朱德全 王茗悅 栗金柳

摘要 [目的]分析兩歧雙歧桿菌PRL2010菌體外表面蛋白的功能。[方法]以兩歧雙歧桿菌PRL2010基因組序列為研究對(duì)象，采用Perry等人分析革蘭氏陽性菌菌體外表面蛋白（PSE蛋白）的Inmembrane方法，同時(shí)采用COG功能數(shù)據(jù)庫對(duì)預(yù)測(cè)的外表面蛋白進(jìn)行功能注釋和聚類分析。[結(jié)果]PRL2010外表面蛋白包括28個(gè)細(xì)胞壁蛋白、12個(gè)脂蛋白、182個(gè)細(xì)胞膜蛋白、38個(gè)分泌蛋白。PRL2010外表面蛋白的功能分析結(jié)果顯示，大多數(shù)外表面蛋白與細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的生物合成，無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝，防御機(jī)制，碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝等有關(guān)。 [結(jié)論]該研究可為探討該菌與宿主相互作用的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 兩歧雙歧桿菌；基因組；外表面蛋白；功能

中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）18-0118-02

Abstract [Objective]To analyze the function of the outer surface proteins of Bifidobacterium bifidum PRL2010. [Method]The genome sequence of B. bifidum PRL2010 was used to study the potentially surface exposed proteins （ PSE proteins ） by Inmembrane used by Perry et al， to analyze PSE proteins of Grampositive bacteria. Functional annotation and cluster analysis of predicted surface proteins were performed by using COG （Cluster of Orthologous Groups of proteins） functional database. [Result]The outer surface protein of PRL2010 included 28 cell wall proteins，12 lipoproteins，182 cell membrane proteins，38 secretory proteins. Function analysis of the outer surface proteins showed that most outer surface proteins were involved in amino acid transport and metabolism， carbohydrate transport and metabolism， cell wall or cell membrane formation， defense mechanism， inorganic ion transport and metabolism.[Conclusion]The study provided the basis for studing molecular methanisms of interaction between bacteria and their host.

Key words Bifidobacterium bifidum；Genome；Outer surface protein；Function

兩歧雙歧桿菌PRL2010作為一種腸道內(nèi)的益生菌株，它具有抑制腸道致病菌黏附[1]、降低血清膽固醇[2]、調(diào)節(jié)宿主免疫[3]、調(diào)整腸道菌群等益生作用。雙歧桿菌的外表面蛋白在介導(dǎo)菌體與宿主細(xì)胞黏附定殖、與外界環(huán)境相互作用方面起著非常重要的作用[4-5]。2010年該菌株完成了全基因組測(cè)序和功能注釋，共1 791個(gè)基因，1 706個(gè)編碼蛋白[6]。

該菌株基因組測(cè)序的完成，使得利用基因組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行功能基因組學(xué)分析得以實(shí)施，如菌體外表面蛋白的分析。目前關(guān)于細(xì)菌外表面蛋白的基因組分析主要集中在致病菌[7-9]和乳桿菌方面，如Barinov等[10]采用SurfG+的方法對(duì)革蘭氏陽性菌進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示該方法是一種非常有效的分析革蘭氏陽性菌外表面蛋白的方法。同樣，2013年P(guān)erry等[11]提出更為容易和方便的分析方法：Inmembrane。目前關(guān)于雙歧桿菌外表面蛋白的基因組預(yù)測(cè)和功能分析，國(guó)內(nèi)外鮮見報(bào)道。以兩歧雙歧桿菌PRL2010全基因組編碼蛋白序列為研究對(duì)象，采用Inmembrane方法分析該菌株外表面蛋白和功能，以期為探討該菌與宿主相互作用的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）GenBank公布的兩歧雙歧桿菌PRL2010全基因組序列，GenBank 的登錄號(hào)是NC_014638.1。

1.2 方法

采用Perry等[11]分析革蘭氏陽性菌外表面蛋白的Inmembrane方法，即采用SignalP4.0、LipoP、HMM search 2.0等一系列生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測(cè)革蘭氏陽性菌外表面的蛋白，預(yù)測(cè)并統(tǒng)計(jì)各類外表面蛋白（脂蛋白、細(xì)胞壁蛋白、細(xì)胞膜蛋白、分泌蛋白），利用COG功能數(shù)據(jù)庫對(duì)各類蛋白進(jìn)行注釋，同時(shí)進(jìn)行COG功能聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩歧雙歧桿菌PRL2010菌體外表面蛋白的種類分析

兩歧雙歧桿菌PRL2010菌體外表面蛋白的種類分析結(jié)果見表1。分析結(jié)果顯示，兩歧雙歧桿菌PRL2010基因組編碼的1 706個(gè)蛋白中，暴露于菌體外表面蛋白共計(jì)260個(gè)，占基因組蛋白比例為15.2%。在這些蛋白中，定位于細(xì)胞膜的蛋白數(shù)目最多，達(dá)182個(gè)，占基因組蛋白比例為10.7%，這些跨膜螺旋數(shù)的膜蛋白分布見圖1。

外表面蛋白的膜蛋白中，具有1個(gè)跨膜螺旋數(shù)的蛋白最多（87個(gè)），其次是具有2個(gè)和3個(gè)跨膜螺旋數(shù)的蛋白，分別為23個(gè)和16個(gè)。

2.2 兩歧雙歧桿菌PRL2010菌體外表面蛋白的功能分析

兩歧雙歧桿菌PRL2010基因組預(yù)測(cè)的外表面蛋白功能分析結(jié)果見圖2。兩歧雙歧桿菌PRL2010菌體外表面蛋白數(shù)目為260個(gè)。從圖2可以看出，在這些蛋白中，含有較大比例的蛋白沒有功能注釋（128個(gè)），132個(gè)蛋白具有COG功能注釋。在有具體功能注釋的蛋白中，所占比例較大的是與細(xì)胞壁、細(xì)胞膜生物合成有關(guān)（17個(gè)）；與無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝有關(guān)（12個(gè)）、與防御機(jī)制有關(guān)（12個(gè)）、與碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝有關(guān)（11個(gè)）、與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝有關(guān)（8個(gè)）等。功能聚類分析結(jié)果表明菌體外表面蛋白與這些功能有關(guān)。

3 討論與結(jié)論

細(xì)菌外表面的數(shù)量和種類與微生物的特性和生長(zhǎng)環(huán)境有著密切的聯(lián)系，特別

是與宿主之間的相互作用，如根癌土壤桿菌，它是一類普遍存在于土壤中的革蘭氏陰性菌，植物根的表面依靠由根組織滲透出來的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生存[12]；再如馬鈴薯晚疫病菌是引起馬鈴薯和西紅柿晚疫病的病原菌，其生存環(huán)境主要是植物體內(nèi)，分析發(fā)現(xiàn)潛在的分泌到細(xì)胞外蛋白為671個(gè)，占基因組蛋白總數(shù)的3%。由于越來越多菌株全基因組測(cè)序的完成，采用基因組編碼蛋白序列預(yù)測(cè)細(xì)菌外表面蛋白成為可能。最早預(yù)測(cè)革蘭氏陽性菌外表面蛋白的方法是SurfG+，但該方法里面的一些程序網(wǎng)上不一定能隨時(shí)獲得，另外它主要用于預(yù)測(cè)革蘭氏陽性菌。Perry等[11]于2013年提出了Inmembrane的分析方法，該方法對(duì)SurfG+方法進(jìn)行了完善和補(bǔ)充，程序很容易網(wǎng)上在線獲取，并且可以對(duì)革蘭氏陰性菌進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

該研究預(yù)測(cè)分析得到的兩歧雙歧桿菌PRL2010 260個(gè)外表面蛋白中，132個(gè)蛋白沒有功能注釋，這部分蛋白還需要進(jìn)行進(jìn)一步的功能研究和注釋。在有功能注釋的蛋白中，所占比例較大的是與細(xì)胞壁、細(xì)胞膜生物合成有關(guān)；與無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝有關(guān)；與防御機(jī)制有關(guān)；與碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝有關(guān)、與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝有關(guān)。功能分析結(jié)果表明菌體外表面蛋白在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換、環(huán)境適應(yīng)、細(xì)胞穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要作用。該研究獲得的結(jié)果將對(duì)今后研究?jī)善珉p歧桿菌PRL2010與宿主作用的分子機(jī)制提供標(biāo)靶，同時(shí)，也為益生菌領(lǐng)域的研究發(fā)展及應(yīng)用分析提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] SERAFINI F，STRATI F，RUASMADIEDO P，et al.Evaluation of adhesion properties and antibacterial activities of the infant gut commensal Bifidobacterium bifidum PRL2010 [J].Anaerobe，2013，21：9-17.

[2] ZANOTTI I，TURRONI F，PIEMONTESE A，et al.Evidence for cholesterollowering activity by Bifidobacterium bifidum PRL2010 through gut microbiota modulation[J].Appl Microbiol Biotechnol，2015，99（16）：6813- 6829.

[3] TURRONI F，TAVERNITI V，RUASMADIEDO P，et al.Bifidobacterium bifidum PRL2010 modulates the host innate immune response[J].Applied and environmental microbiology，2014，80（2）：730-740.

[4] LIU C，ZHANG Z Y，DONG K，et al.Adhesion and immunomodulatory effects of Bifidobacterium lactis HN019 on intestinal epithelial cells INT407[J].World journal of gastroenterology，2010，16（18）：2283-2290.

[5] GILAD O，SVENSSON B，VIBORG A H，et al.The extracellular proteome of Bifidobacterium animalis subsp.lactis BB-12 reveals proteins with putative roles in probiotic effects[J].Proteomics，2011，11（12）：2503-2514.

[6] TURRONI F，BOTTACINI F，F(xiàn)ORONI E，et al.Genome analysis of Bifidobacterium bifidum PRL2010 reveals metabolic pathways for hostderived glycan foraging[J].Proceedings of the national academy of sciences of the united states of america，2010，107（45）：19514-19519.

[7] 趙文杰，曾嘉，柳建設(shè)，等.嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因組分泌蛋白的初步分析[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，8（1）：22-26.

[8] 周曉罡，侯思名，陳鐸文，等.馬鈴薯晚疫病菌全基因組分泌蛋白的初步分析[J].遺傳，2011，33（7）：785-793.

[9] 周曉罡，李成云，趙之偉，等.粗糙脈孢菌基因組分泌蛋白的初步分析[J].遺傳，2006，28（2）：200-207.

[10] BARINOV A，LOUX V，HAMMANI A，et al.Prediction of surface exposed proteins in Streptococcus pyogenes，with a potential application to other Grampositive bacteria[J].Proteomics，2009，9（1）：61-73.

[11] PERRY A J，HO B K.Inmembrane，a bioinformatic workflow for annotation of bacterial cellsurface proteomes[J].Source code for biology and medicine，2013，8（1）：9.

[12] 范成明，李成云，趙明富，等.根癌土壤桿菌C58 Cereon中分泌蛋白信號(hào)肽分析[J].微生物學(xué)報(bào)，2005，45（4）：561-566.