻毒仔豬血液生化指標(biāo)的影響

表4 Leu對PEDV攻毒仔豬血液常規(guī)指標(biāo)的影響

表6 Leu對PEDV攻毒仔豬血漿中游離氨基酸的影響nmol/mL

表7 Leu對PEDV攻毒仔豬空腸免疫相關(guān)基因的影響

3.2Leu對攻毒仔豬血液常規(guī)指標(biāo)的影響白細(xì)胞通常被稱為免疫細(xì)胞，是機(jī)體防御系統(tǒng)的一個重要組成部分。它可通過吞噬和產(chǎn)生抗體等方式來抵御和消滅入侵的病原微生物。血小板是哺乳動物血液中的有形成分之一，在正常血液中有較恒定的數(shù)量。血小板的功能主要是促進(jìn)止血和加速凝血，同時血小板還有維護(hù)毛細(xì)血管壁完整性的功能。有效的血小板質(zhì)量和數(shù)量在機(jī)體正常止血過程中發(fā)揮著重要作用（張宇，2012）。研究表明，血液WBC、PDW值增高多見于細(xì)菌性炎癥反應(yīng)、嚴(yán)重嘔吐、腹瀉、大面積燒傷及各種原因?qū)е碌慕M織脫水等（何世山等，2003）。血液中的單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，是身體重要的免疫細(xì)胞，具有抗感染、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等重要作用。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PEDV顯著提高仔豬血液中WBC、LYM。仔豬經(jīng)口服PEDV后，發(fā)生了病毒性腹瀉，引起仔豬血液WBC和LYM數(shù)量升高，造成仔豬炎性損傷。PEDV降低了仔豬血小板分布寬度，減弱了仔豬的止血和凝血功能，使得腸道黏膜損傷修復(fù)功能降低。單核細(xì)胞是機(jī)體防御系統(tǒng)的重要組成部分，能吞噬異物產(chǎn)生抗體，在機(jī)體損傷治愈、抵抗病原入侵和對疾病免疫方面發(fā)揮著重要作用。當(dāng)機(jī)體受到外界異物刺激或發(fā)生炎癥反應(yīng)時，可引起血液中MONO和MONOR增加。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，人工乳中添加Leu有效降低了攻毒仔豬血液中MONO和MONOR，表明添加Leu可有效緩解PEDE感染仔豬的免疫應(yīng)激，提高仔豬的免疫防御功能。

3.3Leu對攻毒仔豬血漿DAO含量的影響DAO是哺乳動物小腸黏膜上層絨毛中細(xì)胞內(nèi)酶，其活性與小腸絨毛細(xì)胞的核酸和蛋白合成密切相關(guān)，當(dāng)小腸腸黏膜發(fā)生損傷時，腸道黏膜通透性增加，DAO從小腸黏膜釋放，引起血液DAO活性升高（胡泉舟等，2008）。因此，血液DAO的活性可間接反映腸黏膜的完整性及損傷程度，是監(jiān)測腸道屏障功能的重要指標(biāo)，腹瀉嚴(yán)重程度與血液DAO活性呈顯著相關(guān)（黎佳穎等，2015）。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，仔豬口服PEDV后血液中DAO含量有上升趨勢，但差異不顯著，而Leu可降低灌服PEDV的仔豬血漿DAO活性，提示Leu可能有利于緩解PEDV感染仔豬的腸道黏膜損傷。

3.4Leu對血液游離氨基酸的影響血漿游離氨基酸濃度在一定程度上可以反映動物體內(nèi)氨基酸代謝狀況。在日糧氨基酸可滿足動物需要的前提下，氨基酸進(jìn)一步平衡可降低血漿游離氨基酸濃度，這是因?yàn)榘被嵩隗w內(nèi)不同組織器官的分流比例更趨合理而利用率得到提高；當(dāng)日糧氨基酸不能滿足動物需要時，血漿游離氨基酸濃度偏低（Malndof，1988）。王彬等(2012）研究報道，添加0.55%亮氨酸可以顯著提高斷奶仔豬心臟、小腸后段、腎臟、肝臟、胰臟、脾臟和胃的蛋白質(zhì)合成速率。本試驗(yàn)中，與對照組相比，PEDV組仔豬血液中的磷酸絲氨酸、酪氨酸、色氨酸濃度顯著提高，而Leu顯著降低了磷酸絲氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、精氨酸、蘇氨酸濃度，提高了尿素、組氨酸、天冬酰胺濃度。其中，蘇氨酸、異亮氨酸為必需氨基酸，這說明添加Leu促進(jìn)了動物體內(nèi)氨基酸之間的平衡，提高了氨基酸利用率。Eggum（1970）研究報道，血液BUN含量直接關(guān)系到蛋白質(zhì)飼料的質(zhì)量和在體內(nèi)的氨基酸利用率。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，PEDV+ Leu組血液中尿素含量顯著提高，這與血漿生化指標(biāo)結(jié)果相符，說明Leu可能影響了機(jī)體腎臟功能或蛋白質(zhì)代謝，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3.5Leu對攻毒仔豬空腸功能相關(guān)基因的影響Mx基因是一類抗病毒基因，主要有Mx1、Mx2兩類，能通過其蛋白質(zhì)或mRNA表達(dá)來反映干擾素的生物活性，其中Mx1位于細(xì)胞核內(nèi)，能有針對性抑制A型流感病毒和托高士流感病毒（何丹妮等，2012）。熱休克蛋白（HSP）是一類非常保守的蛋白質(zhì)分子家族，HSPH1是其中的一員，它能在高熱、氧化應(yīng)激等應(yīng)激狀態(tài)下，提高細(xì)胞對損害的耐受程度（Hong等，2014）。谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GSTs）在神經(jīng)組織中的表達(dá)增加可對抗氧化應(yīng)激，GSTO2是GSTs的一個亞型（梁冰等，2006）。胰島再生蛋白3 g（REG3G），為胰腺炎相關(guān)蛋白，是一種C凝聚素蛋白，急性胰腺炎時由腺泡細(xì)胞分泌，可以調(diào)控免疫應(yīng)激、細(xì)胞識別和黏附、抑制細(xì)胞凋亡等多個生物過程（VAN，2013）。本試驗(yàn)中，PEDV感染降低了仔豬空腸REG3G mRNA表達(dá)量，但提高了腸道HSPH1，表明PEDV誘導(dǎo)了仔豬腸道應(yīng)激。而Leu降低了仔豬空腸MX1、GSTO2基因表達(dá)量，表明Leu可能通過調(diào)控抗病毒基因和抗氧化基因的表達(dá)來影響仔豬的抗病毒能力。

4結(jié)論

日糧中添加Leu提高了仔豬的免疫功能，對PEDV感染仔豬的應(yīng)激具有一定緩解作用。

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This experiment was conducted to study the effects of leucine（Leu）on blood biochemical parameters and immune-related genes in the jejunum mucosa of piglets infected by PEDV，thereby to determine whether Leu can relieve the stress on piglets caused by PEDV.A total of 30 7-day piglets of similar weight without PEDV were selected and randomly divided into three treatment groups：control group，PEDV group，PEDV+Leu group.Each group had 10 replicates with 1 piglet each.The experiment lasted for 10 days.Piglets in PEDV+Leu group were fed with Leu at the dosage of 2.8 g per kilogram of body weight per day，whereas those in control and PEDV groups were fed with L-alanine at the dosage of 4.1 g per kilogram of body weight per day.On the morning of the 7th day，piglets in PEDV and PEDV+Leu group were vaccinated orally with 106.5TCID50 PEDV，while those in the control group treated with same dose of saline solution.The results showed that：compared with control group，the number of white blood cells（WBC）and lymphocytes（LYM），the concentration of phosphoserine，tyrosine，tryptophan in blood，and the expressions of GSTO2 and HSPH1 gene in jejunum mucosa were significantly improved by 61.68%，27.66%，30.39%，50.54%，64.00%，75.00%，89.00%respectively（P＜0.05），but the TBIL，PDW in the blood，and the expressions of GSTO2 and HSPH1 gene in jejunum mucosa in PEDV group were decreased by 20.92%，9.76%，56.00%，36.00%（P＜0.05）.Compared with PEDV group，the expressions of GSTO2 and MX1 gene in jejunum，mononuclear cell（MONO），MONOR，phosphoserine，glutamic acid，isoleucine，arginine，threonine，and DAO in blood were significantly decreased by 28.00%，32.11%，47.13%，43.87%，10.53%，42.12%，29.48%，29.82%，33.50%，28.80%（P＜0.05），while histidine，urea，and asparagine were significantly increased by 55.43%，83.33%，32.58%（P＜0.05）.In conclusion，Leu may improve the immune function of piglets and partially mitigate the stress induced by PEDV infection.

leucine；piglets；porcine epidemic diarrhea vinus；blood biochemical parameters；immune

S816.7

A

1004-3314（2017）12-0027-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171208

國家自然科學(xué)基金（31572416）；武漢輕工大學(xué)科研項(xiàng)目（2016J08）

*通訊作者