張加姿 李開(kāi)心 于寶佳 岳潔瑜 王華忠

（天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387）

研究報(bào)告

小麥自噬相關(guān)因子ATG5的原核表達(dá)和抗血清制備

張加姿 李開(kāi)心 于寶佳 岳潔瑜 王華忠

（天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387）

細(xì)胞自噬在植物生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境響應(yīng)中扮演了重要角色，ATG5是參與自噬小體組裝的核心因子之一。在前期工作中我們克隆了兩個(gè)小麥ATG5基因TaATG5a和TaATG5b，并對(duì)其開(kāi)展了初步的功能分析。鑒于后續(xù)基因功能研究中的免疫學(xué)方法涉及對(duì)特異性抗體的需求，通過(guò)載體構(gòu)建、原核表達(dá)和親和層析過(guò)程獲得了TaATG5a的重組蛋白，經(jīng)兔免疫過(guò)程制備了TaATG5a的抗血清，采用ELISA和Western雜交等方法鑒定了抗體的效價(jià)和特異性。結(jié)果表明，克隆于pET30a載體上的TaATG5a在大腸桿菌中能夠被IPTG高效誘導(dǎo)表達(dá)，重組蛋白的表觀分子量與理論值基本一致，表達(dá)量在誘導(dǎo)0-8 h范圍內(nèi)逐漸增加。純化的重組蛋白純度較高，滿(mǎn)足抗體制備要求。制備的抗血清能特異性識(shí)別原核表達(dá)和小麥內(nèi)源的TaATG5a，效價(jià)達(dá)到1∶25 600。此外，制備的抗血清通過(guò)Western雜交還能夠識(shí)別共價(jià)連接的小麥ATG12-ATG5復(fù)合物，該復(fù)合物是小麥葉片中ATG5的主要存在形式。

小麥；自噬相關(guān)因子ATG5；原核表達(dá)；抗血清

細(xì)胞自噬（Autophagy，后文稱(chēng)為自噬）是一種重要的 真核生物細(xì)胞內(nèi)膜泡運(yùn)輸過(guò)程，負(fù)責(zé)細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)的靶向液泡（動(dòng)物是溶酶體）運(yùn)輸和分解。在自噬過(guò)程中，待分解物質(zhì)被雙層結(jié)構(gòu)的膜泡包裹形成自噬小體；隨后自噬小體外膜與液泡膜融合，藉此將內(nèi)膜及包裹的物質(zhì)（自噬小泡）送入液泡［1，2］。自噬小體的組裝及與液泡的融合等過(guò)程是在包括ATG5在內(nèi)的一系列自噬相關(guān)因子（Autophagy-related，ATG）參與下實(shí)現(xiàn)的。在有關(guān)ATG5參與自噬的角色中，研究得最清楚的是其以共價(jià)連接的ATG12-ATG5形式與ATG16形成復(fù)合物（ATG12-ATG5·ATG16）4，該復(fù)合物催化ATG8與脂類(lèi)分子磷脂酰乙醇胺（PE）的連接，藉此將ATG8定位于自噬膜表面［3，4］，ATG8在自噬膜的起始、延伸、合攏及與液泡的融合等過(guò)程中發(fā)揮重要作用［5，6］。此外，植物ATG5還表現(xiàn)出在早期吞噬泡開(kāi)口處的環(huán)形定位特征，可能參與自噬膜從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面的起始、擴(kuò)展及閉合等過(guò)程［7］。需要注意的是，對(duì)動(dòng)物的研究發(fā)現(xiàn)還存在另一類(lèi)不依賴(lài)于ATG5的自噬途徑［8，9］。除參與自噬核心過(guò)程外，ATG5還具有非自噬或在自噬與其他細(xì)胞過(guò)程之間建立聯(lián)系的功能，如動(dòng)物ATG5參與了抗病毒免疫信號(hào)的抑制［10］和細(xì)胞凋亡的促進(jìn)［11］，在DNA損傷劑作用下表現(xiàn)轉(zhuǎn)位到核內(nèi)促進(jìn)有絲分裂異常現(xiàn)象的作用［12］。自噬的分子機(jī)制研究始于酵母，后來(lái)發(fā)現(xiàn)其在包括動(dòng)植物在內(nèi)的真核生物中非常保守，動(dòng)植物含有包括ATG5在內(nèi)的大部分酵母ATG的同源基因［13-15］。鑒于ATG5在自噬中的重要作用及其有別于其他ATG因子的功能多樣性，以ATG5為靶標(biāo)深入探索其參與的自噬及其他細(xì)胞過(guò)程的機(jī)制和生理功能具有重要意義。

自噬參與了植物的正常生長(zhǎng)、發(fā)育和衰老等過(guò)程，也與植物適應(yīng)環(huán)境的生理過(guò)程密切相關(guān)［16-18］。此前本實(shí)驗(yàn)室先后報(bào)道了重要農(nóng)作物小麥ATG4、ATG6、ATG8、ATG10和ATG18的鑒定，發(fā)現(xiàn)小麥對(duì)生物、非生物脅迫的響應(yīng)過(guò)程涉及對(duì)自噬水平的調(diào)控［19，20］。本實(shí)驗(yàn)室目前也已經(jīng)克隆了兩個(gè)小麥ATG5基因TaATG5a（KF294799）和TaATG5b（KF294800），表達(dá)分析和基因沉默研究結(jié)果初步表明其參與了小麥的自噬和逆境脅迫響應(yīng)等過(guò)程（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。鑒于后續(xù)的基因功能研究工作涉及免疫學(xué)方法和對(duì)特異性抗體的需求，本研究利用原核表達(dá)和蛋白純化方法獲得了小麥TaATG5a的重組蛋白，制備了重組蛋白的抗血清。利用ELISA和Western雜交方法分析了抗血清對(duì)抗原識(shí)別的特異性和效價(jià)，鑒定了小麥內(nèi)源ATG5的存在形式。

1 材料與方法

1.1 材料

原核表達(dá)載體pET30a質(zhì)粒、克隆有小麥TaATG5a基因的pLB-ATG5a載體質(zhì)粒、大腸桿菌菌株 DH5α和 BL21（DE3）由本實(shí)驗(yàn)室保存。限制性核酸內(nèi)切酶NotⅠ購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；Ni-Agarose His 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒（CW0894S）、ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（CW0049S）和辣根過(guò)氧化物酶底物TMB溶液（CW0050S）購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；弗氏完全佐劑和弗式不完全佐劑購(gòu)自美國(guó) Sigma-aldrich 公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG由北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司提供。其他生化試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。?gòu)建載體的DNA 測(cè)序由華大基因科技股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 設(shè)計(jì)合成兩端添加NotⅠ識(shí)別位點(diǎn)的PCR引物對(duì)5aNOTI-F（ATAAGAATGCGGCCGCACGGCGCGAGCAATG）/5aNOTI-R（ATAAGAATGCGGCCGCTCATGCCCCAACGTA），使用高保真pfu DNA聚合酶從pLB-ATG5a上擴(kuò)增TaATG5a的全長(zhǎng)ORF。擴(kuò)增片段經(jīng)電泳、回收和NotⅠ酶切后連接于原核表達(dá)載體pET30a的相應(yīng)切點(diǎn)處，經(jīng)測(cè)序鑒定插入方向正確的重組表達(dá)載體pET-ATG5a。提取載體質(zhì)粒并將其導(dǎo)入到大腸桿菌表達(dá)菌種BL21（DE3）中。

1.2.2 原核表達(dá) 將含有pET-ATG5a的菌種BL21（DE3）劃線(xiàn)接種于固體LBK培養(yǎng)基（含50 mg/L卡那霉素的LB）表面，過(guò)夜培養(yǎng)至長(zhǎng)出單克隆。挑取單克隆接種于LBK 液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將培養(yǎng)物按1%的比例擴(kuò)大到5 mL 相同培養(yǎng)基中，37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD600約為0.6-0.8）。加入終濃度為500 μmol/L的IPTG，于28℃條件下震蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)目標(biāo)基因的表達(dá)。分別于誘導(dǎo)后0、2、4、6和8 h 取1 mL 菌液用于總蛋白的SDS-PAGE分析。1.2.3 重組蛋白的純化 重組蛋白為N 端含組氨酸標(biāo)簽的His（6）-TaATG5a，因此使用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒在非變性條件下純化重組蛋白。菌體超聲破碎、層析柱平衡、蛋白上樣及雜蛋白清洗等過(guò)程參照試劑盒手冊(cè)進(jìn)行。使用從低到高的咪唑濃度梯度洗脫液分段洗脫目標(biāo)蛋白。對(duì)收集的各管洗脫液取20 μL進(jìn)行SDS-PAGE分析。根據(jù)電泳結(jié)果混合目標(biāo)蛋白較純、含量較高的洗脫液。

1.2.4 抗血清制備和效價(jià)檢測(cè) 將純化的重組蛋白（抗原）溶液與等體積的弗氏佐劑（初次免疫）或弗氏不完全佐劑（加強(qiáng)免疫）完全混合形成油包水的免疫原。對(duì)新西蘭大白兔進(jìn)行背部皮下注射免疫，打8-10個(gè)點(diǎn)。初次免疫1次，400 μg抗原；此后每10-15 d加強(qiáng)免疫1次，共3次，每次200 μg抗原。取免疫兔子的頸動(dòng)脈血，室溫靜置2 h，5 000 r/min離心10 min后收集多抗血清，-20℃保存。以免疫前收集的耳靜脈血清作為陰性血清對(duì)照。

采用ELISA法對(duì)抗血清（一抗）進(jìn)行抗原結(jié)合特異性鑒定和效價(jià)測(cè)定。對(duì)一抗從200倍開(kāi)始使用PBS進(jìn)行2倍梯度稀釋?zhuān)瞻讓?duì)照為PBS，陰性對(duì)照為陰性血清200倍稀釋液。以純化的His（6）-TaATG5a重組蛋白為抗原包被酶標(biāo)板，包被好的酶標(biāo)板經(jīng)脫脂奶粉封閉、一抗結(jié)合、洗滌、二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，1∶10 000稀釋度）結(jié)合和洗滌等步驟后，加入含H2O2的底物TMB溶液顯色10 min，再加入2 mol/L的H2SO4終止反應(yīng)，于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定并記錄吸光值。

1.2.5 Western雜交 大腸桿菌或小麥葉片總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離和半干轉(zhuǎn)印過(guò)程轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。轉(zhuǎn)印膜經(jīng)脫脂奶粉封閉、一抗（1∶2 000稀釋度）結(jié)合、洗滌、二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，1∶10 000稀釋度）結(jié)合和洗滌等步驟后，使用ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒試劑在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（ChemiDocXRS+，BioRad）中進(jìn)行雜交信號(hào)的檢測(cè)和拍照。

2 結(jié)果

2.1 小麥TaATG5a的原核表達(dá)

構(gòu)建了小麥TaATG5a的原核表達(dá)載體pETATG5a。28℃震蕩培養(yǎng)條件下，在含有該表達(dá)載體的大腸桿菌BL21（DE3）培養(yǎng)物中加入IPTG誘導(dǎo)目標(biāo)基因表達(dá)。如圖1所示，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后的大腸桿菌總蛋白中出現(xiàn)重組蛋白His（6）-TaATG5a條帶，表達(dá)量在誘導(dǎo)0-8 h范圍內(nèi)隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，在誘導(dǎo)8 h后達(dá)到最高。帶有His（6）標(biāo)簽的重組蛋白表觀分子量與理論值（47.6 kD）基本一致。

圖1 小麥TaATG5a基因的原核表達(dá)

2.2 小麥TaATG5a重組蛋白的純化

采用Ni 柱親和層析方法從經(jīng)IPTG誘導(dǎo)8 h的大腸桿菌總蛋白中純化重組蛋白His（6）-TaATG5a。重組蛋白掛柱后，使用咪唑濃度逐漸升高的洗脫液進(jìn)行洗脫。如圖2所示，隨著洗脫液中咪唑濃度的升高，雜蛋白含量逐漸減少，目標(biāo)重組蛋白含量逐漸增加。300 mmol/L咪唑洗脫液中重組蛋白的純度較高，滿(mǎn)足抗體的制備要求。

圖2 原核表達(dá)小麥TaATG5a重組蛋白的純化

2.3 小麥TaATG5a抗血清的制備和效價(jià)測(cè)定

以純化的重組蛋白His（6）-TaATG5a作為免疫原，經(jīng)兔免疫方法獲得了TaATG5a的抗血清。Western雜交和ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抗血清能特異性識(shí)別原核表達(dá)的TaATG5a，證實(shí)抗血清中特異性抗體的存在（圖3-A和3-B）。Western雜交結(jié)果還表明，導(dǎo)入大腸桿菌中的TaATG5a在加入誘導(dǎo)物IPTG之前既有低水平的表達(dá)（圖3-A的泳道3），而這種低水平的表達(dá)不能被考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)到（圖3-A的泳道1）。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，如以O(shè)D值為陰性孔2.1倍的最大稀釋度作為抗血清效價(jià)，制備的抗血清效價(jià)達(dá)到1∶25 600（圖3-B），滿(mǎn)足Western雜交、免疫沉淀等實(shí)驗(yàn)對(duì)抗體特異性和效價(jià)的要求。

圖3 抗血清對(duì)原核表達(dá)TaATG5a重組蛋白的識(shí)別

使用制備的抗血清對(duì)小麥葉片總蛋白進(jìn)行Western雜交，結(jié)果出現(xiàn)兩條清晰的雜交帶（圖4）。分子量相對(duì)較小的帶的表觀分子量與TaATG5a理論值（40.8 kD）接近，分子量相對(duì)較大的帶的表觀分子量與共價(jià)連接的ATG12-ATG5理論值（51.2 kD）接近。因此，初步判斷較小的帶來(lái)自游離形式的TaATG5a及其他六倍體小麥中含有的與TaATG5a大小相近且高度相似的同源蛋白，較大的帶來(lái)自共價(jià)連接的ATG12-ATG5復(fù)合物。從雜交信號(hào)強(qiáng)度來(lái)看，小麥葉片中的ATG5主要以共價(jià)連接的ATG12-ATG5形式存在。

圖4 利用Western雜交方法鑒定抗血清對(duì)小麥內(nèi)源TaATG5a的識(shí)別

3 討論

酵母的自噬分子機(jī)制研究于2016年獲得諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，近年來(lái)有關(guān)高等動(dòng)植物的自噬機(jī)制和生理功能研究方興未艾。細(xì)胞通過(guò)自噬過(guò)程清除衰老、變性的細(xì)胞器、大分子及入侵的病原，藉此維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、協(xié)調(diào)能量供給、調(diào)節(jié)信號(hào)通路、調(diào)控細(xì)胞死亡以及響應(yīng)環(huán)境中的生物和非生物脅迫。植物上，已發(fā)現(xiàn)自噬與植株正常生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝、衰老以及響應(yīng)營(yíng)養(yǎng)缺乏、高鹽、干旱、氧化、淹水和病原菌侵染等逆境脅迫過(guò)程密切相關(guān)。ATG5是參與自噬小體組裝的重要因子之一，因而也是植物上開(kāi)展自噬分子機(jī)制和生理功能研究的主要目標(biāo)基因之一［16-18］。此前本實(shí)驗(yàn)室對(duì)兩個(gè)小麥ATG5基因TaATG5a和TaATG5b開(kāi)展了表達(dá)分析和基因沉默等DNA和RNA水平的研究，結(jié)果初步表明其參與了小麥的自噬和逆境脅迫響應(yīng)等過(guò)程。后續(xù)的基因功能解析工作將涉及蛋白水平的Western雜交和免疫共沉淀等免疫學(xué)方法，目標(biāo)蛋白特異性抗體的獲得是開(kāi)展此類(lèi)方法研究的必備條件之一。

普通小麥?zhǔn)橇扼w物種，含有A、B 和D三個(gè)同源染色體組，對(duì)應(yīng)二倍體物種的每個(gè)基因在普通小麥內(nèi)通常都以3個(gè)多倍體同源基因（Homeolog）的家族形式存在。家族成員蛋白往往大小相近且序列高度相似，以其中一種蛋白全長(zhǎng)肽鏈為抗原制備的多抗往往會(huì)與其他蛋白產(chǎn)生交叉反應(yīng)，難以將它們區(qū)分開(kāi)。小麥TaATG5a和TaATG5b的序列長(zhǎng)度相同且相似性達(dá)到96%，基因的染色體定位結(jié)果也表明了他們的多倍體同源關(guān)系（未發(fā)表數(shù)據(jù)），選擇TaATG5a或TaATG5b制備的多抗血清在Western雜交中應(yīng)該能夠同時(shí)識(shí)別小麥總蛋白中每個(gè)ATG5家族成員。鑒于此，本研究選擇小麥TaATG5a為抗原，通過(guò)原核表達(dá)載體構(gòu)建、IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)和親和層析過(guò)程獲得了TaATG5a的重組蛋白，使用重組蛋白作為免疫原制備了兔源的TaATG5a抗血清。ELISA和Western雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，制備抗血清中的多抗能特異性識(shí)別原核表達(dá)和小麥內(nèi)源的TaATG5a、效價(jià)較高，為今后在小麥上通過(guò)免疫學(xué)方法深入研究ATG5和自噬的功能、篩選鑒定ATG5互作蛋白等工作奠定了基礎(chǔ)。此外，使用制備的抗血清通過(guò)Western雜交還能夠鑒定共價(jià)連接的小麥ATG12-ATG5復(fù)合物，而且結(jié)果顯示此復(fù)合物是小麥ATG5的主要存在形式，與擬南芥和動(dòng)物ATG5存在形式的報(bào)道一致［23，24］。

4 結(jié)論

利用原核表達(dá)和蛋白純化方法獲得了小麥TaATG5a的重組蛋白，制備了重組蛋白的抗血清?？寡迥芴禺愋宰R(shí)別TaATG5a，效價(jià)達(dá)到1∶25 600。制備的抗血清還能夠識(shí)別共價(jià)連接的小麥ATG12-ATG5復(fù)合物，該復(fù)合物是小麥葉片中ATG5的主要存在形式。

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（責(zé)任編輯 朱琳峰）

Prokaryotic Expression of Wheat Autophagy-related Factor ATG5 and Preparation of Its Antiserum in Rabbits

ZHANG Jia-zi LI Kai-xin YU Bao-jia YUE Jie-yu WANG Hua-zhong
（Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance，School of Life Sciences，Tianjin Normal University，Tianjin 300387）

Autophagy is closely implicated in plant growth and development，as well as responses to environmental stimuli. ATG5 is one of the core factors involved in autophagosome assembly. Two wheat ATG5-encoding genes，TaATG5a and TaATG5b were cloned previously and are under deep functional study in our lab. In order to meet the need of specific antibodies in immunological methods used in further functional gene and protein study，a recombinant protein TaATG5a was acquired by vector construction，prokaryotic expression，and purification via the Ni-column affinity chromatography method，then the antiserum was prepared in rabbit immunization. The titer and specificity of the prepared antiserum were tested by the ELISA and Western blot assays. The results showed that the expression of TaATG5a cloned in vector pET30a was efficiently induced in Escherichia coli by IPTG，and gradually increased with the extension of IPTG induction time over 0 - 8 h. The apparent molecular weight of recombinant protein TaATG5a was close to its theoretical value. The purified recombinant protein was in high-purity that satisfied the requirements for antibody preparation. The prepared antiserum had a high titer of 1∶25 600 and specifically recognized TaATG5a in E. coli or wheat total protein. In addition，the ATG12-ATG5 in conjugated form，i.e.，the main form of wheat ATG5 in leaves，was also recognized by the prepared antiserum through Western blot assay.

wheat；ATG5；prokaryotic expression；antiserum

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0020

2017-01-20

天津市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（17JCZDJC33800），天津師范大學(xué)創(chuàng)新基金（52XC1604）

張加姿，女，碩士，研究方向：植物遺傳學(xué)；E-mail：15900331537@163.com

王華忠，男，博士，教授，研究方向：植物遺傳學(xué)；E-mail：skywhz@mail.tjnu.edu.cn