楊麗麗++宋軼琳++徐聲偉++張禹++肖桂花++張松

摘要丘腦底核（STN）深部腦刺激（DBS）已成為帕金森病的重要外科治療手段，然而其確切的作用機(jī)理尚不明確。本研究采用微機(jī)電系統(tǒng)（MEMS）技術(shù)制備了一種16通道植入式微電極陣列（MEA），在MEA表面修飾了鉑黑還原氧化石墨烯Nafion膜（Pt/RGO/Nafion）納米材料，用于同步檢測麻醉大鼠腦內(nèi)紋狀體神經(jīng)元在STN電刺激前后多巴胺（DA）含量和動(dòng)作電位（Spike）發(fā)放變化。STNDBS結(jié)果表明，電刺激20 s后，DA含量開始升高，最高達(dá)1.72 μmol/L，較高濃度狀態(tài)保持約50 s后回落至正常水平。與此同時(shí)， 檢測到在DA上升階段中間神經(jīng)元Spike發(fā)放活動(dòng)增強(qiáng)，在保持高于DA正常濃度水平階段，中等多棘神經(jīng)元（MSNs）放電頻率增加。本研究制備的微電極陣列傳感器能夠?qū)崿F(xiàn)腦內(nèi)多巴胺和電生理的原位實(shí)時(shí)檢測，有望成為神經(jīng)信息檢測的有力工具。

關(guān)鍵詞微機(jī)電系統(tǒng)； 微納電極陣列； 丘腦底核電刺激； 多巴胺； 動(dòng)作電位

1引 言

帕金森?。≒arkinson′s disease， PD）是人類最常見的神經(jīng)退行性運(yùn)動(dòng)障礙性疾病之一，其特征是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性丟失，紋狀體內(nèi)多巴胺濃度降低＼[1＼]。丘腦底核（Subthalamic nucleus， STN）深部腦刺激（Deep brain stimulation， DBS）對(duì)PD病人的僵直、運(yùn)動(dòng)遲緩、震顫和左旋多巴引起的異動(dòng)癥具有良好的改善效果，已成為帕金森病的重要外科治療手段。盡管STNDBS已廣泛應(yīng)用，其確切的作用機(jī)理尚不明確＼[2＼]。臨床研究表明，給予STN高頻電刺激后，PD患者的多巴胺（Dopamine， DA）藥物用量可以減少一半以上＼[3＼]，提示其可能影響DA的活性。紋狀體是基底節(jié)的輸出核團(tuán)，也是多巴胺的主要釋放區(qū)域，研究STNDBS對(duì)紋狀體神經(jīng)元電生理活動(dòng)和多巴胺含量的影響，對(duì)了解STNDBS作用機(jī)理有重要意義。

目前，在體神經(jīng)元電生理活動(dòng)記錄方法主要為微絲電極陣列＼[4～7＼]，實(shí)時(shí)微創(chuàng)多巴胺含量檢測的方法主要是微透析法定量多巴胺及代謝產(chǎn)物＼[8，9＼]和碳纖維電極快速循環(huán)伏安法檢測＼[10，11＼]。然而神經(jīng)元內(nèi)在信息傳遞依靠電信號(hào)和化學(xué)信號(hào)兩種模式，關(guān)系密切，實(shí)時(shí)同步檢測這兩種信號(hào)變化有利于全面了解神經(jīng)元的狀態(tài)。

為了實(shí)現(xiàn)腦內(nèi)STNDBS下的神經(jīng)元活動(dòng)雙模檢測，本研究制備了一種基于微機(jī)電系統(tǒng)（Microelectromechanical systems， MEMS）技術(shù)的16通道植入式微電極陣列（Microelectrode array， MEA），在其位點(diǎn)表面修飾鉑納米顆粒還原氧化石墨烯Nafion膜（Pt/RGO/Nafion）材料，使其適用于電生理和多巴胺電化學(xué)信號(hào)同步檢測。將此MEA植入麻醉大鼠腦內(nèi)紋狀體，實(shí)時(shí)檢測了丘腦底核電刺激前后的動(dòng)作電位（Spike）隨多巴胺含量的同步變化。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

USBME16FAISystem16通道濾波放大器（德國MultiChannel Systems公司）； 雙極型同心圓電刺激電極（美國Microprobes公司）； STG4002電刺激發(fā)生器（德國MultiChannel Systems公司）； Reference 600電化學(xué)工作站 （美國Gamry Instruments公司）； KH2200E超聲振蕩器（中國合創(chuàng)公司）； BX51TRF光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）； S4800掃描電鏡（日本Hitachi公司）； 51650立體定位儀（美國Stoelting公司）； 50121C液壓探針驅(qū)動(dòng)器（美國FHC公司）； MWD20實(shí)驗(yàn)室超純水器（中國美誠公司）； BSA124S電子天平（德國賽多利斯公司）。

氯鉑酸（H2PtCl6）、醋酸鉛（Pb（CH3COO）2），分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氧化石墨烯溶液（GO，2 mg/mL，南京先鋒納米科技公司）；Nafion陽離子交換膜（美國SigmaAldrich公司）；磷酸緩沖鹽片劑 （PBS，0.01 mol/L，Na2HPO4NaH2PO4KCl，pH 7.4，美國Sigma公司）；多巴胺（DA，美國Acros Organics公司）；抗壞血酸（AA）、尿酸（UA）、五羥色胺（5HT），美國Alfa Aesar公司）；生理鹽水（0.9%，石家莊四藥公司）；烏拉坦（Urethane，≥98%，上海國藥集團(tuán)）。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水（阻抗>18MΩ·cm），電極修飾材料用純水配制，體外標(biāo)定溶液用生理鹽水配制。

2.2植入式微電極陣列制備、修飾

實(shí)驗(yàn)記錄電極采用自制的基于MEMS工藝的硅基微電極陣列（MEA）探針，如圖1所示，MEA探針通過標(biāo)準(zhǔn)光刻及薄膜工藝在SOI硅片上批量制備，具體參數(shù)同文獻(xiàn)＼[12＼]。制備好的MEA通過鋁絲鍵合的方法和后端電路接口連接，并絕緣封裝，封裝后的電極見圖1E。微電極陣列探針的版圖（圖1A）包括三層： 鉑導(dǎo)電層、暴露電極位點(diǎn)及壓焊窗口點(diǎn)的Si3N4SiO2雙絕緣層及探針外形層。MEA厚30 μm，前端可植入部分長6 mm，為雙針型，每根針上有7個(gè)圓形電生理信號(hào)記錄位點(diǎn)（直徑20 μm）和1個(gè)長方形多巴胺電化學(xué)信號(hào)檢測位點(diǎn)（40 μm×20 μm）。每4個(gè)位點(diǎn)呈十字端點(diǎn)排列，相鄰位點(diǎn)間圓心至圓心距離為40 μm，兩個(gè)十字間距4 mm，見圖1B。鉑（Platinum， Pt）是一種貴金屬，常用于制備納米材料。石墨烯（Graphene， Gr）具有極大的表比面積和優(yōu)越的導(dǎo)電性能，其衍生物氧化石墨烯和還原氧化石墨烯常用于構(gòu)建電化學(xué)傳感器＼[13，14＼]。本研究對(duì)制備好的電極進(jìn)行Pt/RGO/Nafion修飾，以減低電極阻抗和增大對(duì)DA檢測的靈敏度及選擇性。具體修飾方法為： 2.5 mL 19.2 mmol/L 氯鉑酸， 2.5 mL 1.68 mmol/L 醋酸鉛和5 mL 2 mg/mL GO溶液，超聲2 h構(gòu)成電鍍液。構(gòu)建三電極體系，對(duì)電極為鉑絲電極，參比電極為Ag|AgCl電極，工作電極為封裝后的16位點(diǎn)微電極陣列，使用電化學(xué)工作站，在1 V的工作電壓下，采用計(jì)時(shí)電流法沉積50 s。電鍍結(jié)束大量去離子水沖洗后在PBS緩沖液（pH 7.4）中0.1～endprint

Symbolm@@ 1.6 V范圍內(nèi)以50 mV/s循環(huán)伏安法掃描10圈至電流與前一圈相比不再變化。沖洗后，在MEA表面滴涂 5 μL 0.5% Nafion 乙醇溶液，100℃烘烤30 min。電極位點(diǎn)修飾Pt/RGO/Nafion后光學(xué)顯微鏡下形貌如圖1C所示，圖1D為位點(diǎn)局部掃描電鏡圖片。

2.3植入式微電極陣列體外測試

在體實(shí)驗(yàn)前須進(jìn)行MEA體外多巴胺檢測和電生理檢測性能測試。所有測試均在屏蔽箱中進(jìn)行。針對(duì)電化學(xué)檢測，采用兩電極體系，工作電極為MEA電化學(xué)檢測位點(diǎn)，參比和對(duì)電極為Ag|AgCl電極。首先在50 μmol/L多巴胺PBS溶液中進(jìn)行CV掃描確定氧化峰電位，選定氧化峰電位為計(jì)時(shí)電流法測量的恒定電壓。測試基底溶液為50 mL PBS溶液，取50 μL 1000倍于標(biāo)示濃度的溶液加入到測試體系中，通過磁石轉(zhuǎn)子攪拌達(dá)到均勻狀態(tài)，形成標(biāo)準(zhǔn)溶液。首先測試了MEA電化學(xué)檢測位點(diǎn)在先后加入400 μmol/L尿酸、400 μmol/L抗壞血酸和20 μmol/L五羥色胺干擾物的響應(yīng)情況，測試完成后去離子水沖洗電極。測試電極位點(diǎn)在多巴胺溶液中的響應(yīng)曲線，測試方法為電極在測量體系溶液中達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)后，每隔100 s滴加由低至高濃度的DA標(biāo)準(zhǔn)溶液，形成0.01～110 μmol/L濃度范圍的測試用多巴胺溶液。針對(duì)電生理檢測，電極位點(diǎn)進(jìn)行150 mV正弦微弱信號(hào)下阻抗掃描測試，重點(diǎn)關(guān)注1 kHz處阻抗值，測試結(jié)果表明，修飾后電生理電極位點(diǎn)阻抗平均為29 kΩ。

2.4在體實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)選取健康SpragueDawley雄性大鼠一只，體重260 g，20%烏拉坦溶液腹腔注射麻醉（0.7～0.8 mL/100 g），固定在腦立體定位儀上，去除頭皮，暴露前囟點(diǎn)，電極定位大鼠紋狀體腦區(qū)（AP： +1.44 mm， ML：

Symbolm@@ 2.5 mm，DV：

Symbolm@@ 4.4 mm），刺激電極定位丘腦底核（AP：

Symbolm@@ 3.60 mm， ML： +2.5 mm，DV：

Symbolm@@ 8.1 mm）使用顱骨鉆在顱骨上開1 mm ×1 mm的電極植入窗口，直徑0.1 mm的刺激電極植入圓孔，植入電極前用鑷子挑開硬腦膜。此外，開出顱骨釘和參比電極（AP： +2.5 mm， ML： 0 mm）固定圓孔。定位結(jié)束后，首先植入刺激電極，將刺激電極垂直固定在微推進(jìn)器上，調(diào)整電極垂直高度使其尖端接觸軟腦膜表面，通過液壓推進(jìn)器緩慢勻速推進(jìn)至目標(biāo)深度，以牙科水泥固定。采用相同的方法植入MEA。

電化學(xué)信號(hào)測量方法： 采用兩電極體系，MEA電化學(xué)記錄位點(diǎn)為工作電極。采用計(jì)時(shí)電流法檢測腦內(nèi)多巴胺，施加恒電位+0.15 V，采樣頻率為2 Hz（采樣間隔為0.5 s）。MEA以1 μm/s的速度勻速下降至目標(biāo)區(qū)域，停留50 s后開始測定多巴胺氧化電流。

電生理信號(hào)測量方法為： MEA的14個(gè)電生理通道連接MultiChannel電生理記錄儀，25 kHz采樣頻率實(shí)時(shí)連續(xù)記錄電生理信號(hào)。實(shí)驗(yàn)體系均位于屏蔽箱中以最大程度降低外界噪聲干擾。實(shí)驗(yàn)中電刺激電極參數(shù)設(shè)置為60 Hz，雙向方波，每相2 ms，幅值300 μA，共120個(gè)脈沖，持續(xù)時(shí)間2 s。所有實(shí)驗(yàn)方法均符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作相關(guān)規(guī)定。

2.5電生理信號(hào)數(shù)據(jù)處理方法

將Mutichannel記錄到的原始信號(hào)用NeuroExplorer軟件250～5000 Hz帶通濾波， 采用閾值觸發(fā)采樣技術(shù)得到Spike信號(hào)，只有信噪比大于3∶1的Spike會(huì)被分析和處理。將記錄到的Spike通過Offline Sorter中的Kmeans聚類分析，可分離出同一測量點(diǎn)上檢測到的多個(gè)細(xì)胞單元信號(hào)，得到單神經(jīng)元的放電波形及時(shí)間序列[15]。

3結(jié)果與討論

3.1MEA的電化學(xué)性能

電極在50 μmol/L DA溶液中CV掃描，確定了DA在電極表面氧化峰電位為150 mV。在細(xì)胞外液中，尿酸（UA）和抗壞血酸（AA）含量可達(dá)多巴胺的100～1000倍＼[16＼]， 五羥色胺（5HT）和DA同屬單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，它們在裸電極上均會(huì)極大干擾DA檢測，為此測試電極在150 mV恒定電位下計(jì)時(shí)電流法對(duì)UA、AA和5HT的響應(yīng)電流，其結(jié)果能在很大程度上代表電極對(duì)多巴胺的選擇性，如圖2所示。微電極對(duì)400 μmol/L UA幾乎無響應(yīng)，對(duì)400 μmol/L AA響應(yīng)電流為4 pA，對(duì)20 μmol/L 5HT響應(yīng)電流為8 pA。PtRGONafion修飾微電極對(duì)UA、AA和5HT的響應(yīng)度均很低。

在150 mV恒定電位下計(jì)時(shí)電流法對(duì)不同濃度的DA溶液中響應(yīng)電流見圖3A，在0.01～110 μmol/L范圍內(nèi)，隨著多巴胺濃度的增加，PtRGONafion膜修飾微電極的響應(yīng)電流隨之臺(tái)階式上升。圖3B為電極表面氧化電流與多巴胺濃度的線性擬合關(guān)系，靈敏度為13.4 μA/（mol/L），線性相關(guān)系數(shù)R=0.999。實(shí)驗(yàn)表明，20 μmol/L DA造成了響應(yīng)電流上升256 pA，為20 μmol/L 5HT造成響應(yīng)電流的32倍。

本研究的微傳感器與其他電化學(xué)傳感器對(duì)多巴胺檢測的對(duì)比情況見表1。與傳統(tǒng)多巴胺電化學(xué)傳感器（如玻碳電極和微絲電極）相比，鉑微電極多巴胺檢測靈敏度顯著提高。本研究采用Pt/RGO/Nafion修飾，相比于其它微電極修飾方法，在保持同一數(shù)量級(jí)的檢測靈敏度外，DA氧化電位明顯降低，檢出限低。更低的氧化電位能夠提高電極的抗干擾性。氧化電位和檢測限降低的原因推測是由于鉑納米顆粒電沉積過程中與氧化石墨烯的復(fù)合能夠極大地增加電極的有效表面積，并且調(diào)控復(fù)合后鉑黑顆粒的粒徑，從而表現(xiàn)出更好的催化活性。氧化石墨烯通過電化學(xué)還原的方式形成還原氧化石墨烯后，能夠很大程度改善石墨烯含氧集團(tuán)引入帶來的缺陷＼[14＼]，提高電子轉(zhuǎn)移效率，并進(jìn)一步減低微電極阻抗。Nafion陽離子交換膜能夠排斥細(xì)胞外液中以陰離子形式存在的AA和UA分子，而能夠?yàn)橐躁栯x子形式存在的多巴胺分子提供傳輸通道＼[18，19＼]。在微電極Pt/RGO修飾后引入Nafion能夠進(jìn)一步減低AA和UA干擾，尤其是減低氧化電位更低的AA干擾。endprint

Pt/RGO/Nafion修飾微電極對(duì)多巴胺的電化學(xué)檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用150 mV DA氧化電位下計(jì)時(shí)電流法測量，修飾電極對(duì)典型干擾物UA、AA和5HT有極強(qiáng)的抗干擾性，且對(duì)DA檢出限低，靈敏度較好。MEA電化學(xué)檢測位點(diǎn)能夠很好地檢測多巴胺濃度變化。

3.2大鼠丘腦底核電刺激下動(dòng)作電位與多巴胺濃度同步變化

當(dāng)電極尖端植入至紋狀體記錄到穩(wěn)定的電化學(xué)和電生理信號(hào)后，標(biāo)為0時(shí)刻，282 s時(shí)對(duì)大鼠STN施加電刺激，持續(xù)時(shí)間為2 s。刺激前70 s，刺激后220 s，DA氧化電流和周圍4個(gè)通道Spike發(fā)放柵格圖同步變化以及各通道spike發(fā)放頻率情況如圖4A所示。

刺激結(jié)束后的20 s內(nèi)，DA氧化電流在由781 pA最高升至804 pA（350 s）時(shí)，隨后電流值緩慢回落，至425 s時(shí)，基本達(dá)到初始水平。電刺激后多巴胺濃度有明顯增加，最高達(dá)到1.72 μmol/L。

MEA位于紋狀體與細(xì)胞接觸良好的4個(gè)電生理位點(diǎn)Ch.1、Ch.4、Ch.5和Ch.9實(shí)時(shí)記錄了神經(jīng)電信號(hào)隨DA濃度升高的同步變化。從微電極位點(diǎn)的動(dòng)作電位柵格圖（圖4A）可見，不同通道動(dòng)作電位發(fā)放情況并不相同，柵格圖下為各通道Spike發(fā)放頻率隨時(shí)間變化圖。隨電刺激后多巴胺濃度的變化，Ch.1和Ch.5未出現(xiàn)明顯的動(dòng)作電位發(fā)放，而Ch.4在多巴胺濃度高于正常水平時(shí)出現(xiàn)明顯的spike發(fā)放頻率增加，Ch.9在多巴胺濃度上升時(shí)spike發(fā)放頻率明顯增加。

針對(duì)Ch.4和Ch.9通道檢測到的Spike進(jìn)行聚類分析，如圖4B所示，分離出各自單元（Unit）動(dòng)作電位發(fā)放序列柵格圖及其波形。Ch.4檢測到了兩種單元?jiǎng)幼麟娢活愋?，Ch.4Ua和Ch.4Ub。Ch.9檢測到了一種單元?jiǎng)幼麟娢活愋虲h.9Ua。Ch.4Ua具有和去極化電位相當(dāng)?shù)某瑯O化電位，而Ch.4Ub和Ch.9Ua超極化幅值小，時(shí)程長。通過多巴胺濃度與動(dòng)作電位柵格圖同步變化可以看出，Ch.4Ua在刺激后多巴胺濃度高于正常水平時(shí)，放電密集，而Ch.4Ub和Ch.9Ua在多巴胺濃度開始上升時(shí)放電密集。

嚙齒類動(dòng)物紋狀體中，有超過95%神經(jīng)元為中等多棘神經(jīng)元 （Medium spiny neurons， MSNs），剩下的3%～5%紋狀體神經(jīng)元包括膽堿能中間神經(jīng)元和幾種γ氨基丁酸（GABA）釋放中間神經(jīng)元＼[16＼]。這些中間神經(jīng)元數(shù)量上很少，但它們會(huì)產(chǎn)生不與其數(shù)量成比例的重要影響＼[24＼]，能夠調(diào)控多棘神經(jīng)元的興奮性。紋狀體信息的整合依靠MSNs。根據(jù)參考文獻(xiàn)＼[25＼]報(bào)道的波形特征，可以判斷出Ch.4Ua為中等多棘神經(jīng)元，Ch.4Ub和Ch.9Ua為中間神經(jīng)元。丘腦底核電刺激后，在細(xì)胞外多巴胺濃度開始上升時(shí)，中間神經(jīng)元放電頻繁，持續(xù)約20 s。而MSNs在電刺激引起多巴胺濃度開始上升到回落至正常水平的過程中，放電活動(dòng)持續(xù)頻繁。

4結(jié) 論

本研究制備了一種基于MEMS工藝的植入式微納電極陣列探針，用于細(xì)胞外DA含量和動(dòng)作電位的原位雙模同步檢測。電極表面Pt/RGO/Nafion修飾有利于提高DA及電生理檢測的信噪比和選擇性。MEA電化學(xué)位點(diǎn)對(duì)代表性干擾物尿酸、抗壞血酸和五羥色胺具有良好的抗干擾性。多巴胺體外標(biāo)定結(jié)果表明，在多巴胺濃度為 0.01～110 μmol/L范圍內(nèi)，靈敏度為13.4 μA/mol/L，線性相關(guān)系數(shù)為0.999。此探針植入大鼠紋狀體后，成功記錄到了丘腦底核電刺激下多巴胺釋放和電生理信號(hào)同步變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為揭示丘腦底核電刺激的作用機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，所制備MEA在神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

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