單乃榮孫 甜羅昭軍陳 幸韋 緯班燕桃吳 濤葉云鋒唐 建李錦泉賀敏華

（1.廣西獸藥監(jiān)察所，廣西南寧 530001；2.廣西養(yǎng)蜂指導(dǎo)站，廣西南寧 530022）

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)蜂蜜中土霉素殘留的檢測(cè)

單乃榮1孫 甜2羅昭軍1陳 幸1韋 緯1班燕桃1吳 濤1葉云鋒1唐 建1李錦泉1賀敏華1

（1.廣西獸藥監(jiān)察所，廣西南寧 530001；2.廣西養(yǎng)蜂指導(dǎo)站，廣西南寧 530022）

建立了蜂蚩中土霉素藥物殘留檢測(cè)的超高效液相色譜_串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。以McIlvajne_Na2EDTA緩沖液為提取液，經(jīng)HLB固相萃取小柱凈化，脫溶劑后用甲醇水溶解，在超高效液相色譜_串聯(lián)質(zhì)譜上進(jìn)行檢測(cè)。土霉素在0～200ng·ml_1濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2＞0.999。添加藥物水平40～200μg·kg_1的回收率在65.1～98.7%。土霉素的檢測(cè)限為5μg·kg_1，定量限為10 μg·kg_1。方法快速簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好，可用于監(jiān)測(cè)蜂蚩中土霉素的含量。

；蜂蚩；土霉素；超高效液相色譜_串聯(lián)質(zhì)譜法

土霉素是最常用四環(huán)素類廣譜抗生素藥物之一，具有防治見(jiàn)效快，價(jià)格低廉，容易購(gòu)買的特點(diǎn)，作為獸藥和飼料添加劑在食品動(dòng)物中廣泛應(yīng)用。土霉素被非法用于養(yǎng)殖過(guò)程中蜂群病蟲害的治療和預(yù)防，劑量過(guò)大或療程過(guò)長(zhǎng)，造成土霉素藥物殘留除了其毒副作用對(duì)人直接危害外，更為嚴(yán)重的是動(dòng)物性食品中殘留容易誘導(dǎo)人類致病菌產(chǎn)生耐藥性，從而不利于該類藥物在人類疾病的治療[1～3]，因此必須十分重視土霉素在動(dòng)物性食品中的殘留問(wèn)題。在歷年國(guó)家蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全通報(bào)中均有檢出，使得土霉素在蜂產(chǎn)品中的藥物殘留越來(lái)越受到關(guān)注。目前已發(fā)布的 GB/T18932.23-2003《蜂蜜中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素殘留量的測(cè)定方法液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法》[4]中凈化需要兩種小柱，處理過(guò)程較多，易造成損失，回收率不理想；農(nóng)業(yè)部1025號(hào)-12-2008《雞肉、豬肉中四環(huán)素類藥物殘留檢測(cè) 液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法》[5]，由于受蜂蜜樣品基質(zhì)影響分析結(jié)果較大，也不適用。我們通過(guò)飼喂試驗(yàn)，考察土霉素在蜂蜜中的代謝過(guò)程，并對(duì)樣品前處理和儀器條件進(jìn)行研究，改進(jìn)后的方法快速簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好，為有效監(jiān)控蜂蜜樣品中土霉素藥物殘留提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀器 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters，TSQ QUANTUMACCESS，配有電噴霧電離源）；N-EVAP 112氮吹儀，美國(guó)Organomatian assocaiate公司；3K15高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Sigma公司；HY-54回旋振蕩器，國(guó)華電器有限公司；精密pH計(jì)，梅特勒公司；Mettler AE 240分析天平（感量0.0001 g）；Mettler PL602-S電子天平（感量0.01 g）；美國(guó)Waters固相萃取裝置。

1.1.2 試劑 土霉素對(duì)照品來(lái)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)為K0031208，含量89.5%；有效期未標(biāo)示；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）；氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉、甲酸；水為實(shí)驗(yàn)室一級(jí)水；HLB固相萃取柱，60 mg，3cc，美國(guó)Waters公司。

1.1.3 制備試劑 氫氧化鈉溶液（1.0 mol·L-1）：稱取氫氧化鈉1 g，加水溶解并稀釋至100 mL；McIlvaine-Na2EDTA緩沖液：分別取檸檬酸12.9 g，磷酸氫二鈉10.9 g，乙二胺四乙酸二鈉37.2 g，加水900 ml溶解，用1.0 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)pH至4.0±0.5，加水稀釋至1000 ml；0.1%甲酸水溶液，取1 ml甲酸用水稀釋至1000 ml。

1.2 陽(yáng)性樣品制備

通過(guò)人為在花粉和蜂蜜中添加藥物飼喂至蜂群，選用“藥物+蜂蜜”、“藥物+花粉”兩種方式進(jìn)行平行試驗(yàn)；用藥量為常規(guī)用量的2倍（參照成人用藥量飼喂10脾蜂為常規(guī)用量），喂藥7、21、45日后取蜜檢測(cè)。

1.3 對(duì)照品溶液制備

土霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：取土霉素對(duì)照品適量，精密稱定，按土霉素計(jì)，用甲醇溶解并稀釋成濃度為1mg·ml-1的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。置-20℃冰箱中保存，有效期為1個(gè)月。

土霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：準(zhǔn)確量取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用初始流動(dòng)相稀釋成適宜濃度的土霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液。臨用前配制。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱為WATERS ACQUITY UPLC BEH C18柱 100 mm×2.1 mm，粒度1.7 μm；色譜柱溫30 ℃；流速0.25 ml·min-1；進(jìn)樣量2μl；流動(dòng)相為A：0.1%的甲酸水溶液，B：乙腈，采用梯度洗脫：0 min～6 min，90%A線性變化至62%，6～7 min，62%A線性變化至90%A，7 min～9 min，90%A。

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子化，正離子檢測(cè)，噴霧電壓4000 V，離子傳輸管溫度400 ℃，鞘氣流速15 L·min-1，碰撞氣為氬氣，定性離子對(duì)、定量離子對(duì)及碰撞能量的參考值見(jiàn)表1。

表1 土霉素的質(zhì)譜條件

1.4.3 定性與定量 該方法定性滿足四個(gè)條件：①試劑空白和樣品空白不能出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照相同的離子峰；②特征離子色譜峰的信噪比（S/N）都在3：1以上；③試樣溶液色譜峰保留時(shí)間，應(yīng)與校正溶液的一致，允許偏差為±2.5%；④試樣溶液離子豐度比應(yīng)與校正溶液一致，定量時(shí)以響應(yīng)強(qiáng)度最強(qiáng)離子作為定量離子對(duì)進(jìn)行計(jì)算。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 依次準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，用空白樣品提取液稀釋成濃度為土霉素0、10、20、40、60、100、200 ng·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，由低濃度到高濃度進(jìn)樣，按照液相色譜條件分析，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.5 樣品溶液的前處理 稱?。?±0.05）g樣品，置10 ml容量瓶中，加入McIlvaine-Na2EDTA緩沖液至刻度，充分混勻，振搖30 min，9000 r·min-1離心10min，溫度低于10 ℃，備用。

精密量取備用液5 ml過(guò)HLB小柱（用甲醇、水各5 ml預(yù)洗活化），用水、5%甲醇水溶液各5 ml淋洗，減壓抽干。用甲醇5 ml洗脫，減壓抽干，收集洗脫液，洗脫液用水浴氮?dú)獯蹈桑囟鹊陀?0℃），用0.1%甲酸水1 ml充分溶解殘余物，過(guò)濾膜后作為試樣溶液，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.4.6 靈敏度確定 將適量藥物加入到空白蜂蜜中，制成2、5、10μg·kg-1的三個(gè)濃度添加樣品，經(jīng)上述方法進(jìn)行處理后，用LC－MS/MS檢測(cè)。觀察藥物特征離子質(zhì)量色譜峰的信噪比（S/N）和對(duì)應(yīng)藥物濃度，（S/N）＞3者定其為方法檢測(cè)限；（S/N）＞10者定為其方法定量限。

1.4.7 準(zhǔn)確度和精確度的確定

采用標(biāo)準(zhǔn)添加方法，取土霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，分別添加到空白蜂蜜中，制得濃度為40、100、200 μg·L-1的系列空白添加試料（低、中、高三個(gè)濃度），每個(gè)濃度做6個(gè)平行試驗(yàn)，重復(fù)3次，求批內(nèi)批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表2 蜂蜜中添加土霉素的精密度、回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照上述配制方法，土霉素在0～200 ng·mL-1的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，得回歸方程為y=18341x+10106，相關(guān)系數(shù)R2＞0.999。

2.2 方法靈敏度

按上述方法進(jìn)行處理，結(jié)果顯示方法檢測(cè)限為5μg·kg-1，定量限為10μg·kg-1?？瞻追涿邸⒖瞻追涿厶砑油撩顾氐目傠x子流圖（Total Ion Current，TIC）和特征離子質(zhì)量色譜圖見(jiàn)圖1、2。

2.3 精密度和回收率試驗(yàn)

按上述1.4.5方法進(jìn)行處理，分別計(jì)算批內(nèi)和批間精密度和回收率結(jié)果見(jiàn)表2。該方法準(zhǔn)確度較高，回收率65.0%以上，批內(nèi)變異系數(shù)小于12%，批間變異系數(shù)小于3%。

2.4 分組飼喂土霉素實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果

分組飼喂土霉素，不同方式在不同時(shí)間點(diǎn)的蜂蜜中土霉素濃度的實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3，從表中可看出蜂蜜在給藥7d后，土霉素+蜂蜜給藥方式土霉素藥物濃度最高為820×10 μg.kg-1，土霉素+花粉方式45d的土霉素藥物濃度最小為2.38 μg.kg-1。蜂蜜中土霉素沒(méi)有雜質(zhì)干擾且峰形良好，具體見(jiàn)圖3。

表3 飼喂土霉素含量測(cè)定結(jié)果

圖1 空白蜂蜜樣品溶液TIC和特征離子色譜圖

圖2 空白樣品添加土霉素對(duì)照品溶液TIC和特征離子色譜圖（10 μg·kg-1）

圖3 飼喂土霉素的蜂蜜樣品溶液TIC和特征離子色譜圖

2.5 色譜條件的優(yōu)化

本方法比較了甲醇和乙腈、水和0.1%、0.3%甲酸水溶液作為流動(dòng)相對(duì)分離的影響。在C18色譜柱上乙腈的分離度優(yōu)于甲醇，甲醇水溶液優(yōu)于水。結(jié)果0.1%甲酸水和乙腈梯度洗脫對(duì)樣品進(jìn)行分析，土霉素色譜峰形對(duì)稱性良好。

3 討論

3.1 前處理方法的優(yōu)化

本方法通過(guò)對(duì)樣品前處理?xiàng)l件的充分優(yōu)化改進(jìn)，建立了適用于蜂蜜中土霉素藥物殘留檢測(cè)的UPLC－MS/MS方法。與GB/T 18932.23-2003比較，該檢測(cè)方法快速、簡(jiǎn)便、結(jié)果可靠，靈敏度和精確度均能滿足獸藥殘留分析方面的要求。

3.2 安全風(fēng)險(xiǎn)

通過(guò)此次試驗(yàn)，同劑量藥物的兩種喂藥方式在蜂蜜中均檢測(cè)出高濃度藥物，蜂蜜中土霉素放置時(shí)間的延長(zhǎng)，藥物濃度明顯地消減，45天后檢測(cè)結(jié)果顯示仍然有殘留，說(shuō)明無(wú)論是“花粉+藥物”還是“蜂蜜+藥物”的用藥方式，均會(huì)造成產(chǎn)品污染，影響產(chǎn)品安全，并且代謝時(shí)間長(zhǎng)，養(yǎng)殖過(guò)程中應(yīng)禁止使用。

[1] 許喜蘭，許曉君.蜂產(chǎn)品中藥物殘留的來(lái)源及其控制措施[J].養(yǎng)蜂科技，2004，（6）：24.

[2] 閆小峰.四環(huán)素類抗生素殘留檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J]中國(guó)獸藥雜志，2010，44（5）：47-50.

[3] 張?chǎng)?，吳劍平，李丹妮，?UPLC－MS/MS檢測(cè)七種動(dòng)物源食品中四環(huán)素類藥物殘留量的研究[J].中國(guó)獸藥雜志，2015，49（12）：36-42.

單乃榮（1969—），女，獸醫(yī)師，主要從事畜禽產(chǎn)品安全、獸藥殘留檢測(cè)與研究。