斯金平+王琦+劉仲健+劉京晶+羅毅波

[摘要] 針對(duì)鐵皮石斛繁殖難、種植難、產(chǎn)品單一等產(chǎn)業(yè)發(fā)展重大問題，通過鐵皮石斛基因組學(xué)研究，明確鐵皮石斛為二倍體、有38條染色體、28 910個(gè)蛋白編碼基因及在轉(zhuǎn)錄組水平上的器官基因表達(dá)特異性，具有大量種子而種子沒有胚乳、廣泛生態(tài)適應(yīng)性、多糖合成的基因調(diào)控機(jī)制，為鐵皮石斛遺傳工程育種和活性藥用成分的開發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)；攻克了結(jié)實(shí)難、發(fā)芽難等繁育難題，建立了組培快繁體系，實(shí)現(xiàn)種苗工廠化生產(chǎn)，奠定了鐵皮石斛人工種植基礎(chǔ)；建立了鐵皮石斛育種體系，明確了重要經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳變異規(guī)律，育成鐵皮石斛系列專用品種（品系），解決了實(shí)生后代分離嚴(yán)重問題，支撐鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)升級(jí)；揭示了目標(biāo)化合物動(dòng)態(tài)變化規(guī)律、養(yǎng)分吸收機(jī)制，突破了栽培基質(zhì)、光調(diào)控、精準(zhǔn)采收等關(guān)鍵技術(shù)，建立了設(shè)施栽培、活樹附生、巖壁附生、立體栽培、盆栽等系列栽培模式，實(shí)現(xiàn)種出鐵皮石斛、種出好的鐵皮石斛。

[關(guān)鍵詞] 鐵皮石斛； 基因組學(xué)； 品種選育； 種苗繁育； 栽培模式

[Abstract] In view of the significant difficulties of propagation， planting and simple product in Dendrobium catenatum（D. officinale）industry development， a series of research were carried out. Genome study showed that D. catenatum is a specie of diploid with 38 chromosomes and 28 910 protein-coding genes. It was identified that specific genes accumulated in different organs at the transcriptome level. We got an insight into the gene regulation mechanism of the loss of the endospermous seed， the wide ecological adaptability and the synthesis of polysaccharides， which provided a theoretical basis for genetic engineering breeding and development and utilization of active pharmaceutical ingredients. The rapid propagation system was established for applying to industrialized production by overcoming breeding problems on seed setting and sprouting， which laid a foundation for artificial cultivation of D. catenatum. And in order to give a clear explanation of genetic variation of important economic traits， we built up the breeding system. Since special varieties of D. catenatum were bred， it helped solve the problem of trait segregation of seedling progeny and support the improvement of D. catenatum industry. The regulation of dynamic variation of target compounds， together with the mechanism of nutrient uptake， was revealed. The breakthrough of key technologies including culture substrates， light regulation and precisely collection was carried out. Several cultivation modes like facility cultivation， original ecological cultivation， cliff epiphytic cultivation， stereoscopic cultivation and potting cultivation were set up. Above all， the goal of cultivating D. catenatum as well as producing good D. catenatum will be achieved.

[Key words] Dendrobium catenatum （D. officinale）； genome； variety improvement； breeding； cultivation modes

鐵皮石斛Dendrobium catenatum（D. officinale）[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，歷代本草均有記載，具有益胃生津、滋陰清熱、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤等獨(dú)特功效 [2]。因繁殖與種植等重大難題，長期以來主要利用野生資源，導(dǎo)致資源枯竭而列為國家保護(hù)中藥材，并制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展[3]。20世紀(jì)90年代以來，逐一解決了鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵科學(xué)技術(shù)問題，形成系列原創(chuàng)性成果，使鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)從無到有，并形成百億級(jí)產(chǎn)業(yè)。為了促進(jìn)成果轉(zhuǎn)化，本文以作者研究為基礎(chǔ)就該領(lǐng)域相關(guān)研究進(jìn)行總結(jié)。

1 鐵皮石斛基因組學(xué)取得突破 為鐵皮石斛深入的分子和功能研究提供了基礎(chǔ)

鐵皮石斛全基因組測序研究結(jié)果表明[4]，鐵皮石斛為二倍體，有38條染色體，及28 910個(gè)蛋白編碼基因。研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛與蝴蝶蘭一起分享了在K/T線附近發(fā)生的蘭科植物全基因復(fù)制事件而躲過了大滅絕。鐵皮石斛與蝴蝶蘭擁有幾乎相同基因數(shù)量，但是鐵皮石斛由于TPS，R和HSP等基因家族大量擴(kuò)張，使鐵皮石斛具有極強(qiáng)應(yīng)對(duì)逆境的能力和防止病原物侵害的免疫能力，可在高溫、寒冷、高濕或干旱的環(huán)境中生長，形成了能在樹上和巖石上附生的特性而分布于溫帶、亞熱帶甚至熱帶的廣大地區(qū)，從而揭示了其廣泛的生態(tài)適應(yīng)性的基因調(diào)控機(jī)制；發(fā)現(xiàn)涉及鐵皮石斛多糖代謝通路及其多糖合成環(huán)節(jié)中關(guān)鍵基因的擴(kuò)增現(xiàn)象，揭示了鐵皮石斛產(chǎn)生大量多糖和莖干變得肥大的分子機(jī)制，為人工合成藥用多糖提供分子基礎(chǔ)；發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛MADS-box基因家族中參與植物生長發(fā)育調(diào)控的基因家族ANR1，StMADS11，MIKC* 3個(gè)分支出現(xiàn)擴(kuò)張，從而揭示石斛屬植物形態(tài)具有高度多樣性的分子調(diào)控機(jī)制，而MADS-box Ⅰ類基因家族成員發(fā)生了丟失，致使鐵皮石斛具有許多種子而種子沒有胚乳是鐵皮石斛自然繁殖困難的主要原因。研究團(tuán)隊(duì)還開展了鐵皮石斛遺傳多樣性及抗寒基因、多糖合成酶基因的篩選[5-12]。

Meng Yijun等[13]結(jié)合RNA，sRNA和降解組測序進(jìn)行了鐵皮石斛轉(zhuǎn)錄組水平上的器官基因表達(dá)特異性研究，從鐵皮石斛的花、根、葉和莖4個(gè)器官的RNA測序結(jié)果中得到536 558個(gè)轉(zhuǎn)錄本組裝序列，其中有2 645，256，42，54個(gè)轉(zhuǎn)錄本分別在花、根、葉和莖4個(gè)器官中高表達(dá)?；趕RNA測序，發(fā)現(xiàn)有2 038，2，21，24個(gè)sRNA分別在花、根、葉和莖特異性富集。同時(shí)，在sRNA測序過程中還檢測到1 047個(gè)成熟的候選miRNA?；趯?duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測和測序，從測序轉(zhuǎn)錄本中鑒定到數(shù)十個(gè)潛在miRNA前體。有趣的是，有2條sRNA前體中的長莖結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)與不同階段的降解組處理結(jié)果相關(guān)聯(lián)。對(duì)1 047個(gè)候選miRNA開展靶基因識(shí)別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1 257個(gè)配對(duì)組合。在此基礎(chǔ)上，建立了一些包括激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、發(fā)育、次生代謝和Argonaute1蛋白調(diào)控相關(guān)的生物學(xué)子網(wǎng)絡(luò)，研究結(jié)果為鐵皮石斛進(jìn)行深入的分子和功能研究提供了寶貴資源。

針對(duì)鐵皮石斛主要活性成分多糖，Zhang等[14]通過轉(zhuǎn)錄組測序與分析，構(gòu)建了鐵皮石斛幼年和成年植株的了2個(gè)cDNA文庫Dendrobium-1和Dendrobium-2，確定了鐵皮石斛中果糖和甘露糖的代謝途徑及參與其中的135個(gè)基因，篩選鑒定了430個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶、89個(gè)纖維素合成酶基因和627個(gè)參與鐵皮石斛次生代謝的轉(zhuǎn)錄因子，其中37個(gè)差異表達(dá)的纖維素合成酶基因在鐵皮石斛的甘露聚糖合成中起著重要作用。研究成果豐富了鐵皮石斛轉(zhuǎn)錄組信息，并為分離鑒定參與多糖生物合成的候選基因及闡明多糖生物合成機(jī)制提供有價(jià)值的參考。

2 攻克鐵皮石斛種苗繁育難題 實(shí)現(xiàn)種苗低碳生產(chǎn)

研究發(fā)現(xiàn)了鐵皮石斛自交不育、花粉黏性低與高活力期短、花結(jié)構(gòu)特殊等自然結(jié)果率低的主要原因；在開花后第25天人工控制授粉，結(jié)實(shí)率達(dá)到82.6%，10月下旬至11月初果實(shí)成熟，每個(gè)蒴果有效種子達(dá)5 000粒以上[15]。

通過基本培養(yǎng)基（MS，KC，N6，B5，SH）、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)（細(xì)胞分裂素、生長素）、天然附加物（馬鈴薯、香蕉、蘋果）、微量元素、pH等關(guān)鍵因素綜合調(diào)控，篩選出1/2MS培養(yǎng)基為種子萌發(fā)、原球莖分化和試管苗生根的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，MS與改良MS培養(yǎng)基為原球莖增殖和壯苗培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；6-BA 0.5～1.0 mg·L^-1+NAA 1.0 mg·L^-1+KT 1.0 mg·L^-1等植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的組合有效原球莖增殖倍數(shù)為11.7；6-BA 2.0～3.0 mg·L^-1+NAA 0.5～1.0 mg·L^-1+KT 1.0 mg·L^-1組合原球莖芽分化率達(dá)90%以上。種子、莖段、葉片、根尖等外植體均建立了組培快繁體系，并實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)[16-18]。

通過光強(qiáng)、光周期、光質(zhì)的研究，發(fā)現(xiàn)14 h光照（光照強(qiáng)度10～30 μmol·m^-2·s^-1）、10 h暗培養(yǎng)交替是種子萌發(fā)的理想條件，16 h光照（光照強(qiáng)度30～50 μmol·m^-2·s^-1）、8 h暗培養(yǎng)交替是原球莖分化與生根壯苗培養(yǎng)條件；白光有利于叢芽萌發(fā)，紅藍(lán)混光有利于幼苗生長。綜合利用優(yōu)化的培養(yǎng)基與日光燈、自然光結(jié)合的組培專用光源系統(tǒng)，有效地解決了鐵皮石斛發(fā)芽難、幼苗生長慢、能耗大等問題，鐵皮石斛從種子到生根成苗僅需150～180 d，種苗培育期縮短30～60 d，能耗降低70%，空間利用率提高30%[17-20]。

3 建立鐵皮石斛育種體系 實(shí)現(xiàn)栽培品種化

因歷代本草都強(qiáng)調(diào)產(chǎn)地的作用，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載“藥有……土地所出，真?zhèn)侮愋隆?；孫思邈《千金翼方》中強(qiáng)調(diào)“藥出州土”，直至20世紀(jì)90年，我國藥用植物育種工作仍處于起步階段。國際上，藥用植物育種起步也很晚，1996年在德國召開了第一次藥用和芳香植物育種研究國際會(huì)議。通過全面分析鐵皮石斛種質(zhì)、入藥部位、生長年限、采收季節(jié)、外觀形態(tài)與標(biāo)志性成分的關(guān)系，揭示其有效成分的時(shí)空變異規(guī)律，明確傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)的藥材質(zhì)量差異并非完全由當(dāng)?shù)氐臍夂?、土壤等環(huán)境因素作用于植物當(dāng)代，而是這種環(huán)境因素已使藥材群體產(chǎn)生遺傳分化，形成了有遺傳差異的地理種源，種質(zhì)（品種）類型決定了藥材的質(zhì)量?；阼F皮石斛分布廣、遺傳多樣性豐富，藥材安全性要求高的特點(diǎn)，提出了“全分布區(qū)種質(zhì)資源搜集—農(nóng)藝性狀、功效成分、功能基因系統(tǒng)評(píng)價(jià)—種內(nèi)雜交與分子輔助育種結(jié)合—選育專用化品種（無性系、家系）”的鐵皮石斛品種選育新方法[21]。

收集了全國主產(chǎn)區(qū)鐵皮石斛種質(zhì)資源305份，完成遺傳多樣性分析，子代多糖、甘露糖等主要活性成分定量測定，植株高度、粗度、萌蘗能力、抗寒性、抗病蟲害能力等農(nóng)藝性狀的差異性檢測與評(píng)價(jià)，分子標(biāo)記遺傳多態(tài)性達(dá)到95.3%[22]，多糖量變幅22.6%～57.0%，浸出物量3.5%～26.2%，耐低溫-14.8～0 ℃；在育種親本差異檢測與篩選的基礎(chǔ)上，選擇互補(bǔ)性強(qiáng)的親本進(jìn)行種內(nèi)雜交，創(chuàng)制出新種質(zhì)360份，建立了多樣的鐵皮石斛種質(zhì)資源庫。

品種專用化包括用途（功效）的專用化，用法的專用化，栽培條件的專用化。如用于加工提高免疫功能的沖劑的鐵皮石斛要求提高免疫功能強(qiáng)、高產(chǎn)，對(duì)外觀的要求沒有必要；用于加工楓斗的不僅要求優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)，還要求莖的粗細(xì)適中；用于鮮食的除了質(zhì)量、產(chǎn)量因素外，還要求化渣性好、口感好；用于原生態(tài)栽培的，必須具有很好的適應(yīng)環(huán)境能力，如抗低溫與高溫能力、干旱與水濕能力、病害與蟲害能力、高光效與高肥效特點(diǎn)。根據(jù)鐵皮石斛生物特性，基于綠色生產(chǎn)、品種專用化、種內(nèi)雜交與分子標(biāo)記輔助育種結(jié)合的品種選育新方法和有性制種無性擴(kuò)繁的策略，解決了實(shí)生后代表型與功效成分含量性狀分離嚴(yán)重問題[21]，經(jīng)子代測定[23-25]選育出質(zhì)量、產(chǎn)量、抗逆能力、農(nóng)藝性狀等方面特異性明顯、遺傳穩(wěn)定、一致性好的“森山1號(hào)”、“晶品1號(hào)”2個(gè)品種和“晶品966”、“晶品6A2B”、“晶品天目山”等優(yōu)良品系，其中“森山1號(hào)”系國內(nèi)首批符合《中國藥典》質(zhì)量要求的鐵皮石斛品種，多糖量達(dá)32.11%；“晶品1號(hào)”系國內(nèi)首個(gè)通過種內(nèi)雜交選育的鐵皮石斛良種，多糖、浸出物量分別達(dá)到46.1%，11.3%，超過2015年版《中國藥典》的84.4%，73.8%，增產(chǎn)61.3%，適合野外生態(tài)栽培，2015年特大寒潮中，浙江義烏以南海拔300 m以下區(qū)域-9 ℃均能正常越冬；“晶品天目山”品系經(jīng)歷了2015年寒潮（-14.8 ℃），生長仍然正常，為近野生栽培提供了保障。

4 突破鐵皮石斛栽培關(guān)鍵技術(shù) 建立系列栽培模式

通過基質(zhì)、光照、水分、通氣、溫度等關(guān)鍵因素與鐵皮石斛生長發(fā)育關(guān)系的研究，篩選出鐵皮石斛栽培最佳基質(zhì)——松樹皮，從種植難成活提高到成活率98.0%，實(shí)現(xiàn)種出鐵皮石斛[17-18]；揭示了鐵皮石斛多糖、浸出物等功效成分的時(shí)空變異規(guī)律，其中多糖含量及其組成與開花密切相關(guān)，開花顯著消耗鐵皮石斛藥材中的多糖及其甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖的量，而開花過程可能有利于木糖、阿拉伯糖的積累；醇溶性浸出物含量與新芽形成、萌動(dòng)密切相關(guān)，新芽萌動(dòng)醇溶性浸出物迅速下降。根據(jù)鐵皮石斛多糖與醇溶性浸出物含量、產(chǎn)量的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，提出精準(zhǔn)采收技術(shù)：改種植后4年全草采收為萌條二年生3月底至開花前采收，生命周期產(chǎn)量提高1倍，多糖含量提高30%[26-30]。對(duì)鐵皮石斛氨基酸，總生物堿，以及鉀、鈣、鎂、錳、鋅、鉻、銅、砷、汞、鉛、鎘等金屬元素分析表明，均與種質(zhì)與采收時(shí)機(jī)密切相關(guān)[31-34]。從鐵皮石斛分離鑒定出2 816個(gè)菌株，歸屬3門7綱22目43科57屬，初步研究表明，內(nèi)生真菌與鐵皮石斛生長與品質(zhì)形成密切相關(guān)，其中DO14菌株與鐵皮石斛種苗共培養(yǎng)，提高生長量5.6%，總多糖量113.7%，甘露糖42.2%，并從其代謝產(chǎn)物中分離到具有抗腫瘤和抗真菌活性的2個(gè)新化合物[35-36]。

通過鐵皮石斛營養(yǎng)特性、種植季節(jié)、光照與水分調(diào)控等關(guān)鍵技術(shù)研究，在栽培技術(shù)創(chuàng)新的基礎(chǔ)上，建立了設(shè)施栽培模式[37]，遮陽率70%、松樹皮為基質(zhì)、3—5月或9—10月種植、3～5株叢栽、2.5萬叢/畝（1畝≈667 m2），生長季節(jié)每天噴水1～2 h；活樹附生栽培模式[37-38]，以自然生長的樹木作為載體，50%左右郁閉度、3—5月栽培、露根捆綁1～1.5年生種苗、每天噴水1 h、軟體動(dòng)物防治，栽培過程不施肥料、不用農(nóng)藥；巖壁栽培模式[39-40]，以垂直崖壁為載體，栽培過程不施肥料、不用農(nóng)藥，并使鐵皮石斛回歸自然，種植成本更低、藥材質(zhì)量更優(yōu)，其中一年生懸崖栽培鐵皮石斛多糖與醇溶性浸出物含量分別高于設(shè)施基質(zhì)栽培9.2%，2.6%，二年生分別高6.7%，5.3%；立體種植模式[41]，以人工立柱或立木為載體的土地利用率提高2～3倍，基質(zhì)利用率提高30%，單位面積產(chǎn)量提高50%以上；集成鐵皮石斛栽培關(guān)鍵技術(shù)，制定了國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《鐵皮石斛栽培技術(shù)規(guī)程》。

5 產(chǎn)業(yè)升級(jí)研發(fā)重點(diǎn)

5.1 利用鐵皮石斛基因組學(xué)開展鐵皮石斛遺傳工程育種和活性藥用成分的開發(fā)利用 我國鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)近年來快速發(fā)展，形成了龐大的產(chǎn)業(yè)鏈，年產(chǎn)值高達(dá)130多億元，但在產(chǎn)業(yè)發(fā)展過程中存在種源混雜、偽劣產(chǎn)品充斥市場、產(chǎn)品功效機(jī)制不清等制約鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)的健康和持續(xù)發(fā)展問題。因此，充分利用鐵皮石斛全基因組圖譜，挖掘鐵皮石斛重要功能基因，開展鐵皮石斛分子標(biāo)記輔助育種；利用鐵皮石斛多糖與小分子化合物的基因調(diào)控機(jī)制，開發(fā)治療糖尿病及其并發(fā)癥、抗憂郁癥、抗衰老、提高記憶力和治療阿爾茨海默氏病等新藥；利用物種適應(yīng)性機(jī)制，研究如何提高人體免疫力的機(jī)理，開發(fā)保健產(chǎn)品；利用鐵皮石斛特異基因，開展物種保護(hù)和品質(zhì)鑒定，對(duì)產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)具有重要價(jià)值。

5.2 從劑型多樣化向功效多樣化轉(zhuǎn)變 鐵皮石斛產(chǎn)品已經(jīng)實(shí)現(xiàn)沖劑、膠囊、片劑、浸膏、口服液、飲料等等多種劑型，但開發(fā)的功效主要是“增強(qiáng)免疫力”“抗疲勞”，而且機(jī)制不清，其他有助于降低血脂、降低血糖、改善睡眠、抗氧化、緩解體力疲勞、清咽、降低酒精性肝損傷危害等功效遠(yuǎn)未得到開發(fā)。研究團(tuán)隊(duì)初步發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛內(nèi)含有的多糖成分在治療糖尿病方面，能起到維持胰島素平衡，對(duì)糖尿病、肝纖維化等具有明顯效果；其含有的小分子化合物對(duì)于老年癡呆癥具有顯著治療效果，擁有延長壽命的功能，開發(fā)潛力巨大。

5.3 鐵皮石斛栽培技術(shù)轉(zhuǎn)型升級(jí) 目前90%以上的藥材來源于設(shè)施基質(zhì)栽培，存在土地資源制約，投入大，藥材功效不如野生等問題；以軟體動(dòng)物為主的鐵皮石斛病蟲害，每年成災(zāi)面積占栽培面積的50%以上，絕收10%以上，年損失數(shù)億元；占鐵皮石斛生物量50%以上的葉、花，有較好的功效，但既不能當(dāng)食品、也不能當(dāng)藥材，存在嚴(yán)重浪費(fèi)。因此，研究鐵皮石斛近野生栽培技術(shù)，包括森林生態(tài)對(duì)近野生栽培鐵皮石斛產(chǎn)量與品質(zhì)的影響規(guī)律，明確栽培環(huán)境、內(nèi)生真菌、養(yǎng)分來源與吸收機(jī)制；研究鐵皮石斛軟體動(dòng)物綜合防控技術(shù)，調(diào)查鐵皮石斛主要有害生物，揭示其發(fā)生規(guī)律，提出綜合防控技術(shù)；研究鐵皮石斛資源綜合利用，包括開展鐵皮石斛葉和花功效與安全性評(píng)價(jià)，開發(fā)以鐵皮石斛葉或花為原料的新資源食品，提高鐵皮石斛綜合利用率，對(duì)鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)至關(guān)重要。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]